鐵皮石斛腋芽的快速繁殖

何 濤,淳 澤,汪天杰,鄭若劫

(中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所,四川成都 610041)

鐵皮石斛 (Dendrobium officinale Kimura et Migo)既是傳統(tǒng)名貴中藥,又是國(guó)家保護(hù)植物。為了做到保護(hù)與開(kāi)發(fā)并舉,通常利用組織培養(yǎng)的方法快速繁殖獲得種苗,為人工栽培提供種源。在前人對(duì)鐵皮石斛快速繁殖的報(bào)道中,多集中以種子、莖尖、莖段等為外植體,并通過(guò)原球莖的增殖與分化來(lái)繁殖種苗[1-7]。其中存在的問(wèn)題是用種子繁殖的后代有可能產(chǎn)生變異;莖尖作為外植體會(huì)散失母株,莖段由于自身帶菌嚴(yán)重,會(huì)消毒不徹底。并有研究表明[8]由于石斛的特殊性,在石斛的組織培養(yǎng)中,外植體的選擇是十分關(guān)鍵的因素,不同的取材部位和時(shí)期,培養(yǎng)的結(jié)果也不一樣,并且其他外植體形成的試管苗比種子試管苗成株快,莖粗,苗壯,易成活。而直接取材于腋芽作為外植體,不僅取材更方便,并且不傷母株的莖,能保留莖的完整性。目前對(duì)鐵皮石斛腋芽直接培養(yǎng)誘導(dǎo)成苗的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)擬直接取材于鐵皮石斛的腋芽作為外植體,直接誘導(dǎo)叢芽,比較不同種類(lèi)、濃度的激素組合和不同的天然提取物對(duì)腋芽的存活生長(zhǎng)、叢芽的誘導(dǎo)增殖以及成苗的影響,研究和探索叢生芽途徑成苗的數(shù)量以及質(zhì)量,篩選各時(shí)期的最佳培養(yǎng)基配方,從而建立叢生芽途徑的高效快速繁殖體系,使通過(guò)快速繁殖獲得的植株能與母株保持遺傳上的一致性,為鐵皮石斛野生居群的恢復(fù)提供材料,達(dá)到保護(hù)野生資源的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料鐵皮石斛 (D.officinale)采自貴州荔波、三都,廣西樂(lè)業(yè)、永福,種植于本所苗圃。

1.2 方法

當(dāng)鐵皮石斛植株莖節(jié)間新長(zhǎng)出腋芽長(zhǎng) 0.5～1.0 cm時(shí),用刀片小心切下完整腋芽,自來(lái)水沖洗干凈。在超凈工作臺(tái)上,材料先用 75%酒精浸泡30 s后,0.1%升汞消毒 10 min,無(wú)菌蒸餾水浸洗 4次,每次 5 min。多余水分用無(wú)菌濾紙吸干。最后將材料接種在試驗(yàn)培養(yǎng)基上。

以MS為基本培養(yǎng)基,分別添加不同種類(lèi)和濃度的NAA、BA以及不同的天然提取物香蕉汁 100 g/L或馬鈴薯 200 g/L,蔗糖 3%,瓊脂 7 g/L,pH 5.8～6.0,高壓滅菌 20～25 min。培養(yǎng)室溫度 (26±2)℃,以日光燈為光源,光照強(qiáng)度 2000 lx,每天光照12 h。

材料接種培養(yǎng)后,隨時(shí)觀(guān)察腋芽的成活生長(zhǎng)、叢生芽的誘導(dǎo)增殖以及試管苗的健壯情況,并定期統(tǒng)計(jì)腋芽成活率、叢生芽的誘導(dǎo)增殖倍數(shù)和叢芽個(gè)數(shù),同時(shí)對(duì)出瓶試管苗的莖粗、莖高、葉片數(shù)、葉色以及根數(shù)等形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行了調(diào)查。

2 結(jié) 果

2.1 不同激素組合對(duì)腋芽成活生長(zhǎng)的影響

基本培養(yǎng)基為 1/2MS,將添加不同種類(lèi)和濃度的NAA、BA對(duì)腋芽的成活生長(zhǎng)情況列于表1中。由表1可見(jiàn),當(dāng)培養(yǎng)基中沒(méi)有添加任何激素時(shí),培養(yǎng)60天后,有 50%的腋芽仍保持成活,但基本維持原來(lái)狀態(tài),沒(méi)有進(jìn)一步的生長(zhǎng)。而有 50%的腋芽會(huì)逐漸變黃褐化而死亡。培養(yǎng)基中添加激素后,腋芽開(kāi)始伸長(zhǎng)生長(zhǎng),并分化出葉。只是激素比例不同,腋芽萌發(fā)生長(zhǎng)的時(shí)間、存活率有所差異。如果只添加NAA,腋芽成活率只有 33.3%。當(dāng) NAA和 BA濃度相同或大于 BA時(shí),腋芽最長(zhǎng) 0.5 cm,成活率分別為42.5%和 50%。當(dāng) BA濃度大于 NAA時(shí),腋芽萌動(dòng)時(shí)間最早,培養(yǎng) 10天就可見(jiàn)腋芽變粗、伸長(zhǎng),60天后,長(zhǎng)度可達(dá) 1.5～1.8 cm,長(zhǎng)出 3片葉,并且成活率為 100%。以上結(jié)果表明,最適合石斛腋芽接種后成活生長(zhǎng)的培養(yǎng)基為:1/2MS+NAA 0.2 mg/L+BA 1 mg/L。

表1 不同激素組合對(duì)腋芽成活生長(zhǎng)的影響

2.2 不同 BA與香蕉汁組合對(duì)叢生芽誘導(dǎo)增殖的作用

在腋芽繼續(xù)伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的同時(shí),其基部不斷有新的叢生芽發(fā)生。表2列出了培養(yǎng)基中添加天然提取物香蕉汁和不同濃度的細(xì)胞分裂素BA對(duì)叢生芽誘導(dǎo)增殖的影響。由表2可見(jiàn),加入香蕉汁后發(fā)生叢生芽的時(shí)間提前,并能提高芽的增殖倍數(shù),有利于鐵皮石斛叢生芽的誘導(dǎo)與增殖。在生長(zhǎng)素 NAA濃度相同 (0.5 mg/L)的情況下,隨著 BA濃度的不斷增加,增殖倍數(shù)不斷提高,當(dāng) BA濃度為 2.0 mg/L時(shí),培養(yǎng) 160 d,增殖倍數(shù)達(dá)最大值 14.0,平均增殖倍數(shù)也是最高的,為 6.4,1個(gè)腋芽能增殖的最多叢芽數(shù)高達(dá) 111個(gè)。但 BA濃度超過(guò) 2.0 mg/L,為 5.0 mg/L時(shí),增殖倍數(shù)又呈下降趨勢(shì)。本試驗(yàn)表明NAA和 BA適當(dāng)組合能較大程度的提高增殖倍數(shù),促進(jìn)叢生芽的誘導(dǎo)與增殖。其最適培養(yǎng)基為 1/2MS+NAA 0.5 mg/L+BA 2.0 mg/L+香蕉汁 100 g/L。從表2還可以看出,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),增殖倍數(shù)也呈逐漸提高趨勢(shì)。

表2 不同 BA與香蕉汁組合對(duì)叢生芽誘導(dǎo)增殖的作用

2.3 天然提取物對(duì)叢生芽生長(zhǎng)成苗的影響

叢生芽轉(zhuǎn)到新的培養(yǎng)基中,經(jīng)過(guò) 2～3個(gè)月的壯苗培養(yǎng),形成試管苗。表3表明,當(dāng)培養(yǎng)基中沒(méi)有添加任何天然提取物時(shí),叢生芽長(zhǎng)成的試管苗纖細(xì)、矮小,葉色淡綠,葉片數(shù)少,每苗根數(shù)較少。只有13.2%的試管苗達(dá)到優(yōu)質(zhì)苗的標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)培養(yǎng)基中添加了香蕉汁或馬鈴薯汁時(shí),試管苗的質(zhì)量得到明顯改善,90%以上的試管苗為優(yōu)質(zhì)苗。莖高為 6～14 cm,莖粗為 0.2～0.4 cm,葉色濃綠或淡綠,葉片數(shù)增加到 5～9片,每株苗根數(shù)增多為 5～9條。本試驗(yàn)表明天然提取物香蕉汁或馬鈴薯汁均有利于壯苗、生根。

表3 天然提取物對(duì)叢生芽生長(zhǎng)成苗的影響

3 討 論

曾有報(bào)道 NAA與 BA適當(dāng)配合可促進(jìn)石斛叢生芽的誘導(dǎo)與增殖[9]。本試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn),只是最佳比例組合有所不同,前人報(bào)道的最適組合為 NAA 1 mg/L,BA 3 mg/L。我們?cè)囼?yàn)的鐵皮石斛叢生芽誘導(dǎo)與增殖的最佳比例為NAA 0.5 mg/L,BA 2.0 mg/L,這可能與培養(yǎng)的石斛種類(lèi)不同有關(guān)。另有研究表明[10],在培養(yǎng)基中添加天然提取物椰子汁有利于叢芽的增殖,我們實(shí)驗(yàn)也表明當(dāng)添加另外的天然提取物香蕉汁也同樣有利于叢芽的增殖。

本試驗(yàn)還特別對(duì)試管苗的根、莖、葉等形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行了調(diào)查,并與生產(chǎn)中鐵皮石斛種苗的等級(jí)進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加天然提取物香蕉汁或馬鈴薯汁均能獲得優(yōu)質(zhì)苗。優(yōu)質(zhì)苗的獲得為成功移栽奠定了材料基礎(chǔ)。

同時(shí),通過(guò)叢生芽途徑建立的快繁體系,也使鐵皮石斛優(yōu)質(zhì)試管苗的數(shù)量得到極大提高,在合適的培養(yǎng)基上,叢生芽誘導(dǎo)的最大增殖倍數(shù)可達(dá) 14.0。以平均增殖倍數(shù) 6.4計(jì)算,如果 1個(gè)芽 1年繼代培養(yǎng) 5次,可獲得 6.45=10737.4個(gè)芽,培養(yǎng) 100個(gè)腋芽就可以獲得 100萬(wàn)個(gè)左右的叢生芽,進(jìn)而可獲得100萬(wàn)叢試管苗。與分株繁殖相比,大大提高了繁殖系數(shù)。

瀕危植物鐵皮石斛高效快繁體系的建立為規(guī)?；a(chǎn)提供了技術(shù)上的可能性。其深遠(yuǎn)意義不僅僅是規(guī)?；a(chǎn)的種苗依靠人工栽培來(lái)滿(mǎn)足市場(chǎng)需求,產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)效益,并且規(guī)模繁殖成功還可以增加野生居群數(shù)量,有利于野生居群的恢復(fù),產(chǎn)生良好的社會(huì)效益和生態(tài)效益。

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