分子標(biāo)記發(fā)展簡(jiǎn)史

周宇爝

摘要比較詳細(xì)地介紹了分子標(biāo)記的概念、理論基礎(chǔ)和目前常用的分子標(biāo)記的的發(fā)展過(guò)程和技術(shù)特點(diǎn)。

關(guān)鍵詞分子標(biāo)記;概念;基本原理;特點(diǎn)

中圖分類(lèi)號(hào)Q78文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào) 1007-5739(2009)11-0264-07

隨著人們對(duì)生命認(rèn)識(shí)的不斷加深以及遺傳學(xué)的不斷深入發(fā)展,越來(lái)越多的遺傳標(biāo)記被發(fā)現(xiàn),遺傳標(biāo)記的種類(lèi)和數(shù)量越來(lái)越多。主要分為4種類(lèi)型,即形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記和DNA分子標(biāo)記。顯然,前3種標(biāo)記都是以基因表達(dá)的結(jié)果(表現(xiàn)型)為基礎(chǔ),是對(duì)基因的間接反映;而DNA分子標(biāo)記則是DNA水平遺傳變異的直接反映。與表型標(biāo)記相比,DNA分子標(biāo)記具有能對(duì)各發(fā)育時(shí)期的個(gè)體、各個(gè)組織、器官甚至細(xì)胞作檢測(cè),既不受環(huán)境的影響,也不受基因表達(dá)與否的限制,數(shù)量豐富,遺傳穩(wěn)定,對(duì)生物體的影響表現(xiàn)“中性”以及操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。分子標(biāo)記的所有這些特性,奠定了它具有廣泛應(yīng)用性的基礎(chǔ)[1-2]。

1分子標(biāo)記的來(lái)源及定義

1.1分子標(biāo)記的來(lái)源

“標(biāo)記”一詞,根據(jù)漢語(yǔ)大詞典的解釋,是“便于識(shí)別的標(biāo)識(shí)或者記號(hào)”。隨著人們對(duì)生命本質(zhì)認(rèn)識(shí)的一步步加深,在人們研究DNA序列時(shí)發(fā)現(xiàn)了大量的非編碼序列,甚至占到了全序列的90%以上。這些非編碼序列具有特殊的一級(jí)結(jié)構(gòu),如串聯(lián)重復(fù)、回文結(jié)構(gòu)、Alu序列(反向重復(fù)序列)、CpG島等,并且全基因組分布[3]。隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的人類(lèi)基因組框架草圖的完成和一個(gè)個(gè)模式生物的全基因組測(cè)序,一個(gè)個(gè)新的DNA特異序列被發(fā)現(xiàn)并且在染色體上定位,整個(gè)基因組內(nèi)的標(biāo)記密度越來(lái)越高,并且大量的特異序列與不同的基因片段有著不同程度的連鎖,所有這些標(biāo)記構(gòu)成了人類(lèi)研究探索各種生物基因組DNA的地圖與路標(biāo)。

1.2分子標(biāo)記的定義

廣義的分子標(biāo)記指可遺傳并可檢測(cè)的DNA序列或者蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)標(biāo)記包括種子貯藏蛋白和同工酶(不同基因位點(diǎn)編碼的酶的不同分子形式)及等位酶(同一基因位點(diǎn)上不同的等位基因編碼的酶的不同形式)。狹義的分子標(biāo)記僅僅指DNA標(biāo)記,一般所稱(chēng)的分子標(biāo)記即被界定在此范圍之內(nèi)[4]。這是因?yàn)樵趹?yīng)用上DNA標(biāo)記比蛋白質(zhì)標(biāo)記廣泛的多。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)比DNA的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多。構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸有幾十種,而構(gòu)成DNA的堿基只有4種,通過(guò)指數(shù)級(jí)的排列方式僅是其一級(jí)結(jié)構(gòu)的可能性就有數(shù)量級(jí)上的差異,且不計(jì)蛋白質(zhì)更加復(fù)雜的二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)及其結(jié)構(gòu)域。并且到目前為止,蛋白質(zhì)的復(fù)制與合成遠(yuǎn)不及DNA復(fù)制技術(shù)成熟,可控性也不高。因此,蛋白質(zhì)標(biāo)記應(yīng)用遠(yuǎn)不如DNA標(biāo)記方便和廣泛。但從更嚴(yán)格的意義上講,蛋白質(zhì)標(biāo)記是研究生命現(xiàn)象更為精確的標(biāo)記,因?yàn)槠涓€(wěn)定、多態(tài)性更高,每種蛋白質(zhì)都是唯一的(序列唯一、構(gòu)象唯一)。

1.3理想的分子標(biāo)記

理想的分子標(biāo)記必須達(dá)到以下要求:①具有高多態(tài)性;②共顯性遺傳,即利用分子標(biāo)記可鑒別二倍體中雜合和純合基因型;③能明確辨別等位基因;④遍布整個(gè)基因組;⑤除特殊位點(diǎn)的標(biāo)記外,要求分子標(biāo)記均勻分布于整個(gè)基因組;⑥選擇中性(即無(wú)基因多效性);⑦檢測(cè)手段簡(jiǎn)單、快速(如實(shí)驗(yàn)程序易自動(dòng)化);⑧開(kāi)發(fā)成本和使用成本盡量低廉;⑨在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)空間重復(fù)性好(便于數(shù)據(jù)交換)[5]。

特別需要提出的是,所有的分子標(biāo)記都必須滿足和某個(gè)基因或者已知標(biāo)記緊密連鎖(連鎖程度越高越好)甚至共分離。

但是,目前發(fā)現(xiàn)的任何一種分子標(biāo)記均無(wú)法同時(shí)滿足以上所有要求。使用者可以根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵缶唧w選用某種標(biāo)記技術(shù)。

2目前常用分子標(biāo)記的基本原理

2.1限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)

限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Pol-ymorphism)是指用限制性內(nèi)切酶處理不同生物個(gè)體的DNA所產(chǎn)生的分子片斷大小的差異。此技術(shù)基于生物個(gè)體的基因組的變異,是研究不同基因組間的差異的技術(shù),由Grod-zicker于1974年首先提出。其基本原理是:物種經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化,各個(gè)種屬甚至品種之間的同源DNA序列上的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)不同,或者由于突變、重組等原因引起限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)上的核苷酸的變化。若引起DNA分子某一特定內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)序列內(nèi)發(fā)生變化,這樣該位點(diǎn)就不能被切開(kāi),使得DNA片段比親本長(zhǎng);若突變后形成新的酶切位點(diǎn),則酶切后的片斷變短。這樣,通過(guò)電泳可以將大小不同的片斷區(qū)分開(kāi)來(lái)。對(duì)于分子量較小的質(zhì)粒DNA就可直接觀察到DNA長(zhǎng)度的差異,但對(duì)于核DNA而言,DNA片斷呈連續(xù)分布,無(wú)法辨別差異,需通過(guò)Southern雜交轉(zhuǎn)移至支持膜上,用單拷貝或低拷貝的DNA克隆作為探針與膜上的酶切片斷雜交,通過(guò)放射自顯影或非同位素顯色技術(shù),發(fā)生變異的材料顯示的帶就可能與親本的帶處于不同位置。檢測(cè)出與此標(biāo)記DNA相關(guān)的片段構(gòu)建出多態(tài)性圖譜,即為RFLP[5,6]。這種特定的限制性片斷與DNA探針的組合,便可以作為遺傳標(biāo)記。由于RFLP起源于DNA的變異,不受顯隱性關(guān)系、環(huán)境條件和發(fā)育階段的影響,具有遺傳的專(zhuān)一性和穩(wěn)定性的特點(diǎn),在數(shù)量上不受限制,可隨機(jī)選取足夠數(shù)量能代表整個(gè)基因組的RFLP標(biāo)記,而且每個(gè)標(biāo)記變異大,檢測(cè)方便。用于檢測(cè)RFLP的克隆探針可隨機(jī)選取,可以是使核糖體DNA、葉綠體DNA,也可以是總DNA。這樣就可以獲得能夠反映遺傳差異的大量多態(tài)性,為進(jìn)行資源分析、品種鑒定、物種進(jìn)化、基因定位、親緣關(guān)系和遺傳距離的分析,遺傳圖譜的構(gòu)建提供了有力的工具。并且RFLP是共顯性標(biāo)記,能夠區(qū)別出雜合體與純合體[7]。雖然RFLP具有結(jié)果穩(wěn)定可靠,重復(fù)性好,特別適合建立連鎖圖等優(yōu)點(diǎn),但也具有檢驗(yàn)步驟多、周期長(zhǎng)、成本高等缺點(diǎn)。并且RFLP對(duì)DNA多態(tài)性檢出的靈敏性不高,RFLP連鎖圖譜上還有很大的空間區(qū)(gap),甚至在使用同位素時(shí)可能對(duì)人有一定的傷害等等,這些都是需要進(jìn)一步完善的地方。

2.2隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(Random Amplified Polymorphi-sms DNA)是美國(guó)杜邦公司的Williams和加利福尼亞生物研究所的Welsh等領(lǐng)導(dǎo)的2個(gè)小組于20世紀(jì)90年代同時(shí)開(kāi)發(fā)出來(lái)的一種新的DNA指紋技術(shù)。此技術(shù)是應(yīng)用一系列隨機(jī)引物擴(kuò)增并尋找多態(tài)性DNA片段的遺傳標(biāo)記技術(shù)。這一技術(shù)建立于PCR反應(yīng)基礎(chǔ)之上,以隨機(jī)的短脫氧核苷酸(通常為10個(gè)堿基)作為PCR引物,對(duì)基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增而產(chǎn)生多態(tài)的DNA圖譜。擴(kuò)增產(chǎn)生的片段可通過(guò)瓊脂糖電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳分開(kāi),經(jīng)溴化乙錠染色或銀染色得到多態(tài)性的DNA圖譜后進(jìn)行多態(tài)性觀察。在基因組上,每個(gè)引物可以連續(xù)直接擴(kuò)增特定的DNA片段,對(duì)一個(gè)特定的基因型來(lái)講,這些擴(kuò)增的片段或片段的類(lèi)型是唯一的。它的應(yīng)用是基于這樣的一個(gè)理論:對(duì)于同一模板DNA,用同一引物擴(kuò)增既可能得到相同的帶譜(模板基因組間可能具有同源性),也可能得到不同的帶譜。僅在某一特定模板中出現(xiàn)的條帶即可作為該模板的分子標(biāo)記[8,9]。事實(shí)上,不同基因組DNA總是有一定差異的,所以用RAPD即可進(jìn)行分子標(biāo)記研究。理論上講,在一定的擴(kuò)增條件下,擴(kuò)增的條帶數(shù)取決于基因組的復(fù)雜性。對(duì)特定的引物,復(fù)雜性越高的基因組所產(chǎn)生的擴(kuò)增條帶數(shù)也越多。

RAPD所用的一系列引物的DNA序列雖然各不相同,但對(duì)于某一特定引物來(lái)說(shuō),它同基因組DNA序列有特定的互補(bǔ)區(qū)域。這些特定區(qū)域在基因組的分布如果符合PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件的話,即引物在模板上的2條鏈如果有互補(bǔ)位置并且與引物的3′端在200bp以內(nèi),就可以擴(kuò)增出這一片段。如果基因組在這些區(qū)域內(nèi)發(fā)生插入、缺失或者替換即可導(dǎo)致這些特定的結(jié)合位置分布發(fā)生變化而使PCR產(chǎn)物發(fā)生增加、缺失或者分子量發(fā)生改變,通過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物的檢測(cè),即可找出基因組DNA在這些區(qū)域內(nèi)的多態(tài)性[10]。由于RAPD分析時(shí)所用的引物數(shù)量極大,并且引物序列隨機(jī),雖然對(duì)某一引物而言檢測(cè)的區(qū)域有限,但是利用一系列引物可以檢測(cè)的區(qū)域幾乎可以覆蓋整個(gè)基因組。與RFLP是從一系列酶切片段中尋找多態(tài)性片段不同,RAPD是利用PCR隨機(jī)合成多態(tài)性DNA片段,檢測(cè)被擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)的遺傳特征變化。其具體優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在:①極大的豐富性,能反映整個(gè)基因組的變化;②強(qiáng)大的可探測(cè)性,無(wú)需合成特定的引物;③高效性與靈敏性。短期內(nèi)可以得到大量的擴(kuò)增片段,只要是遺傳特異性的發(fā)生變化,即使親緣關(guān)系很近的個(gè)體也可以識(shí)別出[11]。

RAPD最大的特點(diǎn)是引物的堿基序列是隨機(jī)的,所用引物通常多達(dá)幾百種,并且1套引物可以用作多個(gè)物種或者群體,所以RAPD技術(shù)在用于遺傳多樣性和品種鑒定的研究中具有極大的優(yōu)越性。因此,用來(lái)鑒定品種純度是很有用的。據(jù)報(bào)道[9],從玉米、大豆、小麥及紅三葉草干種子中提取DNA并成功地利用RAPD技術(shù)擴(kuò)增DNA片段;中國(guó)科學(xué)院遺傳所陳洪等利用OPP-18引物成功地鑒定了雜交水稻汕優(yōu)63雜種純度,鑒定結(jié)果與田間小區(qū)種植鑒定完全一致。RAPD技術(shù)反應(yīng)靈敏、多態(tài)性強(qiáng),操作簡(jiǎn)便,速度快,費(fèi)用低,既有大量的隨機(jī)引物可供篩選之用,又不受種屬的限制,被廣泛用于多種作物的種子鑒定[9,11,12]。

由于是隨機(jī)引物對(duì)整個(gè)基因組進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè),在技術(shù)上簡(jiǎn)單易行不需要克隆制備、同位素標(biāo)記、Southern印記等預(yù)備性工作,所需DNA樣品量少,安全性好,價(jià)格便宜,是繼RFLP之后應(yīng)用最廣的分子標(biāo)記。由于引物沒(méi)有特異性,1套引物可用于不同生物基因組的的分析,分析速度快,短期內(nèi)可得到大量的遺傳標(biāo)記,并克服了同工酶位點(diǎn)少和RFLP操作技術(shù)復(fù)雜的弊端,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于遺傳作圖、基因定位和克隆、物種進(jìn)化及鑒定特殊染色體區(qū)段的鑒別和分離以及動(dòng)植物育種等方面,特別是在尋找與目的基因連鎖的分子標(biāo)記方面,近年來(lái)報(bào)道了大量的與各種目的基因連鎖的RAPD標(biāo)記。水稻的Xa-21 基因和西紅柿的pto基因的成功分離就是首先找到了與目的基因緊密連鎖的RAPD標(biāo)記,然后通過(guò)定位克隆的方法克隆了目的基因[13]。

與PCR相比,RAPD具有以下特點(diǎn):①RAPD使用的是隨機(jī)引物,不需要預(yù)先了解目的基因和相應(yīng)的序列;②操作簡(jiǎn)便,實(shí)驗(yàn)周期短,能在較短的時(shí)間篩選大量樣品;③引物具有普遍適應(yīng)性,適用于自動(dòng)化操作分析。

與RFLP相比,RAPD具有以下特點(diǎn):①RAPD分析只需要少量模板,1次擴(kuò)增僅需20~100ng,這對(duì)于DNA量很少的材料進(jìn)行基因組分析有利。比如對(duì)花粉粒、原生質(zhì)體、種子等的DNA分析是切實(shí)可行的。②RAPD標(biāo)記具有更大的隨機(jī)性,亦有利于圖譜的構(gòu)建。對(duì)于DNA含量大的和多倍體物種,RFLP探針會(huì)與多倍體的多個(gè)片段雜交,所得到的混合指紋會(huì)對(duì)其他等位基因的闡明帶來(lái)困難。而且由于DNA量較大,進(jìn)行單拷貝的Southern雜交不很實(shí)際,至少需要很長(zhǎng)的曝光時(shí)間,并且已知的探針數(shù)量有限。RAPD大大增加了可構(gòu)建遺傳圖譜物種的數(shù)量。③無(wú)需借助于有傷害性的同位素,耗費(fèi)的人力物力少。④靈敏度高。引物中的個(gè)別堿基的變化會(huì)引起擴(kuò)增條帶和強(qiáng)度的劇烈變化,這是RFLP所無(wú)法比擬的。短期內(nèi)可以得到大量的擴(kuò)增片段,只要是遺傳特異性發(fā)生變化,即使親緣關(guān)系很近的個(gè)體也可以識(shí)別出。⑤RAPD標(biāo)記可以覆蓋整個(gè)基因組,包括編碼和非編碼區(qū),可以反映整個(gè)基因組的變化。但是,由于引物的競(jìng)爭(zhēng)性等,基因組的RAPD位點(diǎn)有時(shí)不能全部檢出,造成假象上的差異,這在種屬親緣關(guān)系的研究上尤其明顯。⑥RAPD產(chǎn)物有大于50%的條帶擴(kuò)增于單拷貝區(qū),經(jīng)過(guò)克隆和序列分析后,可作為RFLP和原位雜交的探針,在基因定位、克隆及輔助選擇育種中可以廣泛應(yīng)用。

隨著RAPD日益廣泛的使用,其不足之處也逐漸顯現(xiàn),比如標(biāo)記的顯隱性位點(diǎn)性,致使其不能在后代中區(qū)分雜合體和純合體;穩(wěn)定性差,由于是單鏈引物隨機(jī)的結(jié)合,在眾多的反向重復(fù)序列上,每次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能不一致。解決辦法是對(duì)單鏈引物進(jìn)行篩選,優(yōu)化PCR條件;高度的變異性,即使在親緣關(guān)系很近的物種間,結(jié)果也可能差異極大;Tm值低的隨機(jī)引物易受外界環(huán)境影響,如Mg2+濃度等[8,9,14]。

由于RAPD技術(shù)是由多種成分參加的生化反應(yīng),反應(yīng)中各種成分均為微量,盡管其反應(yīng)靈敏度高,但是影響因素較多,故而RAPD受環(huán)境影響很大,穩(wěn)定性差,重復(fù)性也不好,因此對(duì)實(shí)驗(yàn)的設(shè)備、條件及其操作的一致性很?chē)?yán)格,這又大大限制了它的使用。為了得到較穩(wěn)定的結(jié)果,各種反應(yīng)參數(shù)必須事先優(yōu)化選擇,操作中每一步都必須小心謹(jǐn)慎,以防止出現(xiàn)差錯(cuò)。

2.3特征序列擴(kuò)增區(qū)域(Sequence-characterized amplified regions,SCAR)

RAPD標(biāo)記一般表現(xiàn)顯性遺傳,但若某RAPD片段不是重復(fù)序列,也可將其轉(zhuǎn)化為RFLP標(biāo)記。另外,為了提高某一理想RAPD標(biāo)記的穩(wěn)定性,可首先將其克隆并對(duì)其末端測(cè)序,之后,在原來(lái)RAPD所用的10bp引物上增加合成上述末端序列的14bp的核苷酸,以此為引物對(duì)基因組DNA再行擴(kuò)增分析,此即SCARs(Sequenced Characterized Amplified Regions)標(biāo)記[15]。

SCAR首先由Parar和Michlmore(1993)提出并應(yīng)用。SCAR標(biāo)記是在RAPD技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。其基本步驟是:先作RAPD分析,然后把目標(biāo)RAPD片段(如與某目的基因連鎖的RAPD片段)進(jìn)行克隆和測(cè)序,根據(jù)原RAPD片段兩末端的序列設(shè)計(jì)特定引物(一般比RAPD引物長(zhǎng),通常24個(gè)堿基,是在原RAPD引物的3′與5′端延長(zhǎng)14個(gè)堿基),利用兩端各24個(gè)堿基的引物再進(jìn)行PCR特異擴(kuò)增,這樣就可把與原RAPD片段相對(duì)應(yīng)的單一位點(diǎn)鑒定出來(lái)。這樣的位點(diǎn)就稱(chēng)為SCAR。總的來(lái)說(shuō),SCAR比RAPD和其他利用隨機(jī)引物的方法在基因定位和作圖中的應(yīng)用更好,因?yàn)樗懈叩目芍貜?fù)性(原因是使用的引物長(zhǎng)),標(biāo)記是共顯性遺傳的[16]。

該方法與RAPD相比,具體有如下優(yōu)點(diǎn):①由于有較長(zhǎng)的引物,退火溫度較高,因此具有更高的檢測(cè)穩(wěn)定性;②有將顯性RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為共顯性的SCAR標(biāo)記的可能性;③如果是顯性標(biāo)記,則在檢測(cè)中可以直接染色而不需電泳檢測(cè)。另外,用RAPD找到擴(kuò)增片段后不再設(shè)計(jì)引物,而是直接測(cè)序后通過(guò)電腦軟件分析(如用ClustalX軟件進(jìn)行對(duì)位,MEGA軟件計(jì)算DNA序列間的差異百分率和轉(zhuǎn)換/顛換數(shù),UPGMA軟件建親緣關(guān)系樹(shù)狀圖等),找出特異性的堿基作為鑒定的特異性標(biāo)記[17]。

2.4與RAPD技術(shù)相近的分子標(biāo)記種類(lèi)

下面提到的所有技術(shù)都是利用1個(gè)或2個(gè)短的富含GC堿基的隨機(jī)引物。

(1)DNA擴(kuò)增指紋圖譜(DNA amplification fingerprint-ing,DAF)[18]。與RAPD技術(shù)不同的是,在DAF分析中,引物濃度更高,引物長(zhǎng)度更短(一般5~8個(gè)堿基),只有2個(gè)溫度循環(huán)(在RAPD中是3個(gè)溫度循環(huán)),并且往往用聚丙烯酰胺凝膠電泳,DAF通常會(huì)產(chǎn)生非常復(fù)雜的帶型。

(2)任意引物PCR(arbitrarily primed polymerase chain reaction, AP-PCR)。AP-PCR使用的引物較長(zhǎng)(10~50個(gè)堿基),但PCR反應(yīng)前2個(gè)循環(huán)的嚴(yán)謹(jǐn)條件較低,最終的反應(yīng)結(jié)果與RAPD類(lèi)似[19]。在AP-PCR分析中,擴(kuò)增分為3個(gè)部分,每個(gè)部分要求的條件和組分的濃度存在差異;在第1個(gè)PCR循環(huán)中,引物濃度較高;引物長(zhǎng)度不定,并且常常來(lái)自為其他目的而設(shè)計(jì)的引物(如M13通用測(cè)序引物)。

2.5擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Poly-morphism),亦稱(chēng)選擇性限制片段擴(kuò)增(SRFA, Selective Res-triction Fragment Amplification),是荷蘭Keygene公司的Za-beau Marc和Vos Pieter于1993年創(chuàng)建的一種新型的分子標(biāo)記,并于當(dāng)年獲得了歐洲專(zhuān)利局專(zhuān)利[20]。

它是RFLP和PCR相結(jié)合的分子標(biāo)記技術(shù),既有RFLP的可靠性,又有PCR(如RAPD)的靈敏性,多態(tài)性高。其基本原理是利用PCR技術(shù)選擇性擴(kuò)增基因組DNA雙酶切后產(chǎn)生的限制性片斷。基因組經(jīng)2種限制性內(nèi)切酶消化以后將一雙鏈DNA人工接頭(artificial adapter)連接于限制性片斷兩端。然后根據(jù)接頭序列和限制性位點(diǎn)附近的區(qū)域的堿基序列,設(shè)計(jì)一系列3′端含數(shù)個(gè)隨機(jī)變化的選擇性堿基的PCR引物進(jìn)行特異性條件擴(kuò)增,只有那些限制性位點(diǎn)的側(cè)翼序列與引物3′端選擇堿基相匹配的限制性片段才能得以擴(kuò)增。這些選擇性堿基數(shù)目的多少主要是由待測(cè)樣品的基因組大小決定,選擇性堿基數(shù)目多,選擇性就強(qiáng),擴(kuò)增產(chǎn)物就少;反之,其數(shù)目就少,選擇性弱,擴(kuò)增產(chǎn)物就多。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離顯示其多態(tài)性。當(dāng)不同基因組DNA中因?yàn)橥蛔円鹣拗菩晕稽c(diǎn)的數(shù)量發(fā)生改變或2個(gè)限制性位點(diǎn)之間的區(qū)域內(nèi)發(fā)生堿基插入、片段消失或順序重排時(shí),電泳譜帶顯示多態(tài)性,多態(tài)性以擴(kuò)增片段的長(zhǎng)短不同和數(shù)量多寡顯示出來(lái)[21]。

AFLP的技術(shù)特點(diǎn)包括以下幾個(gè)方面:①使用2種內(nèi)切酶消化模板DNA。一些酶的切割位點(diǎn)較多,如MseI、TaqI、XbaI等,另一些酶切位點(diǎn)較少,如PstI等等。采用雙酶切割的原因是:多切點(diǎn)酶產(chǎn)生小片段,便于凝膠分析切點(diǎn)數(shù)少的酶減少擴(kuò)增片段,由于AFLP反應(yīng)中擴(kuò)增片段是2個(gè)酶共同酶切的片段,這樣減少了選擇擴(kuò)增時(shí)所需的選擇堿基數(shù)。雙酶可以進(jìn)行單鏈標(biāo)記,從而防止電泳中因?yàn)殡p鏈泳動(dòng)不均而產(chǎn)生的雙帶假象。并且可使少量引物產(chǎn)生許多不同的引物組合,從而產(chǎn)生大量的不同的AFLP指紋圖譜[22]。另外,不同物種基因組的AFLP過(guò)程中使用的限制性內(nèi)切酶也不盡相同。EcoRI可靠廉價(jià),是6堿基內(nèi)切酶的首選。分析真核生物基因組時(shí)大多使用MseI(4堿基),因?yàn)镸seI的識(shí)別序列是TTAA,而真核生物基因組富含AT序列,與TaqI相比(其識(shí)別序列為T(mén)CGA),可以獲得更多的便于PCR擴(kuò)增和電泳分離的小片段DNA[23]。②AFLP的接頭為雙鏈寡核苷酸。人工合成時(shí)接頭未進(jìn)行磷酸化處理,所以只有1條單鏈連接于酶切片段的末端。③與常規(guī)的PCR相比,AFLP的引物有其獨(dú)特性。其引物有3部分構(gòu)成:與接頭互補(bǔ)的核心序列、內(nèi)切酶識(shí)別序列以及3′末端的選擇性堿基。該類(lèi)引物的一個(gè)重要特征是通常以鳥(niǎo)苷酸G開(kāi)頭,這樣可以有效的形成雙鏈,不過(guò)當(dāng)dNTP濃度過(guò)低時(shí)容易形成雙鏈結(jié)構(gòu)。此外,選擇性堿基的數(shù)目影響著AFLP反應(yīng)的特異性。研究表明,引物帶有1~3個(gè)選擇性堿基時(shí)擴(kuò)增的選擇性較好。當(dāng)選擇性堿基超過(guò)4個(gè)時(shí),擴(kuò)增的錯(cuò)配程度超過(guò)了允許程度,故而AFLP的選擇性堿基數(shù)目一般不超過(guò)3個(gè),具體數(shù)目取決于基因組的大小。研究表明,分析500Mbp以下的植物基因組時(shí)用EcoRI+2(2個(gè)選擇性堿基)/MseI+3引物組,500~6 000 Mbp的基因組應(yīng)采取EcoRI+3/MseI+3較為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)囊锝M。微生物通常采用1個(gè)選擇性堿基的引物組[24]。④AFLP的PCR擴(kuò)增分兩步進(jìn)行。首先預(yù)擴(kuò)增,其擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)一定比例稀釋后,以此為模板再進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。兩步擴(kuò)增可以減少擴(kuò)增產(chǎn)物中的非特異性帶,降低了不清晰電泳造成的指紋圖譜的背景,提高了指紋圖譜的清晰度,還可以增加擴(kuò)增片段數(shù),為AFLP分析提供充足的模板。

AFLP技術(shù)不僅具有其他分子標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn),即位點(diǎn)數(shù)量無(wú)限,呈典型的孟德?tīng)栠z傳,無(wú)表型、復(fù)等位效應(yīng),不受環(huán)境影響等,還具有一些獨(dú)特的優(yōu)越性,如標(biāo)記異常豐富,典型的AFLP反應(yīng)中,1次電泳可得到100~150個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物,其他標(biāo)記技術(shù)難以達(dá)到。穩(wěn)定性、重復(fù)性好,應(yīng)用非常廣泛,可用于任何生物基因組的遺傳分析。與PCR技術(shù)結(jié)合,可在短時(shí)間內(nèi)得到大量多態(tài)性標(biāo)記。同時(shí)對(duì)模板濃度不敏感,模板需求量也小。Vos Pieter在對(duì)番茄基因組AFLP分析時(shí),證實(shí)了模板濃度在相差1 000倍以內(nèi)(0.000 5~25ng)獲得的指紋圖譜基本一致。另外,在AFLP中標(biāo)記的引物會(huì)全部耗盡,引物耗盡后,擴(kuò)增的帶型不受循環(huán)數(shù)的影響。這樣模板濃度即使不一致也可以通過(guò)增減循環(huán)次數(shù)的方法獲得強(qiáng)度一致的帶型。目前,AFLP是構(gòu)建基因組特定區(qū)段高密度連鎖圖譜的最有效的方法。此外,AFLP全基因組分布非常適合構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。AFLP也可以用于檢測(cè)DNA庫(kù)(DNA pool)克隆的DNA大片段的多態(tài)性,而且其多態(tài)性的標(biāo)記大多對(duì)應(yīng)于基因組的某一位置,這樣就可以和STS一樣,成為遺傳圖譜(genetic map)和物理圖譜(physical map)之間的橋梁[25,26]。

實(shí)際操作中,影響AFLP指紋圖譜結(jié)果的因素很多。因此,應(yīng)采取質(zhì)量高、純度好、分子量大的的基因組DNA作為模板。如果模板中含有其他雜質(zhì)或者DNA降解很?chē)?yán)重,導(dǎo)致酶切不完全,許多未經(jīng)酶切的模板片段經(jīng)電泳后產(chǎn)生表現(xiàn)為高分子量的條帶(假帶),導(dǎo)致不能真實(shí)地反映被測(cè)物種的多態(tài)性。為了避免電泳的條帶過(guò)多或者過(guò)少,應(yīng)對(duì)PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化,篩選出最佳的引物組合。PCR擴(kuò)增時(shí),應(yīng)在模板變性之前加入Tag酶和dNTP,否則會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。反應(yīng)體系中的dNTP濃度不能過(guò)低,否則擴(kuò)增產(chǎn)物容易形成雙鏈結(jié)構(gòu)[21,27]。

2.6序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STS)

序列標(biāo)簽位點(diǎn)(Sequence -Tagged Site,STS)指的是一段序列已知并且能夠在基因組中作為“路標(biāo)”使用的DNA序列,是對(duì)由特定引物序列所界定的一類(lèi)DNA標(biāo)記的統(tǒng)稱(chēng)。其最大特點(diǎn)就是利用特異PCR,因此結(jié)果非?？煽?。顯然,成為STS必須滿足2個(gè)條件:①序列已知;②位置確定并唯一。從理論上講,任何一段DNA都可以成為STS。但是,由于需要的是與某一個(gè)目標(biāo)性狀基因或已知的標(biāo)記緊密連鎖的DNA片段,因此能夠利用的STS數(shù)量則非常有限。根據(jù)單拷貝的DNA片段兩端的序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物擴(kuò)增基因組DNA,產(chǎn)生的一段長(zhǎng)度為幾百bp的特異序列在基因組中往往只出現(xiàn)1次,從而能夠界定基因組的特異位點(diǎn)。在人類(lèi)基因組作圖中已用其作為將遺傳圖譜與物理圖譜整合的共同位標(biāo),這在基因組作圖上具有非常重要的作用。隨著大量的模式生物的全基因組測(cè)序,會(huì)有越來(lái)越多的可利用的STS被發(fā)現(xiàn)。

2.6.1表達(dá)序列標(biāo)簽標(biāo)記(Expressed Sequence Tags,EST)。EST是指一小段(通常長(zhǎng)度300~500bp)單次重復(fù)的mRNA序列或cDNA序列。它們?cè)谔囟ǖ慕M織或者特定的時(shí)期內(nèi)特異的表達(dá),可以看作是特定的cDNA文庫(kù)中的標(biāo)記。EST計(jì)劃由美國(guó)科學(xué)家Venter于1989年提出,并首先應(yīng)用于人類(lèi)基因組研究,之后被廣泛用于植物基因組研究,它是通過(guò)大規(guī)模的cDNA隨機(jī)測(cè)序,從而獲得對(duì)基因組認(rèn)識(shí)的一種研究策略。目前,許多國(guó)家和組織正在開(kāi)展某些作物基因組EST計(jì)劃的研究,如成立于1998年的國(guó)際小麥族EST協(xié)作網(wǎng)(International Triteace EST corperation,ITEC),就是致力于麥類(lèi)EST研究和開(kāi)發(fā)的[28]。近幾年來(lái),國(guó)際公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的EST序列呈指數(shù)增長(zhǎng),截止到2006年8月,美國(guó)生物信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)Genbank已公布涉及205 000種生物的61 132 599條EST序列,總長(zhǎng)度共65 369 091 950bp。

快速增長(zhǎng)的ESTs數(shù)據(jù)為SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)提供了一個(gè)巨大的有價(jià)值的來(lái)源。首先,避免了傳統(tǒng)SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)需要構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)等煩瑣步驟,而且從ESTs中發(fā)掘出的SSR只是ESTs測(cè)序計(jì)劃的副產(chǎn)品,從而節(jié)省了大量人力物力[29];其次,其本身是功能基因的一部分序列,所以它將為功能基因提供“絕對(duì)”的標(biāo)記[30]。同時(shí),由于不同物種間基因共線性和保守性,從一種作物中開(kāi)發(fā)的EST-SSR可同時(shí)用于其他作物研究,從而能夠?yàn)楸容^基因組學(xué)和同源基因克隆提供新的途徑[31]?，F(xiàn)在EST-SSR已被用于構(gòu)建遺傳圖譜、分離與鑒定新基因、基因表達(dá)差異研究、比較基因組研究和制備DNA芯片等方面。

另外,還有一種被稱(chēng)為GSS序列的標(biāo)記。GSS序列本質(zhì)上和EST序列是一樣的,不同之處是它的序列直接來(lái)源于基因組而不是mRNA或cDNA。它通常有以下幾種來(lái)源:①全基因組檢測(cè)得到的特異/單次重復(fù)序列;②來(lái)自質(zhì)粒/BAC/YAC克隆所得到的單次重復(fù)序列;③基因組外顯子捕獲;④通過(guò)Alu—PCR得到的序列。

2.6.2微衛(wèi)星(SSR)。微衛(wèi)星(microsatellite)又叫做簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat)或者短串聯(lián)重復(fù)序列(Short trandem repeat,STR)、簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性(Simple Seque-nce Length Polymorphism,SSLP)。簡(jiǎn)單序列重復(fù)多態(tài)性(Si-mple Sequence Repeat Polymorphisms,SSRP)微衛(wèi)星指的是真核生物普遍存在的遍布整個(gè)基因組的排列為2~5個(gè)核苷酸的短串聯(lián)重復(fù)序列,如(CA)n、(GT)n、(CAG)n等,尤以(CA)n重復(fù)序列最為常見(jiàn),其長(zhǎng)度由重復(fù)單位的拷貝數(shù)決定。在真核生物基因組中微衛(wèi)星很豐富,通常長(zhǎng)度能夠達(dá)到150bp,是一類(lèi)呈高度多態(tài)的遺傳標(biāo)記,不僅可用于基因組遺傳連鎖圖的構(gòu)建以及基因的定位與克隆,而且可用于遺傳性疾病的連鎖分析和基因診斷。其重復(fù)單位數(shù)目的改變可以引起相當(dāng)高的多態(tài)性,但突變率僅為0.5×10-4~5.0×10-4,在家系中可以穩(wěn)定地遺傳,是一種很好的遺傳標(biāo)志[32]。

微衛(wèi)星約占真核基因組的5%,其基本構(gòu)成單位一般為1~8bp,多位于編碼區(qū)附近,也可位于內(nèi)含子、啟動(dòng)子及Alu序列(反向重復(fù)序列)中。人類(lèi)基因組約有5~10萬(wàn)個(gè)(CA)n重復(fù)序列。通常認(rèn)為重復(fù)序列的產(chǎn)生是由于在遺傳物質(zhì)復(fù)制過(guò)程中DNA滑動(dòng)或在有絲分裂、減數(shù)分裂期染色體不對(duì)等交換所致,因此該重復(fù)序列多存在于不經(jīng)嚴(yán)格選擇的基因組區(qū)域。目前普遍認(rèn)為微衛(wèi)星充當(dāng)基因重組的熱點(diǎn)是基因重排和變異的來(lái)源[33]。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instabi-lity,MSI)是指由于復(fù)制錯(cuò)誤(replication error,RER)引起的簡(jiǎn)單重復(fù)序列的增加或丟失,也稱(chēng)RER陽(yáng)性或RER表型。MSI首先在結(jié)直腸癌中觀察到。微衛(wèi)星通過(guò)改變DNA結(jié)構(gòu)或通過(guò)與特異性蛋白質(zhì)結(jié)合而發(fā)揮其基因調(diào)控作用。

由于微衛(wèi)星的寡核苷酸在同一物種的不同基因型之間差異很大,可以利用特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物根據(jù)與微衛(wèi)星重復(fù)序列兩翼的特定保守序列設(shè)計(jì),用來(lái)擴(kuò)增重復(fù)序列本身。由于重復(fù)的長(zhǎng)度變化極大,所以這是檢測(cè)多態(tài)性的1種有效方法[34]。其特點(diǎn)包括:一般檢測(cè)到的是1個(gè)單一的多等位基因位點(diǎn);共顯性遺傳,故可鑒別雜合子和純合子;得到的結(jié)果復(fù)性很高。為了提高分辨力,通常使用聚丙烯酰胺凝膠電泳,它可檢測(cè)出單拷貝差異。也可以在同1個(gè)反應(yīng)試管中把PCR反應(yīng)與不同的SSR引物結(jié)合起來(lái)(稱(chēng)為multiplexing),這可節(jié)省時(shí)間,但是,這只能在不同引物的產(chǎn)物在大小上下不重疊的情況下才能使用[35,36]。很顯然,使用SSR技術(shù)的前提是需要知道重復(fù)序列兩翼的DNA序列的信息,這一方面可以在其他種的DNA數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢,否則就必須先建立含有微衛(wèi)星的基因組文庫(kù),再?gòu)闹泻Y選可用的克隆,進(jìn)行測(cè)序,然后設(shè)計(jì)合適的引物。同時(shí),這種由保守序列確定的微衛(wèi)星序列也具有染色體位點(diǎn)的特異性,因此1981年Miesfeld等首次發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星后,很快成為1種常用高效的分子標(biāo)記。統(tǒng)計(jì)分析表明,不同的物種其微衛(wèi)星的突變頻率也是穩(wěn)定的。SSR的PCR引物也是對(duì)某一高變重復(fù)位點(diǎn)高度專(zhuān)一的。用特定引物擴(kuò)增出相應(yīng)的微衛(wèi)星片段后,再通過(guò)電泳分離,差異可經(jīng)過(guò)EB或者銀染后觀察。一般種群可顯示出超過(guò)10種類(lèi)型的等位基因。微衛(wèi)星不僅重復(fù)單位變異數(shù)大,而且其重復(fù)區(qū)域總長(zhǎng)度又在PCR易于擴(kuò)增的區(qū)域,快速簡(jiǎn)便,所需的DNA用量小。與等位酶相似,微衛(wèi)星是具有獨(dú)立的共顯性基因。由于微衛(wèi)星的遺傳中性并且比等位酶法有更多的可供檢測(cè)的等位基因,這樣就可以提供更加精細(xì)的基因變化的范圍,因此在種群研究上有著更大的應(yīng)用[3,34,37-39]。

簡(jiǎn)而言之,微衛(wèi)星的最大優(yōu)點(diǎn)在于通過(guò)簡(jiǎn)單的PCR擴(kuò)增即可直接檢測(cè)到已知的特定的染色體位點(diǎn),不僅具有一般PCR操作簡(jiǎn)單、快速、成本低的特點(diǎn),還具有RFLP的穩(wěn)定可靠、特異性、共顯性等特點(diǎn),不足之處是其引物開(kāi)發(fā)難度較大,技術(shù)復(fù)雜,周期長(zhǎng),成本也高。不過(guò)隨著眾多模式生物的全基因組測(cè)序的飛速進(jìn)展,對(duì)全基因組了解的日益全面,各個(gè)大型數(shù)據(jù)庫(kù)的逐步完善,并且借助越來(lái)越發(fā)達(dá)的計(jì)算機(jī)計(jì)算和預(yù)測(cè)技術(shù),使得開(kāi)發(fā)成本有所降低。

2.6.3其他具有特定引物的分子標(biāo)記種類(lèi)。

(1)加錨微衛(wèi)星寡核苷酸(Anchored microsatellite oli-gonucleotides)。Zietki-ewicz et al(1994)對(duì)SSR技術(shù)進(jìn)行了發(fā)展[40],他們用加錨微衛(wèi)星寡核苷酸作引物,對(duì)基因組節(jié)段而不是重復(fù)序列本身進(jìn)行擴(kuò)增。在SSR的5′端或3′端加上2~4個(gè)隨機(jī)選擇的核苷酸,這可引起特定位點(diǎn)退火。這樣就能導(dǎo)致位于反向排列的間隔不太大的重復(fù)序列間的基因組節(jié)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。這類(lèi)標(biāo)記又被稱(chēng)為ISSR(inter-simple sequence repeat)、ASSR(anchored simple sequence repeats)或AMP-PCR。這類(lèi)標(biāo)記往往是顯性遺傳的。在所用的兩翼引物中,可以1個(gè)是ASSR引物,另1個(gè)是隨機(jī)引物。如果1個(gè)是5′端加錨的ASSR引物,另1個(gè)是隨機(jī)引物,則被稱(chēng)為RAMP技術(shù)。

(2)CAPS(Clea-ved amplified polymorphic sequence)。CAPS技術(shù)又可稱(chēng)為PCR-RFLP。所用的PCR引物是針對(duì)特定的位點(diǎn)而設(shè)計(jì)的。其基本步驟是:先進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶酶切,再用瓊脂糖凝膠電泳將DNA片段分開(kāi),用EB染色,觀察。與RFLP技術(shù)一樣,CAPS技術(shù)檢測(cè)的多態(tài)性其實(shí)是酶切片段大小的差異。在酶切前進(jìn)行RCR產(chǎn)物檢測(cè),其多態(tài)性稱(chēng)為ALP。Neff et al.(1998)在此基礎(chǔ)上又發(fā)展出dCAPS技術(shù)(derived CAPS),這是檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的一種良好方法。

(3)單引物擴(kuò)增反應(yīng)(single primer amplification reaction,SPAR)。SPAR技術(shù)與RAPD技術(shù)相似的是也只用1個(gè)引物,但SPAR分析中所用的引物不是隨機(jī)的,而是在SSR的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的,例如可能的序列是(TA)10或(CGA)6。擴(kuò)增的是SSR之間的DNA序列。又稱(chēng)為MP-PCR(microsate-llite-primed PCR)。

(4)小衛(wèi)星區(qū)域DNA直接擴(kuò)增(directed amplification of minisatellite region DNA,DAMD)。直接用小衛(wèi)星的核心序列作引物進(jìn)行擴(kuò)增。

(5)Inter-Alu PCR like genomic profiling。與SPAR技術(shù)相近,也只用1個(gè)引物,但所用的引物是在Alu序列(反向重復(fù)序列)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的,擴(kuò)增的是copia(另一種反向重復(fù)序列)序列之間的DNA序列。

(6)ISTR(inverse sequence-tagged repeat)。這種技術(shù)與SPAR技術(shù)也相近,所用的引物是在copia序列的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的,擴(kuò)增的是copia序列之間的DNA序列。

(7)IFLP(intron fragment length polymorphism)。檢測(cè)的對(duì)象是內(nèi)含子的長(zhǎng)度差異。根據(jù)內(nèi)含子兩端的特征序列設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增出長(zhǎng)度不同的內(nèi)含子片段。

(8)RAMPO(random amplified microsatellite polymorph-ism)。RAMPO的英文全名與RAMP的英文全名相近,但實(shí)驗(yàn)方法卻不同。RAMPO的基本步驟是:先用1個(gè)單一的隨機(jī)引物(即RAPD引物)對(duì)基因組DNA擴(kuò)增,用電泳將擴(kuò)增片段分開(kāi),然后,把凝膠轉(zhuǎn)移到尼龍膜上,使之與一個(gè)帶有放射性標(biāo)記(或其他標(biāo)記)的與SSR互補(bǔ)的寡核苷酸探針如(CA)8和(GA)8雜交,放射自顯影后可得到新的多態(tài)性類(lèi)型。

先找到RFLP標(biāo)記后,對(duì)RFLP探針進(jìn)行測(cè)序,再合成適當(dāng)?shù)腜CR引物,這樣可發(fā)現(xiàn)新的STS標(biāo)記。這也可稱(chēng)為RFLP-PCR。

3抗性基因同源序列(RGA)

近年來(lái),在各種農(nóng)作物抗性育種的進(jìn)程和模式生物的抗性研究中,在水稻、玉米、番茄、馬鈴薯、煙草、擬南芥等植物中克隆了若干抗性基因,包括植物對(duì)病毒、細(xì)菌、線蟲(chóng)的抗性基因。例如煙草抗花葉病毒基因、水稻抗白葉枯病基因Xa-21、擬南芥抗丁香假單胞桿菌基因RPS2、亞麻抗銹病基因L6以及甘蔗抗胞囊線蟲(chóng)基因HS1等。

Leister等通過(guò)分析研究已克隆的植物抗病基因的結(jié)構(gòu)特征,發(fā)現(xiàn)很大一部分的抗病基因都含有NBS保守序列。同年,《美國(guó)科學(xué)院院刊》在同一期發(fā)表了2篇應(yīng)用同源序列從大豆中克隆R基因同源序列的報(bào)道,從而引發(fā)了同源序列法在植物抗病基因研究中的應(yīng)用。隨后的大量研究表明,植物抗病基因中存在多種類(lèi)型的保守結(jié)構(gòu)域。Hammond Kosack和Parker通過(guò)分析已克隆的植物抗病基因結(jié)構(gòu),將植物抗病基因分為8 類(lèi),其中,含有NBS-LRR(富亮氨酸重復(fù)子Leucine-rich Repeats,LRR)結(jié)構(gòu)域的抗病基因是最主要的類(lèi)型。

這些結(jié)構(gòu)可能是參與蛋白質(zhì)之間的相互作用或者細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)以及識(shí)別。根據(jù)抗性基因的這一共性,以其保守結(jié)構(gòu)的序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物,在任何作物中,用PCR技術(shù)擴(kuò)增和分離具有相似序列的DNA片段,即抗性基因同源序列。

RGA提供了一種快速鑒定候選抗性基因的便捷途徑。目前已經(jīng)利用此技術(shù)在小麥、大豆、馬鈴薯中鑒定了候選抗性基因,它們?cè)诨蚪M的位置基本上就在已知的抗病基因區(qū)域。已知基因包括抗病毒、細(xì)菌、真菌和線蟲(chóng)的基因。而且部分與抗性基因緊密連鎖的標(biāo)記本身就是抗性基因或者抗性基因的一部分。因此,應(yīng)用RGA進(jìn)行基因定位可以較快地檢測(cè)到與抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記?？梢灶A(yù)見(jiàn),RGA將成為抗性基因定位的重要手段,并且在分子作圖的領(lǐng)域?qū)l(fā)揮更加巨大的作用[41,42]。

4單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms,SNPs)

單核苷酸多態(tài)性是指2套基因組的DNA序列兩兩進(jìn)行位置比對(duì)時(shí), 單個(gè)核苷酸的的不同而顯示出的差異(多態(tài)性)。因此,SNP反映了過(guò)去多數(shù)突變事件的特點(diǎn),2個(gè)個(gè)體在同一位點(diǎn)攜帶的不同等位基因被認(rèn)為是進(jìn)化的遺傳標(biāo)志。顯而易見(jiàn),SNP是目前已知的多態(tài)性最高的分子標(biāo)記。據(jù)Genbank估計(jì),如果比較2套人類(lèi)基因組的DNA序列,出現(xiàn)SNP的頻率可達(dá)1/2 000~1/1 000,看起來(lái)這個(gè)頻率并不高,但是考慮到人類(lèi)基因組共有3.2×109bp時(shí),即可能出現(xiàn)3.2×1012個(gè)SNP位點(diǎn)時(shí),這個(gè)數(shù)量已經(jīng)相當(dāng)可觀了。并且這只是2套基因組之間的比較,所有的SNP位點(diǎn)肯定比這個(gè)數(shù)字大得多。水稻中SNP分布頻率也很高,平均1 000bp就有1個(gè)SNP,這些標(biāo)記隨著水稻基因組的實(shí)施而被發(fā)現(xiàn)和利用。由于SNP具有同一個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性低而全基因組多態(tài)性又極其豐富的特點(diǎn),并且分析時(shí)只需要進(jìn)行陰/陽(yáng)性分析而不需進(jìn)行片段的長(zhǎng)度分析,特別適合用DNA芯片技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模的掃描分析,是繼微衛(wèi)星后最為高效的標(biāo)記。不過(guò)其昂貴的成本(開(kāi)發(fā)和使用的成本都很高)使其應(yīng)用受到一定的限制。建立可供利用的SNP標(biāo)記需經(jīng)過(guò)以下幾步:①全基因組測(cè)序;②根據(jù)測(cè)序結(jié)果確定特定的序列標(biāo)記位點(diǎn);③對(duì)STS進(jìn)行掃描,尋找SNP位點(diǎn);④確定SNP;⑤將SNP定位到染色體上。

5單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single Strand Conformational Poly-morphism,SSCP)

SSCP是指DNA單鏈構(gòu)象的多態(tài)性,是基于PCR擴(kuò)增而新發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)檢測(cè)DNA多態(tài)性的分析技術(shù)。在進(jìn)行SSCP分析時(shí),利用PCR特異的擴(kuò)增出基因組目的DNA片段,然后將這些擴(kuò)增出來(lái)的DNA片段進(jìn)行變性處理,使雙鏈DNA分開(kāi)成單鏈,再用非變性凝膠電泳分離。由于在自然狀態(tài)下,單鏈DNA會(huì)折疊卷曲,形成一定點(diǎn)空間構(gòu)象,這種空間構(gòu)象是由DNA鏈的堿基序列決定。如果擴(kuò)增的目的DNA片段序列的堿基發(fā)生了變異,就可能造成其單鏈的空間構(gòu)象發(fā)生改變,從而影響其單鏈電泳時(shí)的遷移速率,導(dǎo)致其在電泳圖譜上的帶紋位置不同,顯示出不同生物個(gè)體DNA的特異性。

6新型分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及其應(yīng)用前景

自從20世紀(jì)70年代第1代分子(RFLP)標(biāo)記出現(xiàn)以來(lái),分子標(biāo)記家族迅速發(fā)展繁榮起來(lái),并且準(zhǔn)確性和靈敏性也一步步提高。目前的SNP技術(shù)已經(jīng)可以在單個(gè)核苷酸的水平上找出不同樣本之間的差異,即使它們之間的親緣關(guān)系非常接近。

縱觀分子標(biāo)記的發(fā)展,是伴隨著人們對(duì)生命本質(zhì)的認(rèn)識(shí)一步步加深,認(rèn)識(shí)范圍從宏觀表型一步步逼近微觀世界的進(jìn)程同步發(fā)展的。任何一個(gè)特殊生命現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn),都可能導(dǎo)致革命性的理論或技術(shù)的產(chǎn)生,DNA雙螺旋理論的提出導(dǎo)致了DNA的自我復(fù)制理論,又進(jìn)而導(dǎo)致了PCR技術(shù)以至于后來(lái)的全自動(dòng)PCR儀的問(wèn)世(當(dāng)然也少不了其間Taq聚合酶的發(fā)現(xiàn))。比如各種類(lèi)型的外切酶和內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致了RFLP技術(shù)的產(chǎn)生。

重大的技術(shù)突破來(lái)源于理論的突破性進(jìn)展,重大理論的提出來(lái)源于無(wú)數(shù)細(xì)微現(xiàn)象的總結(jié)?；仡?0世紀(jì)生命科學(xué)的重大突破:1900年孟德?tīng)柕倪z傳理論被重新認(rèn)識(shí);1920年,摩爾根的基因理論和連鎖遺傳的提出;1953年,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)理論的提出;直到90年代,自動(dòng)PCR儀的出現(xiàn)。從此,人們又進(jìn)入了一個(gè)眾多實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的重復(fù)和積累的階段。已經(jīng)有很多不能解釋甚至是矛盾的試驗(yàn)現(xiàn)象在陸續(xù)出現(xiàn)。可以預(yù)言,下一次的理論突破將導(dǎo)致更加革命性的發(fā)現(xiàn),也必將使得分子標(biāo)記技術(shù)能夠從更加深的層面上解釋生命現(xiàn)象本身,人們對(duì)分子標(biāo)記的認(rèn)識(shí)和利用也更加深刻和簡(jiǎn)便。并且隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的迅速發(fā)展,使得人們不僅能從浩如煙海的數(shù)據(jù)和現(xiàn)象中發(fā)現(xiàn)總結(jié)規(guī)律,還能夠根據(jù)現(xiàn)有的現(xiàn)象和規(guī)律來(lái)預(yù)測(cè)可能的現(xiàn)象乃至規(guī)律。根據(jù)目前的發(fā)展來(lái)看,分子標(biāo)記的用途不會(huì)再局限在傳統(tǒng)的生物、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域,還會(huì)擴(kuò)大到諸如數(shù)據(jù)加密傳輸、計(jì)算技術(shù)等領(lǐng)域。

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