劉志明,王海英,劉姍姍,蔣乃翔,馬大龍

(1.東北林業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院生物質(zhì)材料科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150040;2.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150040)

芳香植物 (aromatic plants)是含有較多芳香性物質(zhì) (精油或樹脂狀分泌物)的植物,包括全部香料植物、一部分藥用植物、一部分園藝植物 (芳香蔬菜、果樹和一部分觀賞植物)和一些尚沒有被開發(fā)利用的野生植物,是兼有藥用植物和香料植物共有屬性的植物類群。小蓬草[ConyzAcanadensis(L.)Cronq.](syn.Erigeron canadensisL.),菊科 (Compositae)白酒草屬一年生草本,原產(chǎn)于北美洲,現(xiàn)廣泛分布于世界各地。小蓬草具有濃郁芳香氣味,是一種芳香植物,嫩莖葉作飼料,全草或鮮葉入藥,可以提取精油[1-3]。植物精油可以在醫(yī)藥、食品、精細(xì)化工等方面具有廣闊應(yīng)用前景。植物精油除了可以作為食用香料和日用香料賦香之外,還具有殺菌、驅(qū)蟲、殺蟲等功效。近年來,有研究表明植物精油還具有除草作用,Tworkoski的研究結(jié)果表明肉桂 (Cinnam om um zeylanicum)精油具有較強(qiáng)的除草活性,而丁香酚 (eugenol)是該精油的主要成分[4]。植物源除草劑是近年來環(huán)境友好型除草劑的研究重點(diǎn),但形成商品的植物源除草劑還比較少,植物源除草劑的開發(fā)一般以具有化感作用 (allelopathy)的植物為靶標(biāo),研究其具有除草作用的活性成分,直接利用或進(jìn)行活性成分分子結(jié)構(gòu)修飾、結(jié)構(gòu)改造,開發(fā)新型除草劑?；凶饔檬侵参?(包括微生物)釋放化學(xué)物質(zhì)到外部環(huán)境,影響 (抑制或促進(jìn))鄰近植物 (異種個(gè)體或同種個(gè)體)的生長和發(fā)育。檢測(cè)化感物質(zhì)(allelochemicals)對(duì)受體植物種子萌發(fā)是化感物質(zhì)活性研究的一種常見方法,化感物質(zhì)對(duì)種子萌發(fā)的影響是植物化感作用研究的重要內(nèi)容,也是研究熱點(diǎn)[5-7]。小蓬草夏秋季易形成單種優(yōu)勢(shì)群落,影響其他植物生長,可以利用小蓬草的化感作用開發(fā)為環(huán)境友好型除草劑,但這方面的研究報(bào)道很少,曹慕嵐等的研究結(jié)果表明小蓬草體內(nèi)抗旱機(jī)制多種多樣,能夠適應(yīng)多種生境;小蓬草具有化感作用和生物毒性,其水浸提液對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞有絲分裂產(chǎn)生不同程度的抑制和損傷,具有明顯的遺傳毒性;新鮮小蓬草地上部分和地下部分水浸提液對(duì)受體植物水稻和油菜種子最終萌發(fā)及根長具有抑制作用[8-10]。Park等[11]研究了韓國小蓬草的揮發(fā)性組分。Choi等[12]的研究結(jié)果表明韓國小蓬草精油具有細(xì)胞毒性。許桂芳等[13]研究了小蓬草新鮮莖葉水浸提液(含有酚類物質(zhì))對(duì)小麥種子萌發(fā)和幼苗生長的抑制作用。高興祥等[14]研究了小蓬草全株干粉乙酸乙酯和乙醇提取物潛在的除草活性。本文研究通過氣相色譜 -質(zhì)譜 (gas chromatography-mass spectrometry)分析秋季小蓬草地上部分水蒸氣蒸餾精油的揮發(fā)性組分,選擇生長迅速、對(duì)藥劑反應(yīng)敏感的常用作測(cè)定除草劑活性的小粒種子植物試材油菜,借鑒除草活性初步篩選中適合小粒種子發(fā)芽常用的Weiss提出的紙上種子發(fā)芽測(cè)定標(biāo)準(zhǔn) (standard seed germination assay on paper)方法 (培養(yǎng)皿法)進(jìn)行生物測(cè)定,尋找新穎除草活性先導(dǎo)化合物,為開發(fā)高效、低毒、環(huán)境友好型除草劑提供仿生合成模板。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供體植物為小蓬草 (ConyzAcanadensis)地上部分,2008年 9月下旬采自黑龍江省哈爾濱市,東北林業(yè)大學(xué)城市林業(yè)示范基地,并經(jīng)東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林植物資源學(xué)植物標(biāo)本室鑒定。室溫下自然風(fēng)干備用。受體植物的種子為蘇州青油菜種子,購自哈爾濱市種子市場(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小蓬草地上部分精油的提取方法

稱取 30 g小蓬草地上部分干樣,剪成 1～2 cm小段,置于 500 mL三頸燒瓶中,水蒸氣蒸餾提取3 h。提取結(jié)束后,提取液每次用 50 mL乙醚萃取,共萃取兩次,合并乙醚層,加入適量無水 Na2SO4干燥 15 min,過濾后置于 40℃水浴下蒸干乙醚溶劑,得到淺黃色油狀精油。再用正己烷 (色譜純)將精油配制成濃度為 0.04 g/mL的溶液,進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜 (GC-MS)分析。

1.2.2 小蓬草地上部分精油的氣相色譜 -質(zhì)譜(GC-MS)分析方法

利用 GC/MS 6890N -5973insert(Agilent,USA),對(duì) 0.04 g/mL正己烷精油溶液進(jìn)行了氣質(zhì)聯(lián)用分析。分析條件如下:DB-17MS毛細(xì)管柱,柱長30 m,內(nèi)徑 0.25 mm,膜厚 0.25μm,F ID檢測(cè)器;初始溫度 60℃,停留 4 min,升溫速率 20℃/min,160℃停留 6 min后,再以 5℃/min的升溫速率升溫到 220℃,保持 2 min。進(jìn)樣口溫度 260℃,進(jìn)樣量 1.0μL,分流比 20∶1,氦氣載氣,流速 1 mL/min;質(zhì)譜連接口溫度:280℃,離子源溫度:230℃,轟擊電壓 70 eV,掃描檢測(cè)范圍:15～260 u。

1.2.3 小蓬草地上部分精油的紙上種子發(fā)芽試驗(yàn)方法

借鑒Weiss提出的紙上種子發(fā)芽測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)和國內(nèi)種子萌發(fā)測(cè)定方法[14-15],選取籽粒飽滿、大小均勻的受體植物油菜種子,置于鋪有兩層濾紙的已消毒直徑為 9 cm培養(yǎng)皿內(nèi),每皿各放置 10粒種子,分別加入 1 mL用丙酮 (不溶于水的植物天然產(chǎn)物常用溶劑)配制的 60 mg/mL的小蓬草地上部分精油(對(duì)照加 1 mL丙酮)和 9 mL蒸餾水,混合均勻,蓋好培養(yǎng)皿蓋。放在 HPG-280H人工氣候箱內(nèi) (25±1)℃黑暗培養(yǎng),以胚根或胚軸突破種皮 1～2 mm為種子發(fā)芽的標(biāo)準(zhǔn),3次重復(fù),每天觀察記錄發(fā)芽種子的數(shù)量,連續(xù)統(tǒng)計(jì) 7天。

配制 100 mg/mL小蓬草地上部分精油丙酮溶液,然后分別用丙酮稀釋成 50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL和 6.25 mg/mL的小蓬草地上部分精油丙酮溶液,按照上述方法進(jìn)一步研究不同濃度小蓬草地上部分精油丙酮溶液對(duì)受體植物油菜種子萌發(fā)的抑制作用。

配制 10 mg/mL小蓬草地上部分精油丙酮溶液,然后分別用丙酮稀釋成 5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL和 0.625 mg/mL的小蓬草地上部分精油丙酮溶液,按照上述方法進(jìn)一步研究不同濃度小蓬草地上部分精油丙酮溶液對(duì)受體植物油菜種子萌發(fā)的抑制作用。

1.2.4 小蓬草地上部分精油的紙上種子發(fā)芽試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析方法

根據(jù)記錄的數(shù)據(jù)計(jì)算下列參數(shù)[9,16]:(1)最終發(fā)芽率 (Final Germination,FG)FG=發(fā)芽種子總數(shù) /供試種子總數(shù);(2)化感效應(yīng)敏感指數(shù) (Index of Allelopathic Effect,R I)R I=1-C/T(T≥C),R I=T/C-1(T

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用 SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,對(duì)各參數(shù)在不同處理之間的差異進(jìn)行一維方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小蓬草地上部分精油的氣相色譜 -質(zhì)譜 (GC-MS)結(jié)果與分析

小蓬草地上部分精油揮發(fā)性組分氣相色譜 -質(zhì)譜 (GC-MS)的總離子流色譜圖經(jīng)計(jì)算機(jī)質(zhì)譜庫自動(dòng)檢索、解析和部分化合物的人工解析,匹配度 74以上的 10種物質(zhì)被鑒定,通過面積歸一化法計(jì)算各化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù),小蓬草地上部分精油揮發(fā)性組分列于表1。

表1 小蓬草地上部分精油的揮發(fā)性組分

從表1可以看出小蓬草地上部分精油揮發(fā)性組分中,烴類化合物 4種,醇類化合物 4種,酮類化合物 2種,含氮類化合物 1種,匹配度 74以上的 10種物質(zhì)被鑒定,小蓬草地上部分精油揮發(fā)性組分中,檸檬烯、α-佛手柑油烯、順式 -β-麝子油烯、α-姜黃烯、反式 -對(duì) -薄荷 -2,8-二烯醇、順式 -對(duì) -薄荷 -2,8-二烯 -1-醇、香芹醇、反式香芹醇、s-香芹酮在波蘭干小蓬草個(gè)體發(fā)育不同階段的水蒸餾 (hydrodistillation)5 h全草精油 (herb oil)中被檢測(cè)到[17],有研究表明,萜類化合物、酚類化合物、直鏈醇、脂肪族醛和酮等具有化感作用[7,18-20],小蓬草地上部分精油具有開發(fā)為植物源除草劑的潛力。

從表1保留時(shí)間 16.323 min的質(zhì)譜人工解析可知,質(zhì)量差規(guī)律的判斷依據(jù):最高質(zhì)量峰與其他碎片離子質(zhì)量差,如出現(xiàn)以下質(zhì)量差,4到 13,19到 25(含氟化合物例外),37,38,50到 53,65,66,則最高質(zhì)量峰不是分子離子峰。另外如差為 14的情況出現(xiàn),應(yīng)考慮是否有同系物出現(xiàn),該質(zhì)譜中質(zhì)量數(shù)最高的峰是 m/z 174(偶數(shù) ),與 m/z 159(奇數(shù) )相差15 u,為失去合理中性物,因此可以認(rèn)定 m/z 174為分子離子峰。因其余碎片峰 (m/z)都是奇數(shù),可知該分子離子的碎片峰為分子離子單純的斷裂反應(yīng)(脫掉中性自由基),根據(jù)“氮素原則”,凡不含 N原子或含有偶數(shù)個(gè)N原子的化合物,分子離子的質(zhì)荷比應(yīng)為偶數(shù) (或相對(duì)分子質(zhì)量是偶數(shù))。如果含有偶數(shù)個(gè)N原子,質(zhì)譜中出現(xiàn)m/z 77,51,39等弱的碎片離子峰,表明化合物含有苯基;m/z 89表明苯基上有一個(gè)含碳的取代基。相對(duì)分子質(zhì)量M=174的分子離子峰,離子失去碎片的情況有:M-43失去的中性碎片為 NHCO,高度分支碳鏈分支處有環(huán)酰胺;M-31失去的中性碎片為 CH2NH2;M-15失去的中性碎片為 CH3,高度分支的碳鏈,在分支處甲基裂解 (側(cè)鏈甲基)[21-24],結(jié)合計(jì)算機(jī)質(zhì)譜庫自動(dòng)檢索,初步判定為 2,4-二氫 -2-甲基 -5-苯基 -3氫-吡唑 -3-酮,但有待于進(jìn)一步分離、提純、鑒定。

2.2 小蓬草地上部分精油紙上種子發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)果與分析

60 mg/mL的小蓬草地上部分精油對(duì)受體植物油菜種子萌發(fā)的影響,100 mg/mL、50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL和 6.25 mg/mL 5個(gè)不同濃度丙酮溶液的小蓬草地上部分精油對(duì)受體植物油菜種子萌發(fā)的影響,10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL和 0.625 mg/mL 5個(gè)不同濃度丙酮溶液的小蓬草地上部分精油對(duì)受體植物油菜種子萌發(fā)的影響測(cè)試結(jié)果均列于表2。

表2 小蓬草地上部分精油對(duì)受體植物油菜種子萌發(fā)的影響

從表2可以看出,60 mg/mL的小蓬草地上部分精油對(duì)受體植物油菜種子萌發(fā)具有抑制作用,且與對(duì)照相比差異極顯著。100 mg/mL、50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL和 6.25 mg/mL 5個(gè)不同濃度丙酮溶液的小蓬草地上部分精油對(duì)受體植物油菜種子萌發(fā)均具有抑制作用,且與對(duì)照相比差異極顯著。10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL和0.625 mg/mL 5個(gè)不同濃度丙酮溶液的小蓬草地上部分精油對(duì)受體植物油菜種子萌發(fā)均具有抑制作用,且與對(duì)照相比差異極顯著。小蓬草地上部分精油抑制油菜種子發(fā)芽 50%抑制劑濃度 IC50(inhibitor concentration causing 50%inhibition)為0.6 mg/mL。

種子發(fā)芽指數(shù)是從置床開始算起的,發(fā)芽指數(shù)高就說明該種子發(fā)芽所用的時(shí)間短,發(fā)芽速度快。從表2可以看出,小蓬草地上部分精油處理的受體植物油菜種子發(fā)芽指數(shù)均低于對(duì)照種子發(fā)芽指數(shù),說明小蓬草地上部分精油處理抑制了受體植物油菜種子發(fā)芽速度。

綜合以上分析,可以看出小蓬草地上部分精油主要是通過抑制受體植物油菜種子發(fā)芽速度進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抑制其種子萌發(fā),活性組分有檸檬烯、α-佛手柑油烯、順式 -β-麝子油烯等萜類化合物,反式 -對(duì)-薄荷 -2,8-二烯醇、順式 -對(duì) -薄荷 -2,8-二烯 -1-醇、香芹醇、反式香芹醇等醇類化合物,s-香芹酮等酮類化合物,2,4-二氫 -2-甲基 -5-苯基 -3氫 -吡唑 -3-酮為第一主成分,有望作為除草劑仿生合成模板,需進(jìn)一步分離、提純、鑒定。

3 結(jié) 論

小蓬草地上部分精油對(duì)受體植物油菜種子萌發(fā)具有 50%抑制作用的丙酮溶液的適宜濃度 IC50為0.6 mg/mL。小蓬草地上部分精油對(duì)受體植物油菜種子萌發(fā)具有抑制作用的活性組分匹配度 74以上的有檸檬烯、α-佛手柑油烯、順式 -β-麝子油烯、反式 -對(duì) -薄荷 -2,8-二烯醇、順式 -對(duì) -薄荷 -2,8-二烯 -1-醇、香芹醇、反式香芹醇、s-香芹酮等化合物。2,4-二氫 -2-甲基 -5-苯基 -3氫 -吡唑 -3-酮為第一主成分,有望作為除草劑仿生合成模板,需進(jìn)一步分離、提純、鑒定。參考文獻(xiàn):

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食鹽，很多初學(xué)者對(duì)食鹽作為面包配方中的基本原料很是不解。食鹽可以增加面包的風(fēng)味；可以強(qiáng)化面筋，保持面團(tuán)彈力，加強(qiáng)面團(tuán)的保氣能力；控制面團(tuán)發(fā)酵速度，讓面團(tuán)在發(fā)酵過程中能均勻膨脹。食鹽還可以中和糖的甜味，在含糖量高的面包配方中，可以適當(dāng)增加食鹽的用量。但是過量的食鹽不僅能讓面包很咸，也會(huì)抑制酵母的生長繁殖，因此食鹽在面包中的添加量通常為1%～2%（以面粉計(jì)）。

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