劉源慧 鄭 毅 王 婭 鄧琳芬

米曲霉F16原生質(zhì)體的制備和再生研究

劉源慧 鄭 毅 王 婭 鄧琳芬

福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

目的：研究菌齡、酶液組成、酶解時(shí)間、酶解溫度、滲透壓穩(wěn)定劑、培養(yǎng)基成分等因素對(duì)米曲霉F16原生質(zhì)體制備和再生的影響。結(jié)果表明，米曲霉原生質(zhì)體制備和再生的最佳條件是：菌齡15h，酶液為0.75%纖維素酶、0.75%蝸牛酶、0.5%溶菌酶的混合酶液，酶解時(shí)間2.5h，溫度為28℃，最適原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基為含有0.6mol/L NaCl的PDA培養(yǎng)基。

米曲霉 原生質(zhì)體 制備 再生

米曲霉（）是一類產(chǎn)復(fù)合酶的菌株，生產(chǎn)的酶類包括蛋白酶，淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、植酸酶等[1]，在造紙、食品、飼料、生產(chǎn)曲酸、釀造等工業(yè)中應(yīng)用十分廣泛。在實(shí)際生產(chǎn)中，米曲霉的產(chǎn)酶能力往往欠佳。如果能對(duì)米曲霉進(jìn)行人工改造以提高其酶活,將會(huì)在一定程度上提高生產(chǎn)效率,降低生產(chǎn)成本。目前關(guān)于米曲霉的育種，主要采用物理和化學(xué)的誘變方法。自Emerson[2]首次報(bào)導(dǎo)得到粗糙脈孢菌的類原生質(zhì)體結(jié)構(gòu)以來,絲狀真菌原生質(zhì)體的研究已經(jīng)取得了長足的進(jìn)步，廣泛運(yùn)用于真菌遺傳學(xué)的理論研究和育種實(shí)踐。與之相關(guān)的原生質(zhì)體誘變、融合、轉(zhuǎn)化等技術(shù)是如今行之有效的菌種選育方法,愈加受到人們的重視,已經(jīng)有許多的成功報(bào)道[3-4]。然而原生質(zhì)體制備和再生是與原生質(zhì)體相關(guān)的生物技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此本文對(duì)米曲霉原生質(zhì)體的制備和再生條件進(jìn)行研究，為基于原生質(zhì)體技術(shù)基礎(chǔ)上的融合和基因組改組技術(shù)奠定夯實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株

米曲霉F16為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株

1.1.2 主要試劑

蝸牛酶(Snailase)；為廈門泰京生物有限公司產(chǎn)品；

纖維素酶(Cellulase),溶菌酶(Lysozyme)均為國藥試劑；

其他常規(guī)試劑均購自上海生工和中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司。

1.1.3培養(yǎng)基

（1）PDA固體培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯200；葡萄糖20；瓊脂 20；pH 6.8

（2）馬丁培養(yǎng)基(g/L)：KH2PO41；MgSO4·7H2O 0.5；蛋白胨 5；葡萄糖 10；瓊脂 15-20；pH 6.8

（3）查氏培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖30；NaNO33；KH2PO41；KCl 0.5；MgSO4·7H2O 0.5；FeSO40.001；麩皮10；瓊脂 15-20；pH 6.8

（4）PMA固體培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 40；KH2PO41；NaNO32；KCl 0.5；FeSO40.01；MgSO4·7H2O 0.5；NaCl 38；瓊脂 15；酵母膏 2；PH 6.0

（5）酵母膏培養(yǎng)基（g/L）：酵母膏5；蔗糖10；瓊脂粉15

（6）再生培養(yǎng)基：添加0.6mol/L的NaCl配制

1.2 方法

1.2.1菌絲體培養(yǎng)

從斜面上洗下的新鮮成熟孢子，調(diào)整孢子濃度在107個(gè)/mL，轉(zhuǎn)接入鋪有一層無菌玻璃紙的查氏固體培養(yǎng)基中，每皿接種量0.2mL，于28℃恒溫箱中靜置培養(yǎng)數(shù)小時(shí)備用。

1.2.2酶液的配制

用0. 6mol/L NaCl或其它不同滲透壓穩(wěn)定劑配制,經(jīng)0.22μ微孔濾膜過濾除菌,保存于4 ℃冰箱備用。

1.2.3原生質(zhì)體的制備與再生

刮下玻璃紙上長好的菌絲體于50mL離心管中，加入10mL酶液,放置于適宜溫度的水浴振蕩器中進(jìn)行酶解，并定時(shí)吸取少量酶解液用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。酶解完畢后，酶解液用4層無菌鏡頭紙過濾，除去菌絲體碎片，濾液3000r/min離心10min，除去上清液，用滲透壓穩(wěn)定劑離心洗滌2次后重懸浮于適量滲透壓穩(wěn)定劑中，得到純化的原生質(zhì)體[5]。用滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)上述原生質(zhì)體進(jìn)行了稀釋,使之達(dá)到一定的濃度，取0.2mL接種于再生培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)2d～3d。同時(shí)，取純化的原生質(zhì)體用無菌水適當(dāng)稀釋后放置30min，在未加入滲透壓穩(wěn)定劑的低滲固體培養(yǎng)基上涂布培養(yǎng)，作為對(duì)照，計(jì)算再生率。

再生率=(再生固體培養(yǎng)基上菌落數(shù)-低滲固體培養(yǎng)基上菌落數(shù))/原生質(zhì)體數(shù)×100%

2 結(jié)果和討論

2.1 菌齡的選擇

微生物的生理狀態(tài)尤其是菌齡，是決定原生質(zhì)體形成量的主要因素之一。絲狀真菌分離制備原生質(zhì)體時(shí)常采用年輕的菌絲，一般認(rèn)為對(duì)數(shù)前期和對(duì)數(shù)期效果最好。對(duì)于絲狀菌的原生質(zhì)體再生來說，通常認(rèn)為年輕細(xì)胞再生能力比衰老細(xì)胞要強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)米曲霉培養(yǎng)時(shí)間為15h時(shí)，原生質(zhì)體的形成量最大，達(dá)到1.92×106個(gè)/mL,再生率最高值出現(xiàn)在13h時(shí)，達(dá)到22%（圖1）。綜合考慮，選擇15h的菌齡作為原生質(zhì)體制備和再生的材料。

圖1 菌齡對(duì)原生質(zhì)體制備和再生的影響

2.2 酶液組成的選擇

不同微生物由于其細(xì)胞壁成分不同，用于破壁的酶種類也不相同。霉菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)及組成比較復(fù)雜，主要由纖維素、幾丁質(zhì)組成。要想獲得大量具有活性的原生質(zhì)體，首先要根據(jù)壁物質(zhì)選擇合適的酶，其次酶的濃度也要適當(dāng)，酶量過低，作用會(huì)不徹底，酶量過高，會(huì)影響原生質(zhì)體的數(shù)量和活性。

2.2.1單一酶液對(duì)原生質(zhì)體形成量的影響

分別單獨(dú)采用0.5%、1%、1.5%、2%的蝸牛酶、纖維素酶、溶菌酶找尋各自制備米曲霉原生質(zhì)體時(shí)的最佳酶量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用蝸牛酶裂解米曲霉時(shí)，其最佳濃度為1.5%，單獨(dú)使用纖維素酶的時(shí)候最佳濃度也為1.5%，單獨(dú)使用溶菌酶的時(shí)候最佳濃度為1%。

2.2.2酶解液的復(fù)合配比對(duì)原生質(zhì)體形成量的影響

上述單一酶對(duì)米曲霉原生質(zhì)體的制備效果不甚理想，這可能是由于真菌細(xì)胞壁較復(fù)雜，而使用單一的酶不能有效水解其細(xì)胞壁?？紤]到裂解反應(yīng)中各個(gè)酶之間的累積效應(yīng)和各個(gè)酶之間可能存在的影響，選取各自最佳濃度的一半作為復(fù)合酶液中的基本濃度來進(jìn)行混合，同時(shí)按照一定的步長擴(kuò)充各個(gè)酶的取值范圍，以此尋求原生質(zhì)體形成量最大時(shí)的酶濃度配比。結(jié)果表明制備米曲霉原生質(zhì)體時(shí)以混合酶液的效果較好，其中第二組原生質(zhì)體形成量最大（表1），故確定以0.75%蝸牛酶、0.75%纖維素酶、0.5%溶菌酶配制的混合酶液作為裂解液。

表1 酶液配比對(duì)原生質(zhì)體制備的影響

2.2.3 酶解時(shí)間的選擇

酶液處理菌絲體細(xì)胞壁的過程是一個(gè)漸進(jìn)的過程，隨著酶解時(shí)間的延長，原生質(zhì)體的數(shù)量也會(huì)增加，但是如果裂解時(shí)間過長，原生質(zhì)體的數(shù)量則會(huì)減少，并且對(duì)原生質(zhì)體的再生也不利。在最佳酶液和菌齡條件下分別對(duì)不同酶解時(shí)間的原生質(zhì)體進(jìn)行計(jì)數(shù)及再生實(shí)驗(yàn)。如圖2所示，酶解2.5h時(shí)原生質(zhì)體的再生率最高，形成量也最大，可達(dá)3.5×106個(gè)/mL。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體制備和再生的影響

2.2.4酶解溫度的選擇

溫度能影響菌絲體細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)性疏散以及形成的原生質(zhì)體的活力。研究不同溫度對(duì)米曲霉F16制備和再生的影響。結(jié)果如圖3，在28℃時(shí)原生質(zhì)體的再生率最高，而生成量在30℃時(shí)最大，達(dá)到2.94×106個(gè)/mL。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)采用28℃作為原生質(zhì)體的酶解溫度。

圖3 酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體制備和再生的影響

2.2.5滲透壓穩(wěn)定劑的選擇

原生質(zhì)體由于脫去細(xì)胞壁，對(duì)外界環(huán)境變化很敏感。滲透壓穩(wěn)定劑能夠?yàn)槊傅娜芙夂驮|(zhì)體的存在提供一個(gè)優(yōu)良的環(huán)境，防止原生質(zhì)體的破裂，對(duì)原生質(zhì)體具有穩(wěn)定和保護(hù)作用[6]。研究不同滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)原生質(zhì)體形成數(shù)的影響，如圖4所示，0.6mol/L NaCl作為滲透壓穩(wěn)定劑的原生質(zhì)體形成數(shù)最多，達(dá)2.8×106個(gè)/mL。

圖4 滲透壓穩(wěn)定劑對(duì)原生質(zhì)體制備的影響

原生質(zhì)體在蒸餾水或低滲的環(huán)境中容易破裂，所以再生培養(yǎng)基必須是高滲的。分別以0.6mol/L的NaCl、MgSO4.7H2O、KCl和蔗糖配制再生培養(yǎng)基，計(jì)算再生率，發(fā)現(xiàn)以0.6mol/L的NaCl配制的再生培養(yǎng)基上原生質(zhì)體再生效果最好。

2.2.6再生培養(yǎng)基的選擇

培養(yǎng)基成分為菌株提供不同的營養(yǎng)條件和生長環(huán)境，Peberdy[7]等發(fā)現(xiàn)改變培養(yǎng)基成分可以獲得不同的原生質(zhì)體產(chǎn)量，真菌的再生培養(yǎng)基中常常補(bǔ)加酵母膏、蛋白質(zhì)、糖類等作為營養(yǎng)因子。分別以0.6mol/L的NaCl配制PDA、PMA、查氏、馬丁、酵母膏培養(yǎng)基作為再生培養(yǎng)基。結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基不同，其再生率有明顯差異。本實(shí)驗(yàn)采用PDA作為原生質(zhì)體的再生培養(yǎng)基，其再生率可達(dá)27%左右，效果最佳。

圖5 不同培養(yǎng)基成分對(duì)原生質(zhì)體再生的影響

3 結(jié)論

錯(cuò)綜復(fù)雜的菌絲細(xì)胞的生理狀態(tài)、去壁酶種類、濃度、作用時(shí)間都可能對(duì)原生質(zhì)體的形成和再生產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，米曲霉菌株F16原生質(zhì)體制備和再生的最佳條件為：菌齡15小時(shí)，裂解液為含0.75%蝸牛酶、0.75%纖維素酶和0.5%溶菌酶的混合酶液，溫度28℃、時(shí)間2.5h、0.6mol/LNaCl作為滲透壓穩(wěn)定劑，高滲PDA培養(yǎng)基為再生培養(yǎng)基。此條件下的原生質(zhì)體形成量大，再生效果好。在具體實(shí)驗(yàn)操作中，還需要注意幾點(diǎn)：一是排除再生培養(yǎng)基上的冷凝水，因?yàn)樗謺?huì)降低滲透壓導(dǎo)致原生質(zhì)體破裂；二是制備好的原生質(zhì)體不能保存太久，最好現(xiàn)制現(xiàn)用；三，在用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行顯微觀察時(shí)，最好減弱外置光源的強(qiáng)度，因?yàn)橥渡涔膺^強(qiáng)，原生質(zhì)體與背景顏色反差較小[8]，不利于觀察。

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