羥基磷灰石和碳酸羥基磷灰石結(jié)構(gòu)和細(xì)胞相容性的對(duì)比研究

朱慶霞 徐瓊瓊 劉欣

(景德鎮(zhèn)陶瓷學(xué)院，景德鎮(zhèn)：333001)

1 引言

人體自然骨中磷灰石礦物主要是非化學(xué)計(jì)量的磷灰石晶體，碳酸根是骨磷灰石中含量最多的摻雜離子。碳酸根能替代羥基磷灰石（HA）晶格中的羥基或磷酸根，分別形成A型或B型替代，或同時(shí)占據(jù)兩個(gè)位置，形成AB型替代的碳酸羥基磷灰石（CHA）[1]。在人體骨中的CHA以B型替代為主，A型和B型替代的摩爾比大約為0.7～0.9[2]。碳酸根的替代會(huì)導(dǎo)致HA生物學(xué)性能的變化[3-5]，有學(xué)者通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究了碳酸根替代對(duì)生物相容性的影響，然而所研究的對(duì)象集中在固相離子交換法制備的以A型替代為主的CHA[6-8]，而對(duì)B型替代為主CHA的生物相容性研究卻未見(jiàn)報(bào)道。材料的生物學(xué)性能與表面能密切相關(guān)。因此本文研究了以B型替代為主的碳酸根對(duì)磷灰石晶體結(jié)構(gòu)和表面能的影響，并采用羊骨髓基質(zhì)細(xì)胞建立了體外評(píng)價(jià)模型，研究了表面能對(duì)細(xì)胞貼附和增殖的影響，進(jìn)而對(duì)材料的細(xì)胞相容性進(jìn)行評(píng)估。

2 實(shí)驗(yàn)

以硝酸鈣(Ca(NO3)2·4H2O)、磷酸氫二銨((NH4) 2HPO4)為原料，控制Ca(NO3)2·4H2O與(NH4)2HPO4的摩爾比為1.67，以適當(dāng)?shù)乃俣葘?NH4)2HPO4溶液滴加到Ca(NO3)2·4H2O溶液中制備HA。以Ca(NO3)2· 4H2O、(NH4)2HPO4和NaHCO3為原料，控制Ca(NO3)2· 4H2O,(NH4)2HPO4和NaHCO3的摩爾比為1.67∶1∶0.44,以適當(dāng)?shù)乃俣葘?NH4)2HPO4和NaHCO3的混合溶液滴加到Ca(NO3)2·4H2O溶液中制備CHA。在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中，通過(guò)滴加氨水調(diào)節(jié)溶液的pH值在10～11之間，反應(yīng)溫度為90℃。反應(yīng)結(jié)束后，繼續(xù)攪拌3 h，然后在室溫下陳化24 h，再用蒸餾水洗滌、離心、過(guò)濾、120℃干燥。

2.2 樣品的制備

將CHA和HA粉體在250 MPa等靜壓作用下壓成塊體，將CHA塊體和粉體置于自制的石英管式爐內(nèi)，通入濕二氧化碳?xì)怏w（其中濕氣的帶入是將氣體在進(jìn)入石英管式爐前，流經(jīng)室溫下盛有蒸餾水的三口瓶而實(shí)現(xiàn)的），在800℃熱處理2 h，升溫速率為5℃/min，二氧化碳流量為1L/min，經(jīng)元素分析熱處理后CHA樣品的碳酸根含量為5.4wt%。作為對(duì)比，將HA塊體和粉體在空氣氣氛中1000℃熱處理2 h。兩種塊體燒后致密度均為0.91，樣品拋光先經(jīng)過(guò)1200目的砂紙打磨，然后是氧化鋁拋光粉拋光。拋光處理后的樣片經(jīng)XRD分析，沒(méi)有發(fā)生分解。

2.3 細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)

觀察成骨細(xì)胞在種植體表面上的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)特性及功能表達(dá)，是研究材料細(xì)胞相容性的重要方法。要取得種植體的早期穩(wěn)定，必須能夠使成骨細(xì)胞在材料表面早期附著和增殖。實(shí)驗(yàn)步驟如下：

2.3.1 消毒

CHA和HA塊體經(jīng)相同的拋光處理后，以丙酮超聲清洗5分鐘，然后用95%無(wú)水乙醇清洗5分鐘，再用去離子水沖洗3遍，40℃烘干，高溫高壓消毒，備用。

2.3.2 接種

取第三代羊骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，采用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液 (含100 IU/mL盤(pán)尼西林,100 mg/mL鏈霉素和10%血清)制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL；將材料放置于48孔培養(yǎng)板中，分別在每片材料上面用移液器滴加細(xì)胞懸液100μL，小心將培養(yǎng)板放置于37℃，5%CO2的孵育箱中。

2.3.3 細(xì)胞貼附率檢測(cè)

分別培養(yǎng)4h，8h，16h后從每個(gè)實(shí)驗(yàn)組各取出3個(gè)試樣，置于新的培養(yǎng)板內(nèi)，D-Hanks液漂洗3次，吸凈液體。每孔加入100μL濃度為0.25%的胰酶消化2min后，再加入100μL含血清的培養(yǎng)液，中止消化，用移液器反復(fù)吹打材料表面，待表面細(xì)胞完全消化下來(lái)后，將液體轉(zhuǎn)移至 500μL離心管內(nèi)，800rpm，5min離心，吸棄上清，加入100μL培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，每個(gè)試樣重復(fù)三次，取平均值。

細(xì)胞貼壁率=（貼壁細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×（培養(yǎng)孔底面積/試樣面積）×100%

2.3.4 細(xì)胞增殖率檢測(cè)

將培養(yǎng)4d，8d，16d后的材料每種各取三片，照上述方法消化后計(jì)數(shù)。

細(xì)胞增殖率=（增殖細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×（培養(yǎng)孔底面積/試樣面積）×100%

2.4 樣品性能的表征

用 X射線衍射（X-ray diffraction,XRD)儀(PANalytical X'pert PRO,Netherlands)慢速掃描來(lái)確定峰位的準(zhǔn)確位置，工作條件為管壓40 kV，管流40 mA，2θ 的步長(zhǎng)為 0.02°。用 Fourier變換紅外（Fourier transform infrared,FTIR）光譜儀 (Nexus, Nicolet,USA)分析樣品的分子基團(tuán)，特別是碳酸根的振動(dòng)。用躺滴法（A sessile drop method）接觸角測(cè)定儀(OCA15，dataphysics,Germany)測(cè)量實(shí)驗(yàn)液體在樣品表面的接觸角。對(duì)于每種實(shí)驗(yàn)液體最少選用3個(gè)平行樣，每個(gè)平行樣品平均進(jìn)行6～7個(gè)接觸角測(cè)量。

3 結(jié)果與討論

圖1 C H A與H A粉料的F T I R圖譜Fig.1 FTIR spectrum of CHA and HA

圖1是熱處理后CHA與HA粉料的FTIR圖譜。除PO43-的峰 (1090、1040、962、600、570 cm-1)之外，存在著羥基（OH-O）位于3570 cm-1的伸縮振動(dòng)峰和位于630 cm-1的彎曲振動(dòng)峰。對(duì)比圖1.a和b，可以看出，CHA的羥基伸縮振動(dòng)峰強(qiáng)度明顯減弱，且630 cm-1處的彎曲振動(dòng)只存在不太明顯的肩峰。這是由于有部分碳酸根替代了HA晶格的羥基，發(fā)生了A型替代，從而使得羥基的振動(dòng)強(qiáng)度減弱。而在圖1a CHA的FTIR圖譜中，還出現(xiàn)了1470，1460，1420以及 875cm-1處 CO32-的振動(dòng)峰，尤其是 1400～1500cm-1間C-O反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)吸收帶出現(xiàn)了分裂，它不同于碳酸鹽或自由基CO32-中的單峰，該分裂峰表明CO32-已經(jīng)進(jìn)入到羥基磷灰石晶格內(nèi)部[9]。其中1420cm-1是B型替代的伸縮振動(dòng)峰，1460cm-1是B型替代的彎曲振動(dòng)峰，1470cm-1是A型替代的伸縮振動(dòng)峰。而 875cm-1處的碳酸根振動(dòng)峰是870cm-1B型替代和880cm-1A型替代的重合峰，其中870cm-1和880cm-1的峰強(qiáng)之比近似于碳酸根的B型和A型替代之比[10]。通過(guò)計(jì)算機(jī)擬合分峰技術(shù)，可得CHA的A/B=0.72。故通過(guò)紅外分析可知所制得的CHA是以B型替代為主。這是因?yàn)橐詽穹ㄖ苽銫HA時(shí)，要考慮溶液中OH-和CO32-競(jìng)爭(zhēng)占據(jù)HA晶格羥基位的情況。當(dāng)CHA在堿性條件下制備時(shí)，高濃度的OH-更容易占據(jù)HA晶格的A位，迫使更多的碳酸根進(jìn)入HA晶格的B位，形成B型替代。而在本實(shí)驗(yàn)中，溶液的pH值是在10～11之間。所以，高pH值的制備條件有利于獲得以B型替代為主的CHA。紅外光譜中特征吸收帶的寬窄、尖銳程度可以反映礦物的結(jié)晶程度[11]。結(jié)晶程度較低時(shí)，礦物內(nèi)部結(jié)構(gòu)排列變得不規(guī)則，對(duì)稱(chēng)性降低，形成一些寬而鈍的峰，隨著結(jié)晶程度的提高，原來(lái)寬泛的吸收帶頻率范圍縮小，吸收帶銳化。對(duì)比圖1（a）和（b）可以看出，HA樣品位于1100～900 cm-1處磷酸根的非對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰的峰形尖銳，而在CHA樣品中，峰形寬而鈍，有雙峰合并只形成一個(gè)彌散峰的趨勢(shì)，表明CHA的結(jié)晶度比HA低。

圖2是熱處理后CHA與HA粉料的XRD衍射圖。從圖2可以看出，CHA與HA粉料的最強(qiáng)峰值都在31.5°到32°之間，主晶相為磷灰石相。但在CHA的衍射圖中，特征峰的峰位都發(fā)生了偏移，而峰位的偏移反映了晶體結(jié)構(gòu)的變化。由于碳酸根的晶胞體積小于磷酸根，而大于羥基的晶胞體積，故當(dāng)發(fā)生替代時(shí)，形態(tài)和大小的差別會(huì)明顯地反映在晶胞參數(shù)的變化上。當(dāng)發(fā)生A型替代時(shí)，碳酸根離子的三角形平面平行于c軸，當(dāng)發(fā)生B型替代時(shí)，碳酸根離子的三角形平面垂直于c軸，從而B(niǎo)型替代使得c/a增加，A型替代使得c/a減小[12]。從FTIR光譜的分析可以知道，本實(shí)驗(yàn)生成的CHA是以B型替代為主的混合型替代，根據(jù)六方晶系晶面距的計(jì)算公式[13]：

圖2 C H A與H A粉料的X R D衍射圖Fig.2 XRD patterns of CHA and HA

從而（210）、（300）晶面由于a值的減小，d值減小，峰位向高角區(qū)移動(dòng)；而（002）晶面由于c值的增大，d值增大，從而峰位稍微向低角區(qū)移動(dòng)。并且從圖中還可以看出，引入CO32-使得磷灰石特征峰的半高寬發(fā)生變化，CHA的半高寬明顯比HA峰的半高寬要大，說(shuō)明CHA比HA的結(jié)晶程度差，與上述FTIR分析相符。這主要是由于碳酸根的替代引起晶格畸變，這種畸變阻礙HA的進(jìn)一步結(jié)晶，使其結(jié)晶程度變差，結(jié)晶度降低。

3.3 表面能的測(cè)定

在本研究中，接觸角的測(cè)定選用了三種實(shí)驗(yàn)液體：丙三醇、雙蒸水和甲酰胺。丙三醇和甲酰胺用來(lái)確定樣品表面能的色散分量，極性分量通過(guò)雙蒸水與樣品的相互作用能獲得。圖3為樣品的動(dòng)態(tài)接觸角（θ）。

試樣表面能（γs）數(shù)據(jù)由Owens-Wendt-Kaeble's方程計(jì)算求得[14]：

式中，γ的下標(biāo)s,l和g分別表示固、液和氣，上標(biāo)d和p分別表示相應(yīng)表(界)面張力的色散分量和極性分量。將實(shí)驗(yàn)液體的表面能數(shù)據(jù)（丙三醇63.4mJ/m2雙蒸水甲酰胺代入，可得試樣的表面能。

圖3 樣品動(dòng)態(tài)接觸角Fig.3 Dynamic contact angles between(a)CHA and glycerol,(b)HA and glycerol,(c)CHA and doubledistilled water,(d)HA and double-distilled water

經(jīng)計(jì)算，CHA樣品的表面能為50±2mJ/m2，高于HA樣品的表面能（43±2mJ/m2），但表面能的色散分量相近，HA和CHA表面能的色散分量分別為34±3mJ/m2和33±2mJ/m2，這表明碳酸根的B型替代使得CHA與極性組分（包括骨細(xì)胞、蛋白質(zhì)等）作用增強(qiáng)。此外，同一樣片同一實(shí)驗(yàn)液體測(cè)出接觸角數(shù)據(jù)的重復(fù)性也表明了所制得樣品化學(xué)成分的穩(wěn)定性。固體表面組分和表面粗糙度等對(duì)接觸角有明顯的影響[16]。CHA樣品和HA樣品在測(cè)試前經(jīng)過(guò)相同的樣品制備過(guò)程，其表面粗糙度和致密度基本一致，其表面能的不同主要是由碳酸根替代導(dǎo)致樣品表面組分的變化引起的。并且碳酸根不同類(lèi)型的替代對(duì)表面能的影響也是不同的。S.A.Redey[5-6]等人研究了A型替代的CHA，發(fā)現(xiàn)其表面能的極性分量低于HA表面能的極性分量，從而導(dǎo)致成骨細(xì)胞在其表面吸附量較少，膠原的生成量也較少。本研究所制備CHA樣品以B型替代為主，這種類(lèi)型的替代導(dǎo)致了表面能，特別是極性分量的升高，從而必將有利于細(xì)胞的早期吸附。

3.4 樣品的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

圖4（a）是早期細(xì)胞附著率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。與HA樣品相比，CHA樣品高的細(xì)胞貼壁率明顯是和成骨細(xì)胞與CHA表面較高的親合力有關(guān)。表面能的測(cè)試數(shù)據(jù)表明，當(dāng)碳酸根發(fā)生B型替代，HA與水的極性互作用能增加，表面能增加。根據(jù)平衡系統(tǒng)的最小能量定律，細(xì)胞在高能表面貼附和伸展良好。因此，表面能能影響成骨細(xì)胞在HA樣品和CHA樣品的早期貼附，這與先前關(guān)于潤(rùn)濕性對(duì)各種細(xì)胞貼附和伸展影響的研究結(jié)果相吻合[17-18]。另一方面，從圖4（b）細(xì)胞增殖率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，雖然CHA樣品的早期貼附率高于HA樣品，但在細(xì)胞增殖方面并沒(méi)有太大的區(qū)別。這說(shuō)明，HA樣品表面與成骨細(xì)胞較差的親合力只是延緩了早期的細(xì)胞貼附，并沒(méi)有改變細(xì)胞的增殖與分化。這可能是由于碳酸根的替代導(dǎo)致CHA結(jié)構(gòu)無(wú)序化，提高了溶解度，從而其表面含較多鈣磷元素，在培養(yǎng)液中鈣離子的溶出會(huì)引起表面pH值發(fā)生變化，抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)[19]。從而，培養(yǎng)8天后，HA樣品和CHA樣品細(xì)胞增殖率已經(jīng)比較接近。

4 結(jié)論

（1）濕化學(xué)法堿性條件下制備的碳酸羥基磷灰石是以B型替代為主的碳酸羥基磷灰石。

（2）碳酸根的B型替代導(dǎo)致表面能的升高，其表面能的極性分量高于HA表面能的極性分量。

圖4 不同時(shí)間點(diǎn)材料表面細(xì)胞附著率和增殖率Fig.4 Cell attachment rate and cell proliferation rate versus time

（3）表面能的升高有利于細(xì)胞的早期吸附，以B型替代為主的CHA細(xì)胞相容性好，成骨細(xì)胞能夠在材料表面良好黏附和增殖。

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