田文靜,白 偉,趙春祿,張智勇,崔俊安,何 瀟,馬宇輝,趙宇亮 (.青島科技大學環(huán)境與安全工

納米技術的迅猛發(fā)展使人造納米材料在消費品和工業(yè)產(chǎn)品中得到廣泛使用,但其特殊的物理化學性質(zhì)可能會對人類健康和生態(tài)環(huán)境造成負面影響[1].已有文獻表明納米ZnO具有明顯的生態(tài)毒性[2-4],但其毒作用機理目前仍不清楚.

氧化損傷被認為是納米材料毒性的作用機制之一,但目前研究主要利用離體細胞或成年動物[5].然而,離體細胞培養(yǎng)條件與體內(nèi)環(huán)境存在很大差異,體外細胞實驗結(jié)果在外推到整體動物時存在一定的局限性;胚胎或幼體在發(fā)育階段許多組織和器官尚未發(fā)育完全,沒有形成完善的對外界刺激的響應機制(如免疫功能等),因此其對污染物的響應機制可能不同于成年動物.基于以上考慮,本研究以斑馬魚胚胎為模式生物,通過測定胚胎中主要抗氧化物含量和酶活性,研究納米ZnO暴露對其抗氧化系統(tǒng)的影響,探討ZnO抑制斑馬魚胚胎孵化的作用機理.

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年斑馬魚由北京大學生命科學學院遺傳發(fā)育中心斑馬魚實驗室提供,在本實驗室循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中馴養(yǎng)3個月后收集魚卵.循環(huán)養(yǎng)殖水根據(jù)Brand等[6]的方法配制:每1000L去離子水中加入75g碳酸氫鈉,18g海鹽和8.4g硫酸鈣,水溫(28±1)℃,pH值為7.2,總硬度為62mg/L(以CaCO3計),電導率為485μS.光/暗周期為14h:10h.斑馬魚每日喂食2次人工孵化的鹵蟲幼體和1次蝦片(購于廣東揭陽市越群海洋生物研究開發(fā)公司).

1.2 試劑與儀器

試劑:納米 ZnO(30nm,純度＞99.9%)購自杭州萬景新材料有限公司.納米ZnO的物理、化學性質(zhì),包括粒徑、溶解性等在先前的研究中已進行了詳細表征[4].蛋白質(zhì)測試試劑盒(BCA)購自碧云天生物技術研究所,谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)測試試劑盒均購自南京建成生物工程研究所.其余化學試劑均為國產(chǎn)分析純試劑.

儀器:KQ-50B型超聲波清洗器(南京昕航科學儀器有限公司),MGC-250智能型光照培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司),低溫冰箱(Forma- 86C, USA),pH計(PB-10,Sartorius,Germany),高速冷凍離心機(Sigma3k15,Germany),酶標儀(SpectraMaxM2, USA),超聲波細胞破碎儀(VCΧ105, USA).

1.3 納米ZnO懸浮液的制備

試驗用水均為充氧飽和的標準胚胎培養(yǎng)液(E3)[6]:5mmol/LNaCl,0.17mmol/LKCl,0.33mmol/ LCaCl2和 0.33mmol/LMgSO4,不含亞甲基藍,并用NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH值至7.2.納米ZnO儲備液(100mg/L)的制備:直接將納米 ZnO顆粒加入一定體積的E3培養(yǎng)液中(不使用助溶劑),在冰水浴中超聲分散(50W,40kHz,30min).不同濃度納米ZnO 懸浮液用 E3培養(yǎng)液逐級稀釋制備:0,1, 5,10,50mg/L.考慮到納米材料在水中極易團聚沉淀,納米 ZnO懸浮液均為當天暴露前新鮮配制,使用前超聲5min.

1.4 胚胎毒性實驗

胚胎毒性實驗根據(jù) Best等[7]的方法稍加修改進行.即將 500 個正常受精卵(囊胚期,2.5～3h)加入到含800mL不同濃度納米ZnO懸浮液的燒杯中,置于光照培養(yǎng)箱中,溫度為(28±1)℃,光/暗周期為 14h:10h,處理 72h后收集胚胎和幼魚.處理過程中及時挑出凝結(jié)卵,防止其對正常卵產(chǎn)生影響.每個處理重復5次.同時進行對應濃度Zn2+處理對比實驗,步驟同納米ZnO.

1.5 樣品預處理和抗氧化指標測定

處理結(jié)束后,用 28℃去離子水清洗受試斑馬魚胚胎,去除表面附著的納米ZnO和Zn2+,將胚胎和幼魚置于離心管中,去除殘余水分,稱量后加入預冷勻漿介質(zhì)(0.01mol/LTris-HCl,0.0001mol/ LEDTA-2Na,0.01mol/L蔗糖,0.8%NaCl, pH=7.4),在冰水浴中勻漿(8s/2s/60%/2min),離心勻漿液(4℃ ,13000r/min,10min),取上清液置于-80℃冰箱內(nèi)保存待用.蛋白含量和抗氧化指標(GSH、SOD、CAT和MDA)測定均參考相應試劑盒說明書進行.

1.6 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差(Mean±SD),采用 SPSS15軟件進行單因素方差分析(onewayANOVA),處理組與對照組間差異顯著性檢驗采用Dunnet’t法,對應濃度納米ZnO和Zn2+處理組間差異顯著性檢驗采用LSD法、Turkey法. P＜0.05表示差異顯著.

2 結(jié)果

2.1 GSH變化

圖1 納米ZnO和Zn2+對斑馬魚胚胎GSH含量的影響Fig.1 Effects of nano-ZnO/Zn2+ on GSH contents of zebrafish embryos

由圖1可見,納米ZnO處理24h后斑馬魚胚胎GSH含量低于對照組, 50mg/L納米ZnO處理后斑馬魚胚胎GSH含量顯著降低; Zn2+處理24h后,斑馬魚胚胎 GSH含量低于對照組,但無顯著性差異.50mg/L納米ZnO處理48h后,斑馬魚胚胎GSH含量顯著降低;5.3mg/L Zn2+處理48h后,斑馬魚胚胎GSH含量顯著降低.納米ZnO處理72h后,斑馬魚胚胎無顯著差異;Zn2+處理72h后,斑馬魚胚胎GSH含量低于對照組,5.3mg/L Zn2+處理組 GSH含量顯著降低.在相同處理時間內(nèi),對應濃度納米ZnO和Zn2+處理組間斑馬魚胚胎GSH含量無顯著性差異.

2.2 SOD活性變化

由圖2可見,處理24h后,除1mg/L外,納米ZnO處理組斑馬魚胚胎SOD活性均顯著低于對照組;Zn2+處理組斑馬魚胚胎SOD活性隨Zn2+濃度增大而逐漸降低,3.6,5.3mg/L處理組SOD活性顯著降低. 處理48h后,納米ZnO和Zn2+處理組斑馬魚胚胎SOD活性表現(xiàn)出逐漸降低趨勢,但均無顯著性差異.處理72h后,納米ZnO處理組斑馬魚胚胎 SOD活性隨納米 ZnO濃度增大而降低,10,50mg/L處理組斑馬魚胚胎SOD活性顯著低于對照組; Zn2+處理組斑馬魚胚胎 SOD活性表現(xiàn)出逐漸降低趨勢,但與對照組無顯著性差異.對比實驗結(jié)果表明,在相同處理時間內(nèi),對應濃度納米ZnO和Zn2+處理組間斑馬魚胚胎SOD活性無顯著性差異.

圖2 納米ZnO和Zn2+對斑馬魚胚胎SOD活性的影響Fig.2 Effects of nano-ZnO/Zn2+ on SOD activities of zebrafish embryos

2.3 CAT活性變化

由圖3可見,處理24h后,納米ZnO處理組斑馬魚胚胎CAT活性逐漸降低,均顯著低于對照組; Zn2+處理組斑馬魚胚胎 CAT活性逐漸降低,3.6, 5.3mg/L處理組斑馬魚胚胎 CAT活性顯著低于對照組.處理48h后,納米ZnO處理組斑馬魚胚胎CAT活性低于對照組,其中5,10,50mg/L處理組CAT活性顯著低于對照組;Zn2+處理組CAT活性逐漸降低,3.6,5.3mg/L處理組CAT活性顯著低于對照組.處理72h后,納米ZnO和Zn2+處理組斑馬魚胚胎CAT活性均低于對照組,但無顯著性差異.實驗結(jié)果表明,1mg/L納米ZnO處理組斑馬魚胚胎CAT活性顯著低于0.6mg/L Zn2+處理組.

圖3 納米ZnO和Zn2+對斑馬魚胚胎CAT活性的影響.Fig.3 Effects of nano-ZnO/Zn2+ on CAT activities of zebrafish embryos

2.4 MDA含量變化

由圖4可見,處理24h后,納米ZnO處理組斑馬魚胚胎MDA含量逐漸升高,10,50mg/L處理組斑馬魚胚胎 MDA含量顯著高于對照組;Zn2+處理組斑馬魚胚胎 MDA含量均高于對照組, 6.3mg/L處理組MDA含量顯著升高.處理48 h后,納米ZnO處理組斑馬魚胚胎MDA含量逐漸增大,均顯著高于對照組,5.3mg/L Zn2+處理組斑馬魚胚胎 MDA含量顯著高于對照組;對比實驗發(fā)現(xiàn),1,5,10mg/L納米 ZnO處理組斑馬魚胚胎MDA含量均顯著高于對應濃度 Zn2+處理組(0.6,2.2,3.6mg/L).處理72h后,納米ZnO處理組斑馬魚胚胎 MDA含量逐漸增大,均顯著高于對照組,Zn2+處理組斑馬魚胚胎 MDA含量與對照組相比無顯著性差異;對比實驗結(jié)果表明,在處理48,72h后,10,50mg/L納米ZnO處理組斑馬魚胚胎 MDA含量均顯著高于對應濃度 Zn2+處理組(3.6和5.3mg/L).

圖4 納米ZnO和Zn2+對斑馬魚胚胎MDA含量的影響.Fig.4 Effects of Nano-ZnO/Zn2+ on MDA contents of zebrafish embryos

3 討論

本課題組[5]發(fā)現(xiàn),50,100mg/L納米ZnO導致斑馬魚胚胎死亡,1～25mg/L納米ZnO明顯抑制斑馬魚胚胎孵化,并導致幼魚體長變短和產(chǎn)生尾部畸形.對比實驗表明 Zn2+的釋放不能完全解釋納米ZnO所致斑馬魚胚胎毒性.本研究試圖從氧化應激角度探討納米ZnO毒作用機理.氧化應激是機體在遭受各種有害刺激時,體內(nèi)高活性分子如活性氧自由基(ROS)和活性氮自由基(RNS)產(chǎn)生過多,超過機體防御系統(tǒng)的清除能力,氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡,從而導致機體組織損傷,如脂質(zhì)過氧化、酶失活、DNA斷裂等[8].

GSH是一種具有特殊生物學功能的氨基酸衍生物,屬于含有巰基的小分子肽類物質(zhì).在外界刺激下,GSH會被誘導,清除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基,如果 GSH耗竭則導致機體產(chǎn)生中毒效應. Usenko等[9]發(fā)現(xiàn)在處理過程中加入谷胱甘肽前體(N-乙酰半胱氨酸 NAC)能夠降低富勒烯(C60)單獨處理引起的斑馬魚胚胎死亡率和心包囊腫現(xiàn)象,而加入谷胱甘肽合成抑制劑(丁硫氨酸硫酸亞胺BSO和馬來酸二乙酯DEM)卻能夠增大斑馬魚胚胎對 C60處理的敏感性.Zhu等[10]發(fā)現(xiàn)直接加入GSH能夠減輕C60處理引起的斑馬魚胚胎發(fā)育毒性,認為 C60通過氧化應激機制發(fā)揮其毒作用.本研究發(fā)現(xiàn),納米ZnO處理24h、48h和72h后,處理組胚胎GSH含量均發(fā)生不同程度降低現(xiàn)象,這一現(xiàn)象可能是由于納米ZnO處理導致受試胚胎體內(nèi)自由基增多,從而消耗體內(nèi)GSH,進而導致其含量降低.

SOD是一種清除超氧陰離子(O2-·)的特異性酶,能夠與 O2-·作用發(fā)生歧化反應,將其分解為H2O2和 O2,對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用.Sharma等[11]研究了納米 ZnO對人上皮細胞系(A431)的影響,發(fā)現(xiàn)納米ZnO能夠消耗GSH,降低CAT活性和SOD活性,引起氧化損傷,并進而引起A431細胞的基因毒性.朱小山等[12]發(fā)現(xiàn)長期低劑量富勒烯(C60)處理能夠引起鯽魚的氧化傷害,顯著降低鯽魚腦、肝臟、鰓組織中GSH含量,降低肝臟組織中CAT和SOD活性.本研究結(jié)果表明納米ZnO處理導致斑馬魚胚胎 SOD活性隨處理濃度增加呈現(xiàn)出降低趨勢,這些現(xiàn)象表明納米ZnO處理導致受試胚胎體內(nèi)O2-增多,超出了SOD酶清除能力,反過來抑制了SOD活性.

CAT是過氧化物酶體的標志酶,約占過氧化物酶體酶總量的40%,是一種酶類清除劑,可促使體內(nèi)H2O2分解為分子氧和水,使細胞免受H2O2的毒害,是生物防御體系的關鍵酶之一.Turkez等[13]發(fā)現(xiàn)納米TiO2能夠?qū)е氯巳入赘孰倪^氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽還原酶(GR)、CAT、SOD活性降低,誘發(fā)氧化應激并導致DNA損傷.Kalper等[14]發(fā)現(xiàn)氫化C60(hydrogenated C60, C60-Hx)、羥基化C60(hydroxylated C60,C60-OH)和納米TiO2能夠增大CAT活性,但攪拌制備和THF制備的nC60對CAT活性沒有影響,認為氧化應激標志物(如CAT, GST等)可用來預測納米材料的潛在毒性.Wang 等[15]發(fā)現(xiàn)[Gd@C82(OH)22]n能夠降低小鼠肝CAT和SOD活性.本研究中納米ZnO處理24h和48h能夠降低斑馬魚CAT活性,表明納米ZnO對CAT活性具有明顯的抑制作用.

MDA是生物膜中多種不飽和脂肪酸在氧自由基攻擊下形成的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量變化可反映出機體損傷的程度.SOD和GSH-Px活性的降低,可導致機體脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生,MDA含量增大. Wang等[16]發(fā)現(xiàn)硅納米粒子(20和50 nm)能夠誘導人胚胎腎細胞產(chǎn)生ROS,降低胞內(nèi)GSH含量,引起人胚胎腎細胞MDA含量增大,產(chǎn)生細胞毒性.Sayes等[17]發(fā)現(xiàn)C60處理48 h可導致人真皮纖維原細胞(HDF)、人肝癌細胞(HepG2)、人神經(jīng)膠質(zhì)細胞(NHA)MDA含量增大,細胞膜完整性受損,GSH含量增大.本研究中納米ZnO處理24h、48h和 72h,均導致受試斑馬魚胚胎 MDA含量增大,納米ZnO處理48h和72h后導致MDA含量均大于相應濃度Zn2+處理組,表明納米ZnO處理導致胚胎體內(nèi)細胞膜損傷, 氧化損傷程度大于相應濃度Zn2+處理組.

4 結(jié)論

4.1 納米ZnO對斑馬魚胚胎抗氧化指標均產(chǎn)生了不同程度的影響,表明納米ZnO對斑馬魚胚胎產(chǎn)生氧化損傷,進而引起斑馬魚胚胎生理機能改變,導致不能成功孵化.

4.2 對比實驗證明溶解釋放的 Zn對納米 ZnO毒性有一定的貢獻,是其毒作用機制之一.

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