黃春敏,沈 微,王正祥

(江南大學生物工程學院生物資源與生物能源研究中心和教育部工業(yè)生物技術教育部重點實驗室,江蘇無錫 214122)

高溫α-淀粉酶是一種內(nèi)切型淀粉酶,能隨機水解淀粉質(zhì)原料及其降解物內(nèi)部的α-1,4糖苷鍵。因具有反應溫度高、熱穩(wěn)定性好等特性而被廣泛應用于酒精、白酒、啤酒等食品發(fā)酵工業(yè)中和紡織業(yè)高溫退漿。地衣芽胞桿菌是公認的具有重要工業(yè)生產(chǎn)價值的生產(chǎn)菌株,在酶制劑工業(yè)中已使用數(shù)十年。但目前生產(chǎn)所使用的菌株大多是野生菌株經(jīng)過傳統(tǒng)遺傳改良獲得的突變株,容易出現(xiàn)平臺效應[1]。在以前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)：地衣芽胞桿菌中通過游離質(zhì)粒增加BLA編碼基因的劑量可以顯著提高BLA的發(fā)酵速率和產(chǎn)酶水平[2];通過定向基因整合的方法也可以有效提高BLA的產(chǎn)率[3]。同時在研究中也發(fā)現(xiàn),在特定地衣芽胞桿菌的染色體中,實現(xiàn)BLA編碼基因的整合與基因擴增并不容易發(fā)生。為此,本研究構建了一種基于16S rDNA序列為整合位點的am yL重組表達載體,采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入地衣芽胞桿菌CBBD302中,通過16S rDNA序列實現(xiàn)BLA編碼基因的整合與基因擴增,由此獲得了BLA生產(chǎn)水平顯著提高的重組菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 Escherchia coliJM109(CI CIMB0012)、Escherchia coliJM109(pLakr)、B acillus lichenifor m isCBBD302由江南大學中國高校工業(yè)微生物資源與信息中心(http：//cicim-cu.jiang nan.edu.cn)提供。pBL-amyL[3]、pSKsym-EryR[4]為本實驗室前期構建。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①大腸埃希菌和地衣芽胞桿菌的培養(yǎng)基均為LB培養(yǎng)基,需要時加入卡那霉素至50μg/mL或紅霉素至150μg/mL用于重組大腸埃希菌篩選,加入適量紅霉素用于地衣芽胞桿菌的篩選;②地衣芽胞桿菌轉(zhuǎn)化用培養(yǎng)基：416#培養(yǎng)基、2×S MM、Penassy培養(yǎng)基、S MMP、40%的PEG6000以及再生培養(yǎng)基DM3均參考文獻[5]配置;③發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米漿40 g/L,硫酸銨30 g/L,乳糖30 g/L;調(diào)pH 7.0。發(fā)酵試驗在250 mL三角瓶中進行,培養(yǎng)基裝液量為50 mL,200 r/min搖床培養(yǎng)120 h。

1.1.3 主要試劑 DNA限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、Sm aⅠ、B amHⅠ、B glⅡ、PstⅠ以及卡那霉素、紅霉素、PEG6000,上海生工生物工程技術服務有限公司;T4DNA連接酶,深圳晶美生物工程有限公司;X-Gal、IPTG,寶生物工程有限公司;PCR產(chǎn)物(小量)純化試劑盒、膠回收試劑盒,博大泰克公司;其他試劑藥品皆為國產(chǎn)或進口的分析純和生化試劑。

1.1.4 主要儀器 PCR擴增儀(B IO-RAD公司生產(chǎn)),紫外分光光度計(UN ICO公司生產(chǎn)產(chǎn)品,型號UV-2000),垂直板狀電泳系統(tǒng)(B IO-RAD公司生產(chǎn)),Alpha Innotech凝膠成像系統(tǒng)(美國Alpha Innotech公司生產(chǎn)),臺式高速離心機(美國Sigma公司生產(chǎn),型號1-15),臺式高速冷凍離心機(美國Sigma公司生產(chǎn),型號4K15)。

1.2 方法

1.2.1 DNA操作技術 地衣芽胞桿菌染色體DNA的提取,質(zhì)粒提取、酶切,大腸埃希菌感受態(tài)制備、CaCl2法轉(zhuǎn)化等操作參照文獻[6]進行。DNA片段膠回收、PCR產(chǎn)物純化用博大泰克試劑盒進行。B.lichenifor m is16S rDNA的PCR通用引物L1：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG、L2：ACGGCTACCTTGTTACGACTT,PCR反應基本條件：95℃,5 min;94℃,50 s,56℃,90 s,72℃,60 s,35個循環(huán);72℃,10 min。

1.2.2 原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化 參照文獻[7]的方法,并根據(jù)B.licheniformis CBBD302的特性對原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化條件進行了優(yōu)化。挑取單菌落接種于25 mL 416#培養(yǎng)基中,過夜培養(yǎng)。轉(zhuǎn)接1 mL到新鮮的416#培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)約4 h。離心收集菌液,用5 mL S MMP懸浮菌體,加入適量溶菌酶,37℃培養(yǎng)至90%的細胞變?yōu)樵|(zhì)體,1 900 r/min離心10 min。棄上清,將收集的菌體重懸于5 mL S MMP中,隨后依次加入5～10μL質(zhì)粒、等體積的2×S MM緩沖液和2 mL 40%PEG6000,輕輕混勻后,再加入10 mL的S MMP,2 000 r/min離心10 min。棄上清,再加入500μL S MMP,30℃,100 r/min培養(yǎng)150 min。涂布于含抗性的DM3再生培養(yǎng)基上。

1.2.3 高溫α-淀粉酶酶活的測定以及表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析 高溫α-淀粉酶酶活測定參照國家行業(yè)標準QB/T2306-97進行[8]。1個酶活單位定義為在90℃、pH 6.0的條件下1 min液化1 mg淀粉成為糊精所需的酶量。酶活以1 mL發(fā)酵液中的高溫α-淀粉酶酶活計算,用U/mL表示。SDS-PAGE分析參照文獻[6]進行。

2 結(jié) 果

2.1 整合表達通用性質(zhì)粒pBli16s-amyL-EryR的構建

以B.licheniform is染色體DNA為模板,用通用引物L1、L2擴增出B.licheniform is的16S rDNA,純化后與經(jīng)Sm aⅠ酶切的載體pLakr連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細胞,在含有50μg/mL卡那霉素的藍白平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子,獲得重組質(zhì)粒pLa-Bli16s。重組質(zhì)粒pLa-Bli16s經(jīng)B amHⅠ酶切、pBL-amyL經(jīng)BglⅡ酶切后膠回收1.88 kb的am yL片段,兩者連接并轉(zhuǎn)化E.coliJM109,在含有50μg/mL卡那霉素的淀粉平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子,獲得轉(zhuǎn)化子pB-li16s-amyL,并提取質(zhì)粒用PstⅠ酶切驗證。將pB-li16s-amyL用Sm aⅠ酶切,pSKsym-EryR經(jīng)Sm aⅠ酶切回收1.1 kb的EryR片段,兩者連接并轉(zhuǎn)化E.coliJM109,在含有50μg/mL紅霉素的淀粉平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子,得到整合表達質(zhì)粒pBli16samyL-EryR(圖1)。

圖1 整合表達通用性質(zhì)粒pBli16s-amyL-EryR的構建Fig.1 Construction of the common integrated expression plasmid pBli16s-amyL-EryR

2.2 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

用帶有卡那、紅霉素抗性的質(zhì)粒pBli16samyL-EryR轉(zhuǎn)化B.licheniform isCBBD302。將所得的轉(zhuǎn)化子分別點種到無抗和含有卡那霉素、紅霉素雙抗的淀粉平板上,觀察透明圈大小,挑取透明圈較原菌大的菌落分離純化、發(fā)酵測酶活,酶活比原菌高10%及以上的即為陽性轉(zhuǎn)化子。地衣芽胞桿菌原生質(zhì)體再生困難、限制修飾系統(tǒng)復雜等特殊生理、遺傳性狀,使其分子改良難度大大提高[9],其遺傳轉(zhuǎn)化至今仍是一大難點。實驗表明,相同條件下選擇對數(shù)中后期的菌體有利于原生質(zhì)體的再生;在制備原生質(zhì)體時,溶菌酶終濃度為1μg/mL,作用時間為25～30 min,原生質(zhì)體形成約90%,其轉(zhuǎn)化子數(shù)量最多為20～50 cfu/μgDNA;當原生質(zhì)體形成率成過高或過低,都不利于原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化或再生;在整個轉(zhuǎn)化過程中動作要輕柔,采用低速離心,防止原生質(zhì)體破裂。發(fā)酵試驗表明,再生平板上長出的轉(zhuǎn)化子假陽性極高,可能是在原生質(zhì)體形成和再生過程中細胞壁結(jié)構破壞,使抗生素篩選效果大大降低。

2.3 整合表達目的基因拷貝數(shù)的提高

本實驗采用地衣芽胞桿菌16S rDNA作為同源臂進行整合,而在地衣芽胞桿菌染色體上16S rDNA的整合位點有幾十個,大大提高了整合轉(zhuǎn)化的效率,而且可以反復轉(zhuǎn)化,以提高目的基因的拷貝數(shù)。但是由于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率低、假陽性高,因而本實驗采用在一定范圍內(nèi)提高液體培養(yǎng)基中抗生素的使用濃度,增加新生子代染色體中同源序列不等位交換,從而增加目的基因在宿主染色體上的基因拷貝數(shù)(圖2)。在原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化獲得的陽性轉(zhuǎn)化子中,隨機挑取20株在含不同濃度紅霉素的LB培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)與誘導,并轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基。酶活測定結(jié)果如表1所示。

圖2 α-高溫淀粉酶在染色體上的擴增模式Fig.2 The multiplication mode of thermophilicα-amylase in Chromosomes

表1 轉(zhuǎn)化子在不同濃度紅霉素誘導下的α-淀粉酶相對活力Table 1 Relativeα-amylase activity of transformations in induction of different concentrations of erythromycin

由表1可知：不同的轉(zhuǎn)化子對抗性的敏感性不同,在不同濃度紅霉素的誘導下,轉(zhuǎn)化子酶活提高了56.37%～80.29%。在低濃度下,酶活隨著抗性增加而非線性提高,這是因為淀粉酶基因胞外分泌表達受到轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、翻譯效率、肽鏈折疊等諸多因素影響;紅霉素濃度過高,抑制轉(zhuǎn)化子生長或產(chǎn)生不可逆的變化,使其酶活大大降低。

2.4 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

取酶活最高的發(fā)酵液與原菌做SDS-PAGE分析表明,目的條帶大小與報道的地衣芽胞桿菌高溫α-淀粉酶分子量55 ku左右相一致,胞外產(chǎn)BLA水平明顯提高(圖3)。由于BLA的大量分泌表達,胞外其他蛋白分泌量也發(fā)生了變化。

圖3 發(fā)酵液的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE profile of the proteins in broth

3 討 論

通過基因工程手段提高淀粉酶分泌的方法主要有強化啟動子功能、提高基因拷貝數(shù)等。Paval等[10]通過提高α-淀粉酶基因拷貝數(shù),使枯草芽胞桿菌野生菌株α-淀粉酶分泌能力提高了2 500倍;牛丹丹等[11]通過多拷貝游離質(zhì)粒和染色體整合分別將大腸埃希菌、地衣芽胞桿菌分泌的β-甘露聚糖酶活提高了15～18倍和5～7倍;Waldeck J等[12]通過多拷貝游離質(zhì)粒載體表達異源淀粉酶基因發(fā)現(xiàn)突變株表達異源淀粉酶的水平明顯提高,同時細胞自身表達的蛋白酶活力也顯著提高。實驗證明提高酶編碼基因拷貝數(shù)是提高其合成與分泌的最有效方法之一。從理論上講,抗性濃度增加,目的基因的拷貝數(shù)增加,酶活會相應提高,但是目的基因的分泌表達是個極為復雜的過程,受到操縱子調(diào)控、細胞監(jiān)控、能量再生、分泌調(diào)控等因素限制,因此找到不同轉(zhuǎn)化子的最合適的抗性是實現(xiàn)目的基因高效表達的關鍵。本實驗正是試圖通過改變培養(yǎng)基中抗性使用濃度,篩選出目的基因的高效表達的轉(zhuǎn)化子。最終轉(zhuǎn)化子在其合適的抗性濃度下酶活都得到了較大的提高,為56.37%～80.29%。此外,通過SDS-PAGE分析表明地衣芽胞桿菌胞外分泌表達量可能存在極限。

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