HCV HLA-A2限制性復(fù)合多表位基因的構(gòu)建、克隆表達(dá)及其免疫特性分析①

韋三華 董 軻 林 芳 王 希 李 斌 沈建軍 張利軍 劉昕陽(yáng) 張惠中

（西安第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)、輸血科,西安 710038）

HCV HLA-A2限制性復(fù)合多表位基因的構(gòu)建、克隆表達(dá)及其免疫特性分析①

韋三華 董 軻 林 芳 王 希 李 斌 沈建軍 張利軍 劉昕陽(yáng) 張惠中②

（西安第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)、輸血科,西安 710038）

目的:構(gòu)建丙型肝炎病毒（HCV）HLA-A2限制性復(fù)合多表位基因的原核表達(dá)載體,表達(dá)純化,并觀察其免疫原性。方法:分別合成HCV HLA-A2限制性多表位基因、人泛素基因,串聯(lián)后得到融合基因Ub-Mep,克隆入原核表達(dá)質(zhì)粒pRSETA,轉(zhuǎn)化E.coliBL21,IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá),薄層掃描分析表達(dá)蛋白組成;可溶性分析后用Ni2+-NTA凝膠親和層析柱純化、透析并濃縮融合蛋白;Western blot分析純化蛋白的特異性和抗原性;免疫小鼠分析其免疫原性。結(jié)果:成功構(gòu)建復(fù)合多表位抗原基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pRSET-Ub-Mep,目的基因可高效表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在,Ni2+-NTA純化可獲得目的蛋白,純化蛋白具有良好的抗原性和免疫原性。結(jié)論:成功構(gòu)建HCVHLA-A2限制性復(fù)合多表位基因并進(jìn)行原核表達(dá),表達(dá)的多表位基因抗原具良好的免疫原性,為進(jìn)一步的HCV A2限制性復(fù)合多表位誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答研究奠定基礎(chǔ)。

丙型肝炎病毒（HCV）;CTL;表位;表達(dá)

1 材料與方法

1.1 材料 原核表達(dá)載體pRSET-A、菌種DH5α、BL21均由本室保存;Trizol試劑購(gòu)于Gibco BRL公司;脂質(zhì)體購(gòu)于Invitrogen公司;Taq DNA聚合酶、內(nèi)切酶購(gòu)于TaKaRa公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Promega公司;Ni2+-NTA凝膠親和層析柱購(gòu)自Qiagen公司;RPM IMedium 1640培養(yǎng)基、異硫氰酸熒光素標(biāo)記的羊抗人IgG抗體、HRP標(biāo)記羊人IgG、DNA分子標(biāo)準(zhǔn)和低分子蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分別購(gòu)自華美生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 HCV HLA-A2限制性復(fù)合多表位基因的構(gòu)建

1.2.1.1 人泛素基因合成 根據(jù)人泛素基因序列（GeneBank:M 17524）。合成泛素基因,同時(shí)在上游引入BamHⅠ酶切位點(diǎn),并在ATG前加一個(gè)kozak序列,下游引入PstⅠ酶切位點(diǎn),并將第76位氨基酸進(jìn)行替換（G acc變A tgc）,全序列252 bp,交由北京奧科公司合成,克隆入pMD19-TSimple載體,記作Ub。

1.2.1.2 多表位基因的合成 選擇4個(gè)CTL優(yōu)勢(shì)表位和一個(gè)CD4+Th表位（表1）,每個(gè)表位兩端各保留三個(gè)氨基酸,各表位間用AAY分隔連接,后端增加信號(hào)肽基序,以便于各表位保持獨(dú)立性和能夠有效呈遞。5′和3′端分別引入PstⅠ和 HindⅢ酶切位點(diǎn)。全序列285 bp,交由北京奧科公司合成,得到多表位基因成表位序列,克隆入pMD19-TSimple載體,計(jì)作記作Mep。

1.2.1.3 多表位基因表達(dá)載體的構(gòu)建 原核表達(dá)載體為pRSET-A,先將泛素基因Ub用BamHⅠ/PstⅠ雙酶切后插入到pRSET-A載體中的相應(yīng)位點(diǎn),構(gòu)建pRSET-Ub重組原核表達(dá)載體;再將多表位基因Mep用PstⅠ/HindⅢ雙酶切后插入到pRSET-A載體中的相應(yīng)位點(diǎn),構(gòu)建成pRSET-Ub-Mep重組原核表達(dá)載體,不改變其編碼區(qū)的框架結(jié)構(gòu)。重組質(zhì)粒的鑒定采用雙位點(diǎn)單酶切鑒定,酶切鑒定得到的陽(yáng)性克隆,送TaKaRa公司進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定,用生物軟件pcgene分析匯總結(jié)果。

表1 表位基因位置及氨基酸組成Tab.1 Source,position,and sequence of epitopeam ino acid

1.2.2 HCV HLA-A2限制性復(fù)合多表位基因原核表達(dá)

1.2.2.1 目的蛋白表達(dá)和可溶性分析 重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,挑取單菌落（同時(shí)設(shè)空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21為對(duì)照）,置5ml LB培養(yǎng)液中（含氨芐青霉素50 g/L）,37℃振搖過(guò)夜,次日1∶100轉(zhuǎn)接5m l LB培養(yǎng)液中37℃振搖3小時(shí),A600約0.4～0.6時(shí)加入IPTG至終濃度1mmol/L,繼續(xù)振搖4～5小時(shí),離心收菌。用PBS（pH8.0）懸浮離心收集的細(xì)菌,加入溶菌酶至終濃度0.1 r/min/L,4℃放置20分鐘,超聲破碎,4℃下10 000 r/min離心10分鐘,收集上清和沉淀,分別加入等體積的2×樣品緩沖液,沸水中加熱5分鐘,12 000 r/min離心5分鐘,取上清,每孔15μl進(jìn)行SDS-PAGE電泳,電泳在恒壓下進(jìn)行（濃縮膠中為160 V,分離膠中為120 V）。電泳結(jié)束后,將凝膠浸泡于考馬斯亮藍(lán)染色液中染色2小時(shí),然后用脫色液脫色至背景清晰。薄層掃描分析目的蛋白表達(dá)帶占菌體蛋白百分比。

1.2.2.2 表達(dá)蛋白的純化 參照Qiagen公司鎳離子親和層析柱（Ni2+-NTA）操作說(shuō)明進(jìn)行。首先離心收集1 L誘導(dǎo)宿主菌,冰浴15分鐘;按5 L/kg濕菌的比例加入含8 mol/L尿素 的Buffer B（pH8.0）,室溫下輕輕攪拌使細(xì)菌裂解至溶液清亮,4℃下10 000 r/min離心收集上清,棄去沉淀;將1m lNi2+-NTA樹(shù)脂懸浮液與一定量清亮裂解上清于室溫輕柔搖動(dòng)混勻（100 r/min搖動(dòng)15～60分鐘）后,將其混合液裝柱 ;依次用 Buffer C（pH6.3）、Buffer D（pH5.9）、Buffer E（pH4.5）洗脫,分別收集洗脫液。取各部分樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.2.3 Western blot檢測(cè)表達(dá)蛋白 將純化蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,然后將蛋白質(zhì)進(jìn)行電轉(zhuǎn)移至NC膜上（濾膜孔徑0.22μm,轉(zhuǎn)移條件為恒流100V,1小時(shí)）。用丙型肝炎陽(yáng)性患者混合血清（來(lái)自唐都醫(yī)院檢驗(yàn)科）作為一抗,HRP-羊抗人IgG作為二抗,DAB（0.6 g/L）顯色,至目的條帶染色清晰時(shí)終止反應(yīng)。

1.2.3 HCV HLA-A2限制性復(fù)合多表位抗原免疫原性分析 表達(dá)蛋白用適量的PBS溶解,腹部皮下多點(diǎn)注射免疫6周齡BALB/c小鼠,劑量為100μg/（只·次）。隔兩周加強(qiáng)免疫一次,共免疫3次。對(duì)照組小鼠每次用 PBS 免疫。免疫后第 0、2、4、6、8、10周尾靜脈采集小鼠血清,-20℃凍存。用包被緩沖液將表達(dá)蛋白稀釋到0.01μg/μl,每孔100μl包被微孔板,濕盒中4℃過(guò)夜。PBST（PBS,0.1%Tween20）洗滌后用封閉液（PBST,50 g/L脫脂奶粉）室溫封閉1小時(shí)。PBST洗滌后拍干,每孔加入封閉液1∶100稀釋的小鼠血清100μl,濕盒中37℃孵育1小時(shí),PBST洗滌、拍干,加入以封閉液 1∶10 000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG 100μl,濕盒中37℃孵育1小時(shí)。PBST洗滌、拍干,每孔加入顯色液（OPD 5mg pH 7.5檸檬酸鹽緩沖液12.5ml,H2O 25μl）100μl,37℃孵育 10～20分鐘,每孔加1滴2 mol/L硫酸終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀測(cè)定OD490。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定 pRSET-Ub-Mep經(jīng)BamHⅠ+HindⅢ雙酶切得到537 bp的預(yù)期片段（圖1）。酶切鑒定的陽(yáng)性克隆,經(jīng)測(cè)序,與設(shè)計(jì)序列完全一致。表明目的基因成功克隆入真核表達(dá)載體。

2.2 目的蛋白的表達(dá)與溶解形式分析 將重組質(zhì)粒pRSET-Ub-Mep轉(zhuǎn)化的BL21菌株用1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)后,收集菌體,溶菌酶作用后進(jìn)行超聲破碎,離心后分別收集沉淀和上清,經(jīng)SDSPAGE電泳檢測(cè),在約20 kD處有一明顯的條帶,與預(yù)期的融合蛋白大小一致。該融合蛋白以包涵體形式存在于沉淀中,上清液中幾乎無(wú)誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白。薄層掃描顯示其占菌體蛋白的25%（圖2）。

2.3 融合蛋白的表達(dá)及純化 用8mol/L尿素裂解菌體,然后將裂解上清通過(guò)Ni2+-NTA柱,收集各部分洗脫液。取少量B表達(dá)蛋白包涵體、8mol/L尿素裂解上清、Buffer B（pH8.0）、Buffer C（pH6.3）、Buffer D（pH5.9）、Buffer E（pH4.5）洗脫液進(jìn)行 SDSPAGE,電泳結(jié)果顯示目的蛋白在Buffer E（pH 4.5）洗脫液中,掃描顯示純度在90%以上（圖3）。

圖1 重組質(zhì)粒pRSET-Ub-M ep的酶切鑒定Fig.1 Restrictive enzyme digestion analysis of pRSET-Ub-Mep

2.4 表達(dá)蛋白的Western blot結(jié)果 純化后的蛋白透析、包埋濃縮后取少量該蛋白和未誘導(dǎo)菌體蛋白行SDS-PAGE,然后電轉(zhuǎn)移至NC膜上。用HCV陽(yáng)性患者血清作為一抗,同時(shí)以正常人血清為對(duì)照,HRP-羊抗人IgG為二抗,DAB顯色后,預(yù)期大小處可見(jiàn)條帶染色清晰,純化的蛋白很好地保持了與HCV陽(yáng)性患者血清的結(jié)合活性（圖4）。

2.5 表達(dá)蛋白免疫原性分析 融合蛋白免疫BALB/c小鼠 3次后,ELISA分析小鼠抗體產(chǎn)生情況,結(jié)果顯示（圖5）,3次免疫后,表達(dá)蛋白可在小鼠中誘發(fā)較高水平的抗體應(yīng)答,其血清中的特異性抗體滴度平均為1∶640。說(shuō)明表達(dá)蛋白具有良好的免疫原性。而生理鹽水陰性對(duì)照組的小鼠血清抗體為陰性。

圖2 表達(dá)蛋白SDS-PAGE和溶解形式分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of fusion protein expression

圖3 N i2+-NTA凝膠純化表達(dá)蛋白洗脫圖Fig.3 Purification of the expressed protein in Ni2+-NTA column

圖4 表達(dá)蛋白的W estern blot分析Fig.4 Western b lot of expressed protein

圖5 免疫小鼠誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答Fig.5 Antibody response in m ice immunized w ith expressed protein

3 討論

丙型肝炎病毒（HCV）是慢性肝炎、肝硬化等慢性肝病的主要致病因子之一,其感染后極易慢性化,而發(fā)展為肝硬化和肝癌的幾率遠(yuǎn)高于乙型肝炎病毒。HCV感染已成為嚴(yán)重危害公眾健康的感染性疾病之一。目前對(duì)于HCV感染的治療,主要為peg-IFN-α聯(lián)合利巴韋林,但其臨床有效率尚不足50%,而且副作用很大,花費(fèi)昂貴。亟需發(fā)展有效的預(yù)防性和治療性疫苗以防止其傳播。

HCV感染后,機(jī)體針對(duì)病毒產(chǎn)生了由中和抗體、CD4+輔助 T細(xì)胞和CD8+細(xì)胞毒性 T細(xì)胞（CTL）介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。由于使用缺乏校對(duì)功能的RNA依賴(lài)的RNA多聚酶及HCV感染后快速?gòu)?fù)制可產(chǎn)生HCV各種準(zhǔn)類(lèi)群（準(zhǔn)種）,使HCV能夠逃逸宿主的免疫應(yīng)答;另外,由于存在中和抗原位點(diǎn)的E區(qū)基因高度變異（HRV1和HRV2）,也使機(jī)體產(chǎn)生的中和抗體缺乏保護(hù)力,不能有效地清除病毒。這些可能都是造成HCV持續(xù)感染的原因。研究發(fā)現(xiàn),HCV感染的患者若能在感染的早期產(chǎn)生較強(qiáng)的針對(duì)HCV各個(gè)蛋白的多表位特異性CTL,則患者的感染多表現(xiàn)為自限性[1],且病毒的清除與應(yīng)答的強(qiáng)度、廣度和維持時(shí)間有關(guān)[3];而當(dāng)患者特異性CTL的活性較低或僅針對(duì)個(gè)別表位時(shí),則可導(dǎo)致HCV感染的持續(xù)狀態(tài),并可造成肝組織的慢性損傷。黑猩猩感染實(shí)驗(yàn)也表明,CD8+T細(xì)胞在病毒清除和阻止慢性化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,但同時(shí)CD4+輔助T細(xì)胞在CD8+T細(xì)胞清除病毒過(guò)程中也發(fā)揮著不可或缺的作用,缺乏CD4+輔助T細(xì)胞的作用,CD8+T細(xì)胞清除病毒的水平將大大下降,而且HCV感染復(fù)發(fā)的保護(hù)免疫依賴(lài)于CD4+和CD8+記憶性T細(xì)胞[4]。Form等[5]發(fā)現(xiàn)NS3特異性CD4+T細(xì)胞免疫反應(yīng)對(duì)于病毒的清除似乎是必需的。近年來(lái)利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體為載體的HCV NS3上CD4+輔助性T細(xì)胞表位疫苗,也誘導(dǎo)出顯著的Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答[6]。細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng),尤其是CD8+T細(xì)胞應(yīng)答,在防御HCV慢性感染中有重要的作用。因此建立強(qiáng)大的多位點(diǎn)特異性細(xì)胞免疫是克服HCV免疫逃逸及發(fā)展HCV實(shí)驗(yàn)疫苗的首選策略。

多表位疫苗的顯著特點(diǎn)是能有效應(yīng)付病原微生物的變異和免疫反應(yīng)中的一些不利因素,在誘生細(xì)胞免疫方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),可發(fā)展成為多價(jià)疫苗。因此,多表位疫苗已成為疫苗的研究熱點(diǎn)之一,并已在HIV、HBV、HPV和黑色素瘤等多種高變異的病原體及腫瘤疫苗中進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)性的探索,取得了令人滿意的結(jié)果[7-9]。通過(guò)在表位間增加間隔、進(jìn)行氨基酸替換和引入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)肽基序,以及表位與泛素相連,把疫苗編碼的蛋白導(dǎo)入泛素-蛋白酶體途徑等,使各表位能夠被有效呈遞,誘導(dǎo)表位特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答[7,10-13]。

我們將四個(gè)HCV保守的CTL表位和一個(gè)CD4+表位串聯(lián),前端添加人泛素序列,后端添加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)肽序列。人泛素引物設(shè)計(jì)時(shí)引入在ATG前增加一個(gè)kozak序列,提高轉(zhuǎn)錄和翻譯效率。并把泛素分子的最后一個(gè)氨基酸（76位）用A來(lái)替代原來(lái)的G,這樣蛋白水解酶就不能把泛素分子從融合蛋白中水解下來(lái),這種穩(wěn)定的體系很容易被多聚泛素化,從而增強(qiáng)蛋白的降解率。利用我們以前多表位連接方法,在表位間增加丙-丙-酪氨酸（AAY）間隔和側(cè)翼修飾,提高表位抗原能在體內(nèi)被呈遞的效率[14]。我們成功構(gòu)建了丙型肝炎病毒（HCV）HLA-A2限制性復(fù)合多表位基因的原核表達(dá)載體pRSET-Ub-Mep,轉(zhuǎn)化E.coliBL21,IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá),目的基因可高效表達(dá),純化蛋白具有良好的抗原性和免疫原性。為丙肝多表位疫苗的研究提供了靶抗原,為進(jìn)一步的HCV A 2限制性復(fù)合多表位誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答研究奠定基礎(chǔ)。

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14 韋三華,尹 文,雷迎峰e(cuò)tal.丙型肝炎病毒多表位基因真核載體的構(gòu)建及在真核細(xì)胞中的表達(dá)[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2006;19（1）:24-27.

[收稿2009-09-21]

（編輯 張曉舟）

Genetic construction of HLA-A2 restricted multi-epitopes gene of hepatitis C virus,expression and purification in E.coli for antigenic analysis

WEISan-Hua,DONGKe,LINFang,WANGXi,LIBin,SHENJian-Jun,ZHANGLi-Jun,LIUXin-Yang,ZHANGHui-Zhong.DepartmentofClinicalLaboratoryandBloodTransfusion,TangduHospitalFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710038,China

Objective:To construct the recombinant prokaryotic p lasmid to express HCVHLA-A2 restrictedmulti-CTL epitopes and to purify the fused protein for antigenic analysis.Methods:The human ubiquitin gene andmu lti-CTL epitopes genewas synthesized respectively,and digested by restrictenzymebefore being cloned into pRSET-A.Then it was transformed intoE.coliDH5αand the positive recombinant plasmid named pRSET-Ub-Mepwas sequenced.Target protein was distinctly expressed after transformed intoE.coliBL21 and induced with IPTG.Thus the proteinwas scanned and purified on Ni2+-NTA column aswellasWestern b lot performed after solubility analysis.Results:The recombinant plasmid pRSET-Ub-Mep was successfu lly constructed and it could efficiently exp ress the targetgene.Protein productionwasmain ly in inclusion body and could be purified through Ni2+-NTA column.The purified protein kept theantigen activity.Conclusion:Thegene encoding for HCVHLA-A2-restrictedmulti-CTL epitopes is efficiently exp ressed and the target protein is purified,which establishes a foundation of further research to evaluate the cellular immune response induced by the targetgene.

Hepatitis C virus（HCV）;Cytolytic T lymphocyte;Epitope;Gene expression

韋三華（1972年-）,男,博士,副教授,主要從事分子病毒學(xué)方面的研究。對(duì)HCV各個(gè)蛋白的多表位特異性CTL,則患者的感染多表現(xiàn)為自限性（Nature 2005）[1],提示CTL活性對(duì)HCV感染的控制具有重要作用。越來(lái)越多研究也表明,特異性的CTL反應(yīng)在清除HCV和阻止病毒傳播中起著關(guān)鍵的作用。因此,HCV的CTL免疫優(yōu)勢(shì)表位有利于預(yù)防和治療性疫苗的研制開(kāi)發(fā)。我們?cè)谇捌贖CV多表位基因免疫特性研究的基礎(chǔ)上[2],選擇優(yōu)勢(shì)的CTL表位進(jìn)行串聯(lián),通過(guò)間隔和側(cè)翼修飾,前后端分別加上泛素（Ubiquitin）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)肽基序,以提高各個(gè)獨(dú)立表位被抗原呈遞細(xì)胞的遞呈效率。我們把合成表位,信號(hào)肽基序和泛素序列克隆入原核表達(dá)載體,觀察其表達(dá)情況和免疫原性。為進(jìn)一步分析多表位基因誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答研究奠定基礎(chǔ)。

R373.21

A

1000-484X（2010）03-0201-05

丙型肝炎病毒（HCV）感染后55%～85%轉(zhuǎn)為慢性病毒性肝炎,并可導(dǎo)致肝纖維化及肝細(xì)胞癌（HCC）。目前對(duì)HCV感染的治療除了重組α干擾素（IFN-α）有一定療效外,仍無(wú)有效的抗病毒治療方法。尤其是包膜糖蛋白E2的中和性抗原位點(diǎn)存在高變區(qū)（HVR）,從而使以體液免疫為主的預(yù)防HCV感染的疫苗研究長(zhǎng)期以來(lái)進(jìn)展甚微。研究發(fā)現(xiàn),HCV感染的患者若能在感染的早期產(chǎn)生較強(qiáng)的針

①本文為國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.C0700760）

②通訊作者