汪輝,彭新凱，曹小彥，胡朝暉，何紅梅

（長沙市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測中心，長沙 410013）

HPLC測定原料乳與乳制品中三聚氰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)的不確定度評定

汪輝,彭新凱，曹小彥，胡朝暉，何紅梅

（長沙市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測中心，長沙 410013）

建立高效液相色譜法測定測定原料乳與乳制品中三聚氰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)的不確定度評定方法,采用GB/T22388-2008高效液相色譜法測定測定原料乳與乳制品中三聚氰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)。建立數(shù)學(xué)模型，根據(jù)《測量不確定度評定與表示》(JJF1059—1999)中有關(guān)規(guī)定評估其不確定度。結(jié)果表明，按數(shù)學(xué)模型計算奶粉中三聚氰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.70 mg/kg，擴展不確定度為0.064 mg/kg，結(jié)果表達(dá)為(2.70±0.064)mg/kg。該方法建立的數(shù)學(xué)模型合理、可靠。

高效液相色譜；原料乳；乳制品；三聚氰胺；不確定度

0 引 言

三聚氰胺 (melamine)又稱三氨三嗪，簡稱三胺,為白色或無色結(jié)晶是一種重要的氮雜環(huán)有機化工原料[1]。三聚氰胺分子中含有大量氮元素，普通的全氮測定法測蛋白質(zhì)含量時不能排除這類偽蛋白氮的干擾，因而一些廠商為了能低成本而添加這種化工原料，以提高產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量。

測量不確定度對實驗室間比對、測量結(jié)果臨界值的判斷、方法的確認(rèn)以及檢測工作國際化等方面，都有重要的意義。目前，我國檢測三聚氰胺的方法已比較成熟，相關(guān)文獻(xiàn)也較多[2-5]，且已有農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)Y/T137222007、 國 家 標(biāo) 準(zhǔn) GB/T22388-2008，GB/T22400-2008。本實驗根據(jù)國家計量技術(shù)規(guī)范的要求，結(jié)合日常的檢測工作，進行HPLC測定原料乳與乳制品中三聚氰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)（GB/T22388-2008）的測量不確定度評估[6]。

1 實 驗

1.1 主要儀器與試劑

Waters1525高液相色譜儀配2996二極管陣列檢測器，717Plus自動進樣器，Epower工作站，三聚氰胺（99.9%）。

1.2 色譜條件

色譜柱為WelchMaterialsAQ-C18色譜柱（250mm×4.6 mm,5 μm i.d.），柱溫為40 ℃，流速為1.0 mL/min，流動相為庚烷磺酸鈉 （濃度為0.01 mol/L），檸檬酸（0.01 mol/L）-乙腈 （90+10， 體積比）， 檢測波長為240nm，柱溫為40 ℃，進樣量20 μL。

1.3 方法（參照GB/T22388-2008）

（1）提取。準(zhǔn)確稱取2.0 g樣品于50 mL的具塞塑料離心管中，加入15mL三氯乙酸溶液和5 mL乙腈，超聲提取10 min,再振蕩提取10 min后，以不低于4 000 r/min離心10 min。上清液經(jīng)三氯乙酸溶液潤濕的濾紙過濾后，用三氯乙酸定容至25 mL，移取5 mL濾液，加入5 mL水混勻后做待凈化液。

（2）凈化。將待凈化液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中。依次用3 mL水、3 mL甲醇洗滌,抽至近干后，用6 mL氨化甲醇液溶液洗脫。洗脫液于50℃下氮氣吹至近干,準(zhǔn)確加入1 mL流動相,在快速混勻器上混勻1 min，經(jīng)0.45 μm的濾膜過濾，上機分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 數(shù)學(xué)模型

式中：X為樣品中三聚氰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/kg；c為標(biāo)準(zhǔn)曲線得出試樣中三聚氰胺的質(zhì)量濃度，mg/L；m為樣品的質(zhì)量，g；V為樣品稀釋體積，mL；frec回收率校正因子，等于回收率的倒數(shù)。

2.2 不確定度的主要分量[7-10]

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線得出試樣中三聚氰胺的濃度引入的不確定度urel(c)：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程玻璃儀器校準(zhǔn)產(chǎn)生的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程溫度變化產(chǎn)生的不確定度和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的不確定度。

（2）樣品稱量引入的不確定度urel(m)：由天平的最大允許誤差引起。

（3）體積引入的不確定度urel(V)：由定容體積和進樣體積的不確定度組成。

（4）樣品處理過程引入的不確定度urel(frel)：測試樣品的制備過程非常復(fù)雜，需經(jīng)過均質(zhì)、溶液轉(zhuǎn)移、過濾、固相萃取等步驟，每一步操作都會引入不確定度，要逐步確定每一步驟對測量結(jié)果不確定度的貢獻(xiàn)是相當(dāng)困難的，可采用檢測方法確認(rèn)中的有關(guān)數(shù)據(jù)，如回收率對制樣過程引入的不確定度進行評定。

2.3 不確定度urel(c)

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書提供的信息，三聚氰胺的不確定度為0.5%，按正態(tài)分布考慮，包含因子K=3，屬B類評定，故其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3.2 配制過程中產(chǎn)生的不確定度評定

標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制過程：精確稱取0.1000 g三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，加甲醇水溶液溶解并定容至100 mL，質(zhì)量濃度為1.0 g/L。

（1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的不確定度。

查稱量使用的Sartorius CP225D電子天平檢定證書，其最大允許誤差0.05 mg，重復(fù)性誤差0.02 mg，該天平屬于一級天平，一般采用矩形分布，包含因子為，屬B類評定。其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（2）玻璃量具引入的不確定度。

標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程中使用了一系列玻璃量具，按照《常用玻璃量具檢定規(guī)程JJG196-2006》的要求，均有相應(yīng)的最大允差。歐洲分析化學(xué)中心(EURACHEM)認(rèn)為其服從三角分布，故K=，由此估算不確定度分量。表1為玻璃量具校準(zhǔn)的不確定度。

表1 玻璃量具校準(zhǔn)的不確定度

由表1中數(shù)據(jù)合成的相對不確定度為

（3）溫度變化產(chǎn)生的不確定度評定。

溫度波動產(chǎn)生不確定度：T校正=20℃，而實驗室的溫度在（20±3）℃變動，該影響引起的不確定度可通過估算溫度范圍和體積膨脹系數(shù)來進行計算，溶劑以水為代表，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1，玻璃的膨脹系數(shù)為9.75×10-6℃-1(可忽略不計)。計算標(biāo)準(zhǔn)不確定度時假設(shè)溫度變化是矩形分布。

表2 溫度變化的不確定度

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度評定urel(x曲)

配制質(zhì)量濃度為0.5，0.8，1，2，5 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，每個質(zhì)量濃度測量6次。

由表2中數(shù)據(jù)合成的相對不確定度為

表3 標(biāo)準(zhǔn)溶液測量結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=4.67×105x+3.27×103，相關(guān)系數(shù)為0.9999。

以某品牌奶粉樣品為例，6次測定后，由線性方程得到c＝1.18 mg/L，則由擬合曲線求x時產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

式中：SR為從標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的Y與相應(yīng)測得值Yi之差按貝塞爾公式求出的標(biāo)準(zhǔn)偏差；m為樣品溶液的測定總次數(shù)，m=6；n為標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定總次數(shù)，n=6；c為樣品中三聚氰胺質(zhì)量濃度的平均值；c0為標(biāo)準(zhǔn)溶液中三聚氰胺質(zhì)量濃度的平均值；c為標(biāo)準(zhǔn)溶液中三聚氰胺的質(zhì)量濃度。

2.4 樣品稱量的不確定度評定

用Mettler AL204天平 (檢定證書給出最大允許誤差0.5 mg，重復(fù)性誤差0.3 mg)準(zhǔn)確稱取樣品2 g，由稱量產(chǎn)生的不確定度按矩形分布考慮，包含因子k=

由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、玻璃量具校準(zhǔn)和溫度變化的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量及標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度分量合成標(biāo)準(zhǔn)曲線得出試樣中三聚氰胺的濃度的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為屬B類評定。其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.5 樣品定容的不確定度評定

2.5.1 體積的不確定度評定

（1）樣品定容過程中使用了一系列玻璃量具。1 mL單標(biāo)線吸量管、5 mL單標(biāo)線吸量管、25 mL容量瓶的最允許誤差分別為±0.007，0.015，±0.03 mL。評定方法同2.3.2（2），可得定容體積V1mL單標(biāo)線吸量管、V5mL單標(biāo)線吸量管、V25mL容量瓶的相對不確定度u17、u18、u19分別為2.85×10-3、1.22×10-3、4.90×10-4。 則合成的相對不確定度為

（2）樣品定容過程中溫度變化產(chǎn)生的不確定度評定方法同3.1.2.3。 可得V1mL單標(biāo)線吸量管、V5mL單標(biāo)線吸量管、V25mL容量瓶的相對不確定度u20、u21、u22分別為3.64×10-4、3.64×10-4、3.64×10-4。則合成的相對不確定度為

（3）由于實驗過程中采用waters 717plus高精度自動進樣器，由進樣體積引入的不確定度可忽略不計。則樣品定容中的總體積V的標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成為

2.6 樣品處理過程產(chǎn)生的不確定度評定（屬A類不確定度）

制樣過程產(chǎn)生的不確定度采用添加2.5 mg/kg(與所測定樣品濃度水平相近)6次樣品回收率的相關(guān)數(shù)據(jù)進行計算。6次回收率測定結(jié)果為90.9%，92.4%，91.1%，92.5%，89.6%，92.6%，平均回收率為=91.5%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為=1.20%，標(biāo)準(zhǔn)不確定度采用平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為

同時，必須對平均回收率進行顯著性檢驗，以確定回收率校正因子frec是否在計算公式中采用。顯著性檢驗采用t檢驗（見表4）。

表4 t-檢驗規(guī)則

式中，t＞2.58，說明frec與100%有非常顯著差異，必須在計算公式中采用frec修正結(jié)果。

2.7 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

因為根據(jù)文中給出的數(shù)學(xué)模型，各分量無相關(guān)性。因此，將以上各相對不確定度分量合成為

2.8 擴展標(biāo)準(zhǔn)不確定度

按國際慣例，取包含因子k=2，被測量之值的大約95%可望含于此區(qū)間，則擴展標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.9 測量不確定度報告

按照GB/T22388-2008實驗室方法 《原料乳與乳制品中三聚氰胺的檢測方法》測定奶粉中三聚氰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果為

3 結(jié) 論

綜上所述，最終結(jié)果的不確定度主要由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的不確定度和試樣處理過程產(chǎn)生的不確定度所引起，其次是標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的測定所引起的不確定度以及量具所引起的不確定度，由樣品稱量的不確定度極小，可忽略不計。

在實驗中，在樣品處理過程中更加規(guī)范實驗操作來增大回收率、同時增加測定次數(shù)和選用更高精度的量具，則可以將結(jié)果的不確定度進一步減小。

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Uncertainty evaluation of high performance liquid chromatographic determination of melamine in raw milk and dairy products

WANG Hui，PENG Xin-kai，CAO Xiao-yan，HU Zhao-hui，HE Hong-mei
(Changsha Center of Supervision and Inspection on Food Quality Safety,Changsha 410013,China)

Objective:A assess method of measuring uncertainty was established according to GB/T22388-2008 which determined melamine in raw milk and dairy products by HPLC.Methods:A mathematical model was established which evaluated uncertainty according to“Evaluation and Expression of Uncertainty in Measurement”.Results:The content of milk powder was 2.70 mg/kg according to mathematical model established in the study，expanded uncertainty was 0.064 mg/kg ，an d the expression

of uncertainty was(2.70±0.064)mg/kg.Conclusion:The mathematical model was established was logical and credible.

HPLC；raw milk；dairy products；melamine；uncertainty

TS252.7

A

1001-2230（2010）03-0058-04

2009-11-11

汪輝（1983-），男，助理工程師，主要要從事食品質(zhì)量安全分析與研究。

曹小彥