康海岐，申國(guó)安 , 楊金水 , 程在全

(1.中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所，云南 昆明 650204;2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，四川 成都 610066；3.復(fù)旦大學(xué)遺傳研究所，上海 200433)

早期曾經(jīng)從雜交水稻品種汕優(yōu)63的根葉抑制消減雜交(SSH)結(jié)果中鑒定出了一個(gè)EST序列，與Cohensin基因家族同源性較高,通過(guò)GeneBank查詢與序列拼接,設(shè)計(jì)特異性引物，克隆出了一個(gè)長(zhǎng)達(dá)3 230 bp的cDNA片段，測(cè)序后通過(guò)序列比對(duì)和理論預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該序列酷似水稻姊妹染色單體粘著蛋白，命名為OsRad21-i基因。其中包含一個(gè)開(kāi)放閱讀框ORF(3 166 bp)，編碼1 055個(gè)氨基酸；起始密碼子之前有67 bp的5′UTR區(qū)，終止密碼子之后有一段94 bp的3′UTR區(qū)。該基因由14個(gè)外顯子組成，位于水稻第1號(hào)染色體上154.6～154.9 cM之間,存在于水稻基因組AP003349和 AP003418兩個(gè)PAC 克隆上。OsRAD21-i蛋白的理論相對(duì)分子質(zhì)量約為115 300，等電點(diǎn)4.41。因此在GenBank首次登錄了屬于Rad21、Rec8/Scc1基因家族的第一個(gè)水稻基因序列，登錄號(hào)為AY318757。

進(jìn)一步理論分析表明，OsRad21-i的ORF序列中具有兩個(gè)保守區(qū): N-端1-120位氨基酸序列，含有KOG1213和pfam04825功能域，屬于姊妹染色單體粘著復(fù)合物Cohesin亞基RAD21/SCC1部分，為細(xì)胞分裂和染色體配對(duì)等細(xì)胞學(xué)過(guò)程中的關(guān)鍵成份之一。C端997-1050位的氨基酸序列，含有pfam04824功能域。pfam04825和pfam04824功能域均是RAD21/REC8類蛋白標(biāo)志性功能域，代表了真核生物粘著蛋白R(shí)AD21/REC8/SCC1家族特征性保守區(qū)。其主要作用在于有絲分裂和減數(shù)分裂中介導(dǎo)姊妹染色單體的粘著，是粘著復(fù)合物的一部分[3-6]。文獻(xiàn)報(bào)道了粳稻中同類基因的序列信息，但未從實(shí)驗(yàn)方面進(jìn)行驗(yàn)證[7]。

為了驗(yàn)證上述理論推測(cè)和下一步的蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)及功能研究，本文以克隆載體pGEM-T和原核表達(dá)載體pQE30及大腸桿菌M15菌株，進(jìn)行了OsRad21-i的原核表達(dá)嘗試。由于理論預(yù)測(cè)的OsRAD21-i蛋白相對(duì)分子質(zhì)量較大(大于100 000)，因此構(gòu)建有效的表達(dá)載體將是表達(dá)目的基因之前提條件，同時(shí)也是影響表達(dá)水平及蛋白活性的重要因素。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)中間載體pGEM-T，最終構(gòu)建出了該基因的重組表達(dá)載體，并在M15中誘導(dǎo)表達(dá)出了重組蛋白OsRAD21-i，與預(yù)期結(jié)果相符，也為表達(dá)大分子蛋白積累了重要經(jīng)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

LATaq.DNA聚合酶和普通TaqDNA聚合酶購(gòu)自Takara公司。反轉(zhuǎn)錄酶、DNA限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ，及T4 DNA連接酶等購(gòu)自NEB公司(New England Biolabs Ltd.，UK)。RNA提取試劑盒、DNA回收試劑盒購(gòu)自上海華舜生物工程有限公司(Watson，Shanghai)。DNA Marker(DL2000,HindⅢ等)、蛋白質(zhì)Marker購(gòu)自大連寶生物工程公司。PCR引物由上海生工生物工程公司合成?？敲顾?、氨芐青霉素、IPTG、X-gal等貯存液的配制和保存，質(zhì)粒抽提試劑配制，LB、LM、SOB和SOC等大腸桿菌培養(yǎng)基的配制均參考文獻(xiàn)[1]進(jìn)行，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

以克隆載體pGEM-T vector作為中間載體，其宿主菌為Dh5α；pQE30為表達(dá)載體，其宿主菌為M15。M15本身含有一種低拷貝抑制質(zhì)粒pREP-4，來(lái)源于pACYC質(zhì)粒，能與所有質(zhì)粒相容，賦予宿主菌kanr抗性，在25 μg/mL卡那霉素的選擇壓下則保持在E.coli菌株中。

取雜交水稻汕優(yōu)63的根組織，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于目的基因克隆。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 在OsRad21-i 的完整ORF兩端設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，上游引物Qef中引入了BamHⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物Qer中引入了SalⅠ 酶切位點(diǎn)，引物序列如下：

Qef： 5′ -CGGGATCCATGTTCTACTCGCAGTTCATCTTGG-3′

Qer: 5′-ATCCGTCGACCTAGAAATCTGACTTCAGGAGCTT-3′

1.2.2OsRad21-i完整ORF的擴(kuò)增 以汕優(yōu)63根組織的cDNA為模板，以Qef和Qer為引物，按如下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s, 64 ℃ 30 s, 72 ℃ 3 min，循環(huán)5次；94 ℃ 45 s, 62 ℃ 30 s, 72 ℃ 3 min，循環(huán)35次；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增出的片段命名為Eqfr。

1.2.3 表達(dá)載體構(gòu)建 利用T4 DNA Ligase將Eqfr和pGEM-T vector于4 ℃下進(jìn)行連接，取1 μL連接產(chǎn)物，稀釋10倍，然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，采用藍(lán)白斑法初篩，再進(jìn)行菌落PCR篩選，確定重組子DH5α[pGEM-T-Eqfr]。提取重組克隆載體pGEM-T-Eqfr，與表達(dá)載體pQE30分別同時(shí)進(jìn)行BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，電泳分離酶切后的Eqfr和線性化pQE30。

在4 ℃下按10 μL體系進(jìn)行16 h酶切產(chǎn)物連接反應(yīng)，取連接產(chǎn)物稀釋10倍，然后轉(zhuǎn)化M15感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含Ampr和Kanr兩種抗性的LB平板上，于37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。通過(guò)菌落PCR篩選目標(biāo)重組子M15[pQE30-Eqfr，pREP-4]，然后提取該重組子質(zhì)粒，以BamHⅠbuffer作為酶切buffer，通過(guò)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切方式進(jìn)行限制性消化，酶切鑒定可表達(dá)OsRad21-i基因的重組子。

1.2.4OsRad21-i基因在E.coliM15中的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE電泳檢測(cè) 挑取含重組表達(dá)質(zhì)粒M15[pQE30-Eqfr，pREP-4] 的單菌落和陽(yáng)性對(duì)照M15[pQE30，pREP-4]單菌落，分別接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL Amp和25 μg/mL Kan)；再將一個(gè)陰性對(duì)照M15[pREP-4]單菌落接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基(僅含25 μg/mL Kan)；于37 ℃恒溫?fù)u床以240 r/min的速度振蕩培養(yǎng)至A600達(dá)到0.3～0.6左右，一般約30 min；但誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間和溫度可根據(jù)實(shí)際情況(可溶性, 穩(wěn)定性和表達(dá)量)進(jìn)行調(diào)整。

從以上3種培養(yǎng)液中各取1 mL保存于4 ℃冰箱，然后加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)2～6 h，在不同時(shí)間段分別各取1 mL培養(yǎng)液保存于4 ℃冰箱。

樣品取完后，以6 000 r/min 離心10 min,收集菌體。加50 μL 雙蒸水和50 μL 2×樣品緩沖液(100 mmol/L Tris·HCl, pH8.0, 100 mmol/L DTT,w=4% SDS,w=0.2%溴酚藍(lán),w=20%甘油)重懸菌體，沸水中煮5 min后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

電泳參照Lammeli[2]的方法進(jìn)行，分離膠w為12%，濃縮膠w為3.9%，結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。所用試劑包括：w=30%聚丙烯酰胺母液、w=10%SDS、w=10%過(guò)硫酸銨、5×SDS電泳緩沖液、5×SDS樣品緩沖液、1.5 mol/L Tris·HCl (pH8.8)、裂解buffer、染色液、脫色液等配制方法和實(shí)驗(yàn)步驟參考文獻(xiàn)[1]。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

2.1.1OsRad21 -i ORF的克隆 以Qef和Qer為引物，從汕優(yōu)63根組織中擴(kuò)增出了OsRad21-i的完整ORF片段，命名為Eqfr，回收并檢測(cè)其濃度約為50 ng/μL。將Eqfr與pGEM-T的連接液轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選重組子，將11、14、32、33號(hào)等克隆用于下一步實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 載體pGEM-T-Eqfr和pQE30的酶切與回收 提取14、32和33號(hào)克隆的質(zhì)粒，分別命名為p14、p32和p33，用BamHⅠ和SalⅠ進(jìn)行限制性酶切，電泳分離后回收酶切片斷，酶切p32和p33質(zhì)量濃度均約為100 ng/μL。而p14酶切不完全,后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用p32和p33作為目標(biāo)表達(dá)基因的供體質(zhì)粒。pQE30被酶切成為線性化載體，電泳檢測(cè)其質(zhì)量濃度約為100 ng/μL。

2.1.3 目標(biāo)片斷與表達(dá)載體的連接 于4 ℃進(jìn)行酶切產(chǎn)物連接反應(yīng)16 h，體系構(gòu)成如下。

1 μL T4 DNA Ligase，1μL 10×Ligation buffer，2 μL酶切pQE30[102ng.μL-1]，酶切p32[102ng.μL-1]和酶切p33[102ng.μL-1]分別各6 μL，總體積10 μL。含p32片段的克隆編號(hào)為1n1-1n5，含p33片段的克隆編號(hào)為2n1-2n5。

2.1.4 含重組表達(dá)載體的克隆篩選 從LB(Ampr+Kanr)平板上獲得了編號(hào)為：1n1、1n2、1n3、1n4、1n5、2n1、2n2、2n3、2n4、2n5的M15[pQE30-Eqfr，pREP-4]重組克隆，連同對(duì)照M15[pQE30，pREP-4]一起提取其質(zhì)粒，PCR進(jìn)行鑒定(圖略)。選取編號(hào)為1n1、1n4、2n2、2n3的M15[pQE30-Eqfr，pREP-4]菌株抽提質(zhì)粒，分別命名為：p1n1，p1n4，p2n2，p2n3和pQE30，測(cè)其濃度分別約為：20 ng/μL、100 ng/μL、80 ng/μL、50 ng/μL和30 ng/μL。

2.1.5 M15[pQE30-Eqfr]菌株重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定 將p1n1、p1n4、p2n2、p2n3以限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ于37 ℃水浴中酶切過(guò)夜，結(jié)果如圖1。預(yù)期分析對(duì)照質(zhì)粒ck(pQE30+pREP-4)應(yīng)該被BamHⅠ和SalⅠ切成3條帶，包括3 461 bp(pQE30)、2 502 bp(pREP-4)和1 238 bp(pREP-4)；3個(gè)重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒應(yīng)該被切成4條帶，即除了對(duì)照質(zhì)粒的3條帶外，還應(yīng)包括一個(gè)3 166 bp (OsRad21-i)帶。圖1a中，p1n1和p2n3被完全酶切，p2n3的酶切帶型符合預(yù)期，電泳分離p1n1的酶切產(chǎn)物未完全分開(kāi)；p1n4和p2n2有少量質(zhì)粒未酶切完全外，其酶切帶型符合預(yù)期結(jié)果。因此表明這4個(gè)質(zhì)粒的酶切帶型基本符合預(yù)期結(jié)果，但酶切體系需要進(jìn)一步優(yōu)化。

重新優(yōu)化酶切體系(表1)，對(duì)質(zhì)粒p1n1,p1n4,p2n2以及對(duì)照質(zhì)粒ck(pQE30+pREP-4)進(jìn)行雙酶切試驗(yàn)，結(jié)果如圖1b。p1n1已經(jīng)基本酶切完全；除少量未完全酶切外(即6.6 kb帶)，p1n4和p2n2大部分已經(jīng)酶切完全；3個(gè)重組質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒的酶切帶型與預(yù)期帶型一致，結(jié)果正確。表明p1n1、p1n4、p2n2中含有正確的重組pQE30-Eqfr表達(dá)質(zhì)粒,而且保持了原M15菌株中的擬制質(zhì)粒pREP-4。

表1 質(zhì)粒p1n1、p1n4、p2n3、p2n4以及ck的雙酶切體系

圖1 M15[pQE30-Eqfr, pREP-4]菌株1n1、1n4、2n2和2n3中雙質(zhì)粒雙酶切及體系優(yōu)化結(jié)果

2.2 OsRad21-i基因在M15中的表達(dá)

以M15[pREP-4]為陰性對(duì)照，以M15[pQE30，pREP-4]為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)重組克隆M15[pQE30-Eqfr，pREP-4]菌株進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h，培養(yǎng)液中出現(xiàn)了相對(duì)分子質(zhì)量約為116 000的重組蛋白，而陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照中均無(wú)相應(yīng)蛋白出現(xiàn)(圖2)。說(shuō)明OsRad21-i基因在M15中得到了異源表達(dá)。進(jìn)一步觀察該重組克隆在不同時(shí)間段的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入IPTG后0.5 h就有重組蛋白出現(xiàn)，但表達(dá)量較低，而后1～3 h表達(dá)量較高，4 h后表達(dá)量開(kāi)始下降(圖3)。

3 討 論

3.1 OsRad21-i基因表達(dá)載體的酶切鑒定

本文構(gòu)建的表達(dá)載體中，OsRad21-i基因ORF雖與載體大小相近，均在3 kb以上，但重組表達(dá)質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中可以穩(wěn)定存在。對(duì)p1n1、p1n4、p2n2的2次雙質(zhì)粒雙酶切試驗(yàn)表明,質(zhì)粒質(zhì)量數(shù)對(duì)酶切效果有較大影響，確定合適的量有利于完全酶切和結(jié)果確證。在BamHⅠ和SalⅠ各0.5 μL的情況下(相當(dāng)于各10個(gè)活力單位酶量),37 ℃酶切過(guò)夜(16 h)可完全消化50 ng p1n1和120 ng ck的質(zhì)粒DNA, 250 ng p1n4和160 ng p2n2則未被完全消化?？梢?jiàn)50～100 ng質(zhì)粒在37 ℃、16 h條件下可以被完全消化，若多于100 ng,除酶切不完全外,還可能出現(xiàn)非特異性切割。

圖2 重組克隆M15[pQE30-Eqfr, pREP-4]與對(duì)照M15 [pREP-4]及M15[pQE30, pREP-4]的誘導(dǎo)表達(dá)

圖3 重組克隆M15[pQE30-Eqfr, pREP-4]在不同時(shí)間段的表達(dá)

3.2 重組OsRAD21-i蛋白的原核表達(dá)

本文結(jié)果表明，OsRad21-i基因能夠以pQE30載體在大腸桿菌M15菌株中異源表達(dá)。預(yù)測(cè)OsRAD21-i的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為115 300，加上6×His的相對(duì)分子質(zhì)量約600,與實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的重組蛋白相對(duì)分子質(zhì)量基本一致。另外，該基因在M15中的表達(dá)具有時(shí)效性特點(diǎn)，在1～3 h里表達(dá)量較高，4 h后重組蛋白表達(dá)量開(kāi)始下降。這可能是目的基因在宿主細(xì)胞體內(nèi)過(guò)分表達(dá)對(duì)宿主造成了顯著影響，引起了相關(guān)的細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)以致影響重組蛋白的穩(wěn)定性，導(dǎo)致了重組蛋白開(kāi)始被降解。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要對(duì)該表達(dá)體系進(jìn)行優(yōu)化。可以考慮對(duì)目的蛋白進(jìn)行修飾，轉(zhuǎn)變?yōu)榘麅?nèi)不溶性蛋白質(zhì)，如包涵體，或選用帶有溫度敏感型突變菌體作為宿主菌，或者借助于融合(標(biāo)簽)表達(dá)、亞細(xì)胞靶向定位等來(lái)提高表達(dá)有效性、可溶性和穩(wěn)定性等問(wèn)題。另外，也可以考慮發(fā)酵條件優(yōu)化，比如誘導(dǎo)物濃度，誘導(dǎo)溫度、時(shí)間及A600值等，培養(yǎng)基類型及其組分，培養(yǎng)溫度和時(shí)間等。

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