H1N1亞型流感病毒血凝素Th和B細胞表位預(yù)測及抗原性分析①

王開艷 李太元 魯會軍 譚 磊③ 南文龍③ 田明堯③ 張金雙③ 劉 昊 金寧一⑤

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院,龍井 133400）

H1N1亞型流感病毒血凝素Th和B細胞表位預(yù)測及抗原性分析①

王開艷 李太元 魯會軍②譚 磊②③南文龍②③田明堯②③張金雙②③劉 昊④金寧一②⑤

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院,龍井 133400）

目的:應(yīng)用生物信息學(xué)方法預(yù)測H1N1亞型流感病毒血凝素Th和B細胞相關(guān)抗原表位,并初步分析其抗原性,為研制H1N1亞型流感病毒的表位疫苗奠定基礎(chǔ)。方法:依據(jù)近年流感病毒流行趨勢,從GenBank下載具有代表性的H 1N1亞型流感病毒HA蛋白氨基酸序列。進行生物信息學(xué)綜合分析預(yù)測,獲得Th和B細胞相關(guān)抗原表位,并比較其保守性和特異性。通過Balb/c小鼠H 1N1亞型流感病毒陽性血清與表位肽的結(jié)合試驗,初步鑒定候選表位抗原性。結(jié)果:綜合多項預(yù)測及空間構(gòu)像模擬結(jié)果,我們獲得了三條候選Th和B細胞表位,分別為HA73～87、HA125～139、HA188～205。候選表位處于H 1N1亞型流感HA1蛋白序列上相對保守的區(qū)域內(nèi),且與目前流行的H 1N1亞型流感病毒HA相應(yīng)區(qū)域具有較好的一致性。而不同候選表位在BALB/c小鼠H 1N1亞型流感病毒陽性血清反應(yīng)中顯示了不同抗體結(jié)合能力,預(yù)示了其成為功能表位的可能。結(jié)論:所篩選的表位具有成為H1N1亞型流感病毒HA Th和B細胞相關(guān)抗原表位的可能。此研究為深入揭示流感病毒感染與免疫機制,H1N1亞型流感功能表位認知及表位疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。

流感;血凝素;H 1N1;抗原表位

①本文受“863”重大項目（2006AA10A 205）和科技支撐項目（2006BAD06A05）資助

②軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所,長春130062

③吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,長春130062

④云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,昆明650201

⑤通訊作者,E-mail:ningyik@126.com

流感是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病,也是第一個實行全球性監(jiān)控的疾病,甲型流感病毒曾引起了多次大范圍的流行,包括1918～1919年的西班牙流感（H1N1）,1957年的亞洲流感（H2N2）,1968年的香港流感（H 3N2）和1977年的俄國流感（H1N1）,每次大流行都造成了巨大的人力資源和物力資源的損失[1]。2009年3月底至4月中旬,墨西哥、美國等多國接連暴發(fā)甲型H1N1型流感疫情,截至北京時間7月1日22時,世界衛(wèi)生組織確認全球117個國家和地區(qū)共有70893例甲型H1N1流感確診病例,其中包括死亡病例311例。由于流感病毒抗原型的不斷改變,研究者迫切希望能找到一種可提供交叉保護性的通用疫苗,以達到“one dose for all”的免疫效果。解決這一問題的途徑之一是研制表位疫苗,由于表位基因易于改造和操作,對于如流感病毒等易發(fā)生抗原漂移和變異的病原體則可通過隨時監(jiān)視和及時改構(gòu)來實現(xiàn)對變異毒株傳播的控制。表位疫苗的另一優(yōu)勢還在于通過選擇最佳和最具免疫保護潛力的表位以誘生特異性免疫應(yīng)答,減少了無關(guān)、干擾和抑制序列可能產(chǎn)生的副作用。

表位（epitope）又稱抗原決定簇（antigenic determinant）,是抗原特異性的特殊化學(xué)基團,即抗原分子表面與抗體及T、B淋巴細胞特異性結(jié)合的部位。B細胞表位可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生保護性抗體并介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答反應(yīng)。Th細胞表位可以激活CD4+效應(yīng)T細胞執(zhí)行重要的免疫調(diào)節(jié)功能。上述兩種類型的表位既是流感功能表位研究,也是流感表位疫苗開發(fā)的基礎(chǔ)[2]。篩選和鑒定出相應(yīng)的流感功能表位對于深入揭示流感病毒感染與免疫機制,流感功能表位的認知、表位疫苗的研究具有重要的理論和實踐價值。因此,本研究采用生物信息學(xué)方法對H1N1亞型流感病毒的主要抗原—血凝素（hemagglutinin,HA）的氨基酸序列進行了分析,預(yù)測了其HA的Th和B細胞抗原表位,并初步分析了其抗原性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 基因序列的選擇 選取近年來流行且具有代表性的H1N1亞型流感病毒株,從NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）上下載獲得相關(guān)毒株的HA基因序列。

1.1.2 序列分析軟件 生物信息學(xué)MHCII類分子預(yù)測軟件:采用網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器SYFPEITHI（http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com）和Multipre（http://antigen.i2r.a-star.Edu.sg）。生物信息學(xué)B細胞表位預(yù)測軟件:采用網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器 PREDICTED ANTIGENIC PEPTIDES,Bcep red（http://www.intech.res.in/raghava/bcepred）和生物分子模擬軟件InsightII（Accelrys,2005）。

1.1.3 主要試劑、病毒及血清 辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗鼠IgG購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。表位多肽由上海華大天源生物技術(shù)有限公司合成,純度大于90%,并與BSA偶聯(lián)。流感病毒A/NewCaledonia/20/99（H1N1）由本室保存。6周齡Balb/c小鼠,雌性若干,體重16～18克,購自長春生物制品研究所。

1.2 方法

1.2.1 HA序列 下載近年流行且具有代表性的H1N1亞型流感病毒HA蛋白氨基酸序列。參考序列Genbank登錄號包括BAH79801.1,BAH79799.1,BAH79802.1,BAH79798.1,ACS71633.1,ACS716311,ACR83596.1,BAH79796.1,ACI32737.1,ACS71627.1等。

1.2.2 表位預(yù)測 Th表位預(yù)測采用網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器SYFPEITHI和MULTIPRED。主要對人類白細胞抗原DRB1（HLA-DRB1）等位基因 *04、HLA-DRB1*07、HLA-DRB1*08、HLA-DRB1*11、HLA-DRB1*13、HLA-DRB1*15限制性Th細胞表位進行預(yù)測,并綜合參考其他HLA-DR親和力評分。B細胞表位預(yù)測采用網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器Bcepred和PREDICTED ANTIGENIC PEPTIDES對線性B細胞表位進行預(yù)測。所有預(yù)測優(yōu)先篩選位于HA主要抗原區(qū)HA1上的表位。之后,匯總各項表位預(yù)測結(jié)果,以Th表位預(yù)測為基礎(chǔ),使預(yù)測表位區(qū)盡量覆蓋與B細胞表位預(yù)測交集區(qū),以獲得兼有Th與B細胞表位功能的預(yù)測表位。

1.2.3 確定細胞表位 通過PDB（http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do）下載H1亞型流感HA蛋白分子構(gòu)像,應(yīng)用InsightII軟件進行分子建模,分析候選表位空間構(gòu)像。排除位于α-螺旋和β-片層不易形成表位的序列,將位于轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲處且表面暴露好的序列確定為候選細胞表位。將候選表位序列與已發(fā)表的HA蛋白序列比較,分析其保守性和特異性（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。最后,綜合各項結(jié)果確定細胞表位。

1.2.4 H 1N1亞型流感陽性和陰性血清的檢測 采用本室保存的A/NewCaledonia/20/99（H1N1）流感病毒以5×104TCID50肌肉注射BALB/c小鼠15只,7天后處死,眼眶放血收集血清。并收集10只未攻毒健康BALB/c小鼠血清作為陰性對照。所獲得的BALB/c小鼠血清,以HI方法判定效價。

1.2.5 候選表位抗原性分析 BSA偶聯(lián)多肽（20 μg/ml）4℃過夜包被ELISA板,次日置于含5%脫脂乳的Tris鹽緩沖液中封閉1小時。每孔加入各實驗BALB/c小鼠（1∶40倍稀釋）,37℃溫育1.5小時。PBS洗滌5次后,加入HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG（1∶2 000倍稀釋）,37℃溫育1.5小時。PBS洗滌5次后,加入OPD顯色液,37℃避光顯色15分鐘后終止,492 nm處測定各孔吸光值。計算陽性血清與陰性血清OD比值,組間差異統(tǒng)計用SPSS15.0軟件進行單向方差分析。

2 結(jié)果

2.1 Th和B細胞表位綜合分析 綜合各項分析結(jié)果,本研究獲得了三條候選Th和B細胞表位,分別為H1HA73～87TESWSYIVETPNPEN 、H1HA125～139NHT VTGVSASCSHNG 、H1HA188～205RALYHTENAYVSVVSSHY。SYFPEITHI軟件是根據(jù)特定肽的錨定殘基和輔助殘基位置的氨基酸類型來評分的。根據(jù)SYPEITHI對親和能力打分,所篩選的表位分值與排名均靠前,符合成為潛在Th表位的標(biāo)準(zhǔn)。而所篩選的表位MHC限制性主要參考了中國人群中多數(shù)人所具有MHC類型,以使預(yù)測的表位具有更好的人群覆蓋能力。SYFPEITHI結(jié)果顯示（如表1）,候選表位可與多種HLA-DR限制性分子具有較好的結(jié)合能力。

通過Multipre方法對Th表位進行了預(yù)測,分值范圍為從1～9分,其中8～9表示預(yù)測表位與相應(yīng)MHC具有較高親和力,6～7表示中等親和力,4～5表示親和力較低。綜合MULTIPRED方法預(yù)測結(jié)果顯示（如表2）,候選表位得分靠前,其大部分與相應(yīng)MHC類型具有中等及以上親和力,處于能與多種HLA-DR限制性分子結(jié)合的“熱區(qū)”。兩者綜合說明所選表位可為多種HLA-DR限制性分子遞呈,具有成為Th細胞表位的可能。

PREDICTED ANTIGENIC PEPTIDES預(yù)測結(jié)果顯示（見圖1）,序列中共有23個抗原決定簇,而預(yù)測的表位H1HA73～87TESWSYIVETPNPEN 、H1HA125～139NHTVTGVSASCSHNG 、H 1HA188～ 205 RALYHTENAYVSVVSSHY均處于或包含抗原決定簇區(qū)域。

Bcepred預(yù)測時參數(shù)Hydrophilicity、Accessibility、Flexibility 、Antigenicity 、Polarity 、Exposed surface 、Turns的臨界值分別設(shè)定為 1.9、2.0、1.9、2.4、2.3、1.8、1.9。表中著重標(biāo)出了預(yù)測表位覆蓋的參數(shù)區(qū)域（如表3）。綜合分析結(jié)果顯示,所篩選的表位綜合評價靠前,具有成為B細胞表位的可能。

2.2 分子構(gòu)象模擬及序列比較分析 通過InsightII軟件模擬HA分子于病毒表面形成的三聚體形式,黃色區(qū)域為候選表位區(qū),見圖2,分析顯示,候選表位區(qū)結(jié)構(gòu)主要為無規(guī)則卷曲和轉(zhuǎn)角,含少量β-片層結(jié)構(gòu),無α-螺旋結(jié)構(gòu),表面暴露性較好。結(jié)果說明候選表位在蛋白分子構(gòu)象上符合表位設(shè)計要求,易于形成功能表位。保守性比較發(fā)現(xiàn),預(yù)測獲得的表位均處于H1N1亞型流感HA1蛋白序列上相對保守的區(qū)域內(nèi)。特異性分析表明,Genbank中已登錄的2006～2009年H1N1亞型流感分離株尤其是亞洲地區(qū)分離株均含有該表位序列。

2.3 H1亞型流感陽性和陰性血清的檢測 經(jīng)HI方法判定,所獲得BALB/c小鼠H1N1亞型流感病毒陽性血清效價為 27.33±1.62,而陰性血清未見 HI效價。

2.4 候選表位抗原性分析 通過間接ELISA的方法,以預(yù)測的H1亞型流感ThB候選表位多肽包被ELISA板,再分別用Balb/c小鼠源的H1亞型流感陽性和陰性血清進行其反應(yīng)性分析（表4）。結(jié)果顯示,各候選表位均陽性血清表現(xiàn)了顯著的反應(yīng)性,其中表位HA188～205與陰性對照反應(yīng)性差異顯著（P＜0.05）,HA125～139和 HA73～87與陰性對照反應(yīng)性差異極顯著（P＜0.01）。從P/N比值分析,其血清結(jié)合能力 HA73～87（1.52）和 HA125～139（1.52）＞HA188～205（1.45）。結(jié)果證實,H1亞型流感陽性血清中存在著可與表位多肽結(jié)合的抗體組分,可推斷所篩選的表位具有成為功能表位的潛能。

表1 候選表位SYFPEITHI分析結(jié)果Tab.1 Analysis of the candidate epitopes with SYFPEITHI

表2 候選表位MULTIPRED（HMM）分析結(jié)果Tab.2 Analysis of the candidate epitopes with MULTIPRED（HMM）

圖1 H1HA抗原肽分析Fig.1 Analysis of antigenic peptides

圖2 H1HA候選表位空間的構(gòu)像模擬Fig.2 Conformation stimulation of H1HA candidate epitopes

3 討論

流感是一種嚴重的呼吸道疾病,目前臨床使用的大部分疫苗是滅活疫苗,這類疫苗無法有效克服流感病毒表面蛋白的頻繁變異給疫苗研制帶來的困難。在以使用滅活疫苗為主的大背景下,各大疫苗公司及研究單位紛紛進行著種種新型疫苗的探索,尤其是表位疫苗和DNA疫苗,由于具有常規(guī)流感疫苗無法比擬的巨大優(yōu)勢,它彌補了傳統(tǒng)疫苗的一些不足,尤其在誘導(dǎo)細胞免疫方面,通過選擇正反應(yīng)表位避免副反應(yīng)表位,減少了疫苗毒副作用,提高了安全性,增強了免疫針對性。在流感表位疫苗的研究中,以表位為基礎(chǔ)的疫苗研究主要包括:合成肽疫苗、重組抗原表位亞單位疫苗、多表位串聯(lián)DNA疫苗等形式。目前,表位疫苗已得到應(yīng)用,國外已經(jīng)有以A型流感病毒HA蛋白的T和B細胞識別表位聯(lián)和制成的合成肽疫苗可以保護鼠的致死性感染的報道[3]。Hua等人以E.coli表達H3HA三個中和表位HA183～195、HA127～133、HA92～105的重組多表位肽免疫了兔和小鼠,并產(chǎn)生了高滴度的中和抗體[4]。Thomson等以一個真核質(zhì)粒表達了10個CTL抗原表位,采用這樣的質(zhì)粒免疫鼠后,發(fā)現(xiàn)這些表位誘導(dǎo)了較強的CTL應(yīng)答并可清除感染的病毒[5]。H3亞型流感病毒血凝（Hemagglutinin,HA）基因127～133高度保守,且HA晶體結(jié)構(gòu)顯示HA 127～133表面是環(huán)狀的,對宿主結(jié)合位點是關(guān)閉的。研究發(fā)現(xiàn)流感病毒A/Aichi/2/68（H3N2）的HA 127～133可被引入到46位攜帶苯丙氨酸（F）,54位攜帶丙氨酸（A）的p43～58中,其43～46及54～58位殘基仍具結(jié)合MHC-Ⅱ能力。因此推測抗此位點的抗體很容易產(chǎn)生且能中和病毒的傳染性,可作為制作多肽疫苗的潛在表位。Ogasawara等[6,7]檢測了46F/HA 127～133/K54A對T細胞的免疫原性,滴鼻接種2周后可保護小鼠免受H3N2流感病毒的感染。南文龍等[8]對禽流感H5N1亞型的Th和B表位進行了共預(yù)測及抗原性分析,獲得了三條候選Th和B細胞表位,分別為HA141-155、HA206-223、HA302-316,且具有良好的抗原性 。

表3 候選表位Bcepred分析結(jié)果Tab.3 Analysis of the candidate epitopeswith Bcepred

表4 H1N1亞型流感Th/B候選表位血清反應(yīng)分析Tab.4 Serum reaction analysis of H1N1 HA Th/B epitopes

研究表明,采用免疫信息學(xué)輔助方法,可以使發(fā)現(xiàn)新表位的效率提高10～20倍,減少95%的實驗工作量,可節(jié)約大量研究經(jīng)費并大大地加快新表位的發(fā)現(xiàn)[9]。T細胞表位預(yù)測對于研究細胞免疫機理、過程以及研制多肽疫苗和基因疫苗等具有重要的意義。SYFPEITHI是基于已知的能和MHCⅡ類分子結(jié)合槽結(jié)合的Th細胞表位所建立的網(wǎng)絡(luò)平臺,實驗證明應(yīng)用此平臺預(yù)測的特定蛋白Th細胞表位所合成的肽段在體內(nèi)和體外實驗都能產(chǎn)生預(yù)期的結(jié)果,說明該平臺對Th細胞表位的預(yù)測具有一定的可信度[10,11]。Multipre主要采用支持向量機法（Support Vector Machine,SVM）、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法（Artificial neural networks,ANNs）、因子隱Markov模型法（Hidden Markov ModelMethod,HMM）進行CTL表位的預(yù)測。PREDICTED ANTIGENIC PEPTIDES主要對針對蛋白抗原性進行分析,采用Kolaskar建立的預(yù)測方法,預(yù)測可能刺激機體產(chǎn)生抗體反應(yīng)的抗原肽,準(zhǔn)確率達75%。B細胞表位預(yù)測,不僅有助于基礎(chǔ)免疫學(xué)研究,而且也有助于疫苗和抗體的研究與開發(fā),代表軟件有PEOPLE、BEPITOPE、Bcepred等[12,13],但是基于上述度量性質(zhì)的表位預(yù)測,預(yù)測準(zhǔn)確度一般低于60%,難以令人滿意。因此,如何提高預(yù)測的準(zhǔn)確度和預(yù)測方法的普遍性是未來研究的方向。在本實驗中,我們應(yīng)用多款不同網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器的不同算法進行了表位的篩選,盡可能使獲得表位在各種預(yù)測軟件中都能得到“認可”。此外,我們在Th和B細胞表位預(yù)測的過程中,基于其實現(xiàn)功能的機制,引入了兩種表位共預(yù)測的設(shè)想,也可以從另一個角度來提高表位的預(yù)測準(zhǔn)確率。

本研究以H1N1亞型禽流感HA為模型嘗試對Th和B細胞相關(guān)表位共預(yù)測。研究獲得了三條Th和 B 細 胞 相 關(guān) 表 位 ——HA73～87、HA125～139、HA188～205,并以BALB/c小鼠H1N1亞型流感陽性血清進行了候選表位抗原性分析。為了使預(yù)測的表位具有較好的人群通用性,Th表位預(yù)測的HLA限制性類型上,選擇了以中國人群抗原頻率較高的HLADRB1*08、HLA-DRB1*11、HLA-DRB1*04、HLADRB1*07、HLA-DRB1*13、HLA-DRB1*15 為主[14]。B細胞表位的選擇上,我們綜合了各項單參數(shù)預(yù)測結(jié)果并結(jié)合了蛋白三級結(jié)構(gòu)模擬分析,來提高預(yù)測準(zhǔn)確性。雖然候選表位在某些單參數(shù)預(yù)測結(jié)果中分數(shù)相對較低,但綜合評價均靠前。

體液免疫主要通過B細胞產(chǎn)生抗體發(fā)揮效應(yīng),而其功能受Th細胞的調(diào)節(jié)。B細胞本身又可以通過BCR捕獲抗原,并行使APC細胞作用向Th細胞遞呈抗原多肽而活化Th細胞。根據(jù)流感病毒免疫應(yīng)答的特點及免疫保護機制,我們對多亞型（H1）流感病毒HA 1上的B和Th細胞表位進行了共篩選。我們期望通過篩選獲得特異性誘導(dǎo)良好體液免疫功能的抗原表位,最好能兼有Th和B細胞表位功能,對于細胞免疫水平有待進一步研究。因此,本研究以BALB/c小鼠為哺乳動物模型,分析了候選表位抗原性。結(jié)果初步驗證了候選表位的抗原性,預(yù)示了其成為 功 能 表 位 的 可 能,提 示 HA73～87、HA125～139、HA188～205可能為小鼠H1N1亞型流感功能表位。其結(jié)果為進一步H1N1亞型流感HA功能表位的鑒定及新型表位疫苗的設(shè)計和應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。

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[收稿2009-06-03 修回2009-07-27]

（編輯 許四平）

Prediction of the Th/B cellepitopes on HA of influenza virus（H 1N1）and antigenicity analysis

WANGKai-Yan,LITai-Yuan,LUHui-Jun,TANLei,NANWen-Long,TIANMing-Yao,ZHANGJin-Shuang,LIUHao,JINNing-Yi.YanbianUniversity,Longjing133400,China

Objective:To predict Th/B cellepitopes in HA of influenza virus（H1N1）and analyze antigenicity of the candidate epitopes in order to develop epitope-bacterin by theway ofbioinformatics.Methods:The HA amino acid sequences of influenza virus（H 1N1）,which the viral infection was prevalent recently,were down loaded from Genbank.The Th/B cell epitopeswere predicted and analyzed by bioinformatics methods.Then,specificity and conservation of the candidate epitopeswere estimated.Finally,antigenicity of the candidate epitopeswas identified by influenza virus（H 1N1）positive serum samp lesofmice.Results:Three Th/B cellepitopes containing HA73-87,HA125-139,HA188-205were acquired.Two of the candidateepitopeswere in a relatively conserved domainof HA1,and a deal of 2006-2009 influenza virus（H1N1）isolates contained the sequences.Moreover,the candidate epitopes were showedin a distinct antibody combining reactivity with the influenza virus（H1N1）positive serum ofmice,which inferred the predicted epitopes to be functional ones.Conclusion:The selected epitopes are able to be functional HA Th/B cell epitopes of influenza virus（H 1N1）.Our study also estab lish the foundations for the further research of influenza virus infection and immunitymechanism,the recognition of influenza virus（H1N1）functionalepitope and the developmentofepitope vaccines.

Influenza virus;HA;H 1N1;Epitope

S855.3

A

1000-484X（2010）01-0008-05

王開艷（1984年-）,女,在讀碩士,主要從事流感基因工程疫苗的研究,E-mail:cindykaiyan@hotmail.com;

及指導(dǎo)教師:李太元（1962年-）,男,教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事動物免疫學(xué)和微生物學(xué)方面的研究,E-mail:tyli@ybu.edu.cn。