枯草芽孢桿菌21代謝物對(duì)大豆茄鐮孢菌的抑菌機(jī)制

林志偉　肖亞靜　郭春蘭等

摘要：采用顯微觀察與電導(dǎo)率測定相結(jié)合的方法，研究枯草芽孢桿菌21代謝物對(duì)大豆茄鐮孢菌的抑菌作用與抑制機(jī)理。結(jié)果表明：該菌株的無菌代謝物對(duì)茄鐮孢菌菌絲生長及孢子萌發(fā)均有抑制作用，當(dāng)發(fā)酵液的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到90%時(shí)，對(duì)病菌孢子萌發(fā)的抑制率可達(dá)99%；顯微觀察可發(fā)現(xiàn)孢子畸形、頂端囊泡出現(xiàn)、芽管伸長受抑等現(xiàn)象；經(jīng)無菌發(fā)酵液處理后，菌片的電導(dǎo)率改變，顯示出膜透性的改變。

關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌；代謝物；茄鐮孢菌；抑菌

中圖分類號(hào)： S435.651文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0175-03

收稿日期：2015-03-26

基金項(xiàng)目：黑龍江省教育廳產(chǎn)業(yè)化培育項(xiàng)目 （編號(hào)：1254CGZH32）。

作者簡介：林志偉（1970—），男，黑龍江勃利人，碩士，副教授，主要從事植物病蟲害綜合防治技術(shù)研究。E-mail：408160466@qq.com。大豆根腐病是黑龍江省東北部大豆產(chǎn)區(qū)發(fā)生較嚴(yán)重的根部病害之一，該病害發(fā)生時(shí)可影響大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)，一般年份減產(chǎn)可達(dá)10%～30%，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)可達(dá)60%。引起大豆根腐病的病原菌有十多種，屬于鐮孢菌屬、絲核菌屬、腐霉屬和疫霉屬等，其中鐮刀菌、絲核菌的致病力較強(qiáng)，引起根腐病普遍發(fā)生[1-3]。

在根腐病的防治中以化學(xué)農(nóng)藥拌種為主，鑒于化學(xué)農(nóng)藥的生態(tài)效應(yīng)，生物防治不失為一種有效的防治手段，目前已報(bào)道有多種生防制劑對(duì)該病具有防治效果[4-12]。前期的研究證明枯草芽孢桿菌21 具有生物防治能力，為了更好地開發(fā)該菌株在生產(chǎn)中的應(yīng)用，本研究利用其代謝物對(duì)大豆根腐病菌茄鐮孢菌進(jìn)行抑菌研究。

1材料與方法

1.1材料

枯草芽孢桿菌21（Bacillus subtilis 21）、大豆根腐病菌茄鐮孢菌（Fusarium solani）均保存于黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)微生物與發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室。

大豆品種為綏農(nóng)29，由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)大豆栽培組惠贈(zèng)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的獲得將篩選出的枯草芽孢桿菌菌株轉(zhuǎn)接到配制好的牛肉膏蛋白胨斜面試管中，28 ℃活化20 h后，用接種環(huán)刮取1環(huán)菌體，接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)20 h左右。當(dāng)菌體D620 nm達(dá)到0.7左右時(shí)，按照3%接種量接菌到滅過菌的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)36 h，即為發(fā)酵好的枯草芽孢桿菌。發(fā)酵后的培養(yǎng)液先經(jīng)離心沉淀，然后去除菌體，在無菌條件下吸取發(fā)酵上清液，用孔徑大小為0.22 μm的微孔濾膜進(jìn)行過濾除菌，獲得拮抗無菌濾液。

1.2.2代謝物對(duì)茄鐮孢菌菌絲生長的抑制以茄鐮孢菌為指示菌，將病原真菌活化，待其長滿平板后，用直徑為5 mm的打孔器打成大小一致的菌碟，用接種針挑取菌碟分別接入PDA平板中，28 ℃恒溫培養(yǎng)1 d后，在距離菌碟3 cm處插入已滅菌的牛津杯，并向牛津杯內(nèi)注入相同體積的處理好的無菌濾液，每組重復(fù)3次，置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)4 d后測量抑菌圈半徑。

1.2.3不同濃度發(fā)酵液對(duì)植物病原菌孢子萌發(fā)的影響分別向含有0.1 mL的5.2×107個(gè)/mL的茄鐮孢菌分生孢子懸浮液中加入0.9、0.8、0.7、0.6、0.5 mL枯草芽孢桿菌發(fā)酵液，并用無菌水定容使其最終體系均為1 mL，即發(fā)酵液的體積分?jǐn)?shù)分別為90%、80%、70%、60%、50%；以未加發(fā)酵液的茄鐮孢菌分生孢子懸浮液作為空白對(duì)照，充分混勻后于28 ℃恒溫暗培養(yǎng)，當(dāng)空白對(duì)照的孢子萌發(fā)率達(dá)到90%以上時(shí)，調(diào)查各處理孢子萌發(fā)情況，每個(gè)載玻片觀察10個(gè)視野，共計(jì)300個(gè)孢子，孢子萌發(fā)形成的芽管長度大于孢子一半時(shí)視為萌發(fā)，計(jì)算不同濃度枯草芽孢桿菌發(fā)酵液處理的孢子萌發(fā)率，對(duì)發(fā)酵液作用下孢子萌發(fā)出現(xiàn)的畸形情況拍照記錄，相關(guān)計(jì)算公式如下：

孢子萌發(fā)率=（萌發(fā)的孢子/300）×100%；

抑制百分率=（空白對(duì)照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率）/空白對(duì)照孢子萌發(fā)率×100%。

1.2.4無菌發(fā)酵液處理對(duì)茄鐮孢菌電導(dǎo)率變化的影響用直徑為5 mm的打孔器在已活化好的鐮刀菌菌落同心環(huán)處打取菌碟，分別培養(yǎng)在直徑為9 cm的含有20 mL查氏培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，28 ℃恒溫暗培養(yǎng)4 d，待用。將培養(yǎng)好的鐮刀菌菌片用重蒸水沖洗5遍，真空抽濾吸干水分后，放入裝有無菌發(fā)酵液的100 mL三角瓶中浸漬，保證菌片完全浸沒在培養(yǎng)液中，每2 h取5個(gè)菌片，用重蒸水沖洗5次，保證菌片完好。將沖洗后的菌片放入有盛有35 mL無離子水的50 mL三角瓶中，即刻利用電導(dǎo)率儀測定電導(dǎo)率，之后靜置30 min，再次測定浸漬液的電導(dǎo)率，兩者差值可以反映出所測菌體在處理時(shí)間內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)容物滲出程度。以浸于清水中的菌片的電導(dǎo)率為對(duì)照。

2結(jié)果與分析

2.1代謝物對(duì)茄鐮孢菌菌絲生長的抑制

試驗(yàn)中證實(shí)：經(jīng)對(duì)峙培養(yǎng)后，枯草芽孢桿菌21對(duì)茄鐮刀菌的菌絲生長可以產(chǎn)生抑菌圈（圖1-a），抑菌圈直徑可達(dá)0.9 cm，因而進(jìn)一步進(jìn)行了該菌株代謝物的抑菌作用研究。測定結(jié)果表明：采用管碟法獲得的抑菌圈直徑可達(dá)0.7 cm（圖1-b），菌絲生長抑制率為83.4%。

2.2代謝物對(duì)茄鐮孢菌孢子萌發(fā)的影響

枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物主要為抗菌肽類及一些蛋白類拮抗物，對(duì)病原菌的孢子萌發(fā)及菌絲生長產(chǎn)生抑制作用。利用無菌代謝物處理病原菌孢子，通過定時(shí)觀察顯微鏡下孢子萌發(fā)情況發(fā)現(xiàn)：28 ℃黑暗恒溫培養(yǎng)8 h后，對(duì)照（清水處理）中茄鐮孢菌孢子萌發(fā)率可達(dá)到95%以上；而不同濃度代謝物處理茄鐮孢菌的分生孢子后，對(duì)鐮孢菌的孢子萌發(fā)均產(chǎn)生抑制作用，但不同濃度抑制程度不同，且隨著發(fā)酵液濃度的增加，孢子萌發(fā)率逐漸降低，即發(fā)酵液體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%時(shí)，鐮孢菌的孢子萌發(fā)率分別為67.0%、18.0%、7.0%、3.0%、0.7%，即當(dāng)發(fā)酵液的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到90%時(shí)，對(duì)病菌孢子萌發(fā)的抑制率可達(dá)99%（表1）；供試不同濃度的發(fā)酵液對(duì)孢子萌發(fā)都有強(qiáng)烈抑制作用，在顯微鏡下均可觀察到大量的畸變孢子及不萌發(fā)的孢子，畸變形態(tài)多樣，部分孢子頂端出現(xiàn)囊泡，部分孢子頂端膨大變形，部分孢子萌發(fā)長出了芽管，但芽管無法進(jìn)一步伸長（圖2-a）；而對(duì)照組孢子可正常萌芽并形成大量光滑修長的菌絲體（圖2-b）。

2.3枯草芽孢桿菌無菌代謝物處理茄鐮孢菌后菌體電導(dǎo)率的變化

電導(dǎo)率的變化可以衡量溶液中離子強(qiáng)度的大小，也在一定程度上反映細(xì)胞膜透性的改變。通過對(duì)浸泡不同時(shí)間鐮刀菌菌片電導(dǎo)率的測定發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照相比，經(jīng)無菌發(fā)酵液處理過的菌體浸漬液電導(dǎo)率變化趨勢與對(duì)照（水）處理的電導(dǎo)率變化不同，發(fā)酵液處理2～16 h內(nèi)的菌片浸漬液電導(dǎo)率均高于清水處理，且以處理10 h時(shí)電導(dǎo)率值最高，高出對(duì)照186%，隨后呈下降趨勢；當(dāng)發(fā)酵液處理18～28 h時(shí)，菌體浸漬液電導(dǎo)率值卻明顯低于對(duì)照，尤其是發(fā)酵液處理20～28 h時(shí)，電導(dǎo)率值相對(duì)平穩(wěn)（圖3）。從結(jié)果中可看出，隨著發(fā)酵液對(duì)菌體處理時(shí)間的延長，菌體的內(nèi)容物外滲作用增加，當(dāng)作用16 h后，菌體內(nèi)容物幾乎全部外滲；而在18 h后，發(fā)酵液處理的菌片電導(dǎo)率反而低于對(duì)照，這可能與清水處理菌片損傷程度較小有關(guān)，從清水對(duì)照處理不同時(shí)間電導(dǎo)率值變化較平穩(wěn)也能體現(xiàn)這一點(diǎn)。

3結(jié)論與討論

拮抗微生物在植物病害防治方面機(jī)理復(fù)雜，主要體現(xiàn)在空間和營養(yǎng)競爭、產(chǎn)生抗菌物質(zhì)與誘導(dǎo)植物抗病性等方面。

已有大量文獻(xiàn)報(bào)道了不同拮抗微生物的拮抗效果，其中拮抗細(xì)菌主要為芽孢桿菌，且主要的菌種為枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、蠟樣芽孢桿菌（B. cereus），多黏芽孢桿菌（B. polymyxa）、地衣芽孢桿菌（B. lincheniformis）、短小芽孢桿菌（B. pumilus）等，不同菌株對(duì)不同植物病原真菌表現(xiàn)出不同的抑制效果[4-7，13-22] 。試驗(yàn)選用的枯草芽孢桿菌21菌株對(duì)茄鐮孢菌的菌絲生長表現(xiàn)出明顯抑制作用，可作為潛在的生防菌株進(jìn)一步開發(fā)與應(yīng)用。

微生物的代謝產(chǎn)物種類多樣，是有效的殺菌成分，代謝物抑菌機(jī)理的探討也是目前生物防治研究的熱點(diǎn)之一。利用顯微觀察法研究真菌、細(xì)菌或放線菌代謝物的抑菌效果時(shí)，均觀察到了病原菌菌絲生長畸形或孢子萌發(fā)畸形的現(xiàn)象[21]。在對(duì)枯草芽孢桿菌21菌株無菌濾液抑菌研究中，也同樣觀察到了病原菌孢子畸形、無法正常萌發(fā)的現(xiàn)象，這一結(jié)果的獲得為該菌株的開發(fā)應(yīng)用提供有力支持。

真菌的細(xì)胞壁與細(xì)胞膜是調(diào)節(jié)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)闹匾?xì)胞器，一旦細(xì)胞壁與膜受到損傷后會(huì)有電解質(zhì)的滲漏，因而測定電解率的變化可以作為判斷膜損傷的依據(jù)之一。許多研究表明，作用于細(xì)胞膜的抗菌物都能促使電導(dǎo)率的增高[18，21]。本研究經(jīng)處理后的病原菌菌體浸液的電導(dǎo)率也出現(xiàn)增高的現(xiàn)象，且與對(duì)照相比電導(dǎo)率增高在處理2 h后即有明顯的表現(xiàn)，表明該菌株在真菌病害防治中具有重要潛力。

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