李云興， 柴紀(jì)嚴(yán)， 吳成舉， 英錫相*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連116600;2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，遼寧沈陽(yáng)110032)

山里紅葉(leaves of Crataegus pinnatifida Bge.var Major)被中國(guó)藥典(2005)版所收載［1］，用于活血化瘀，理氣通脈［2］。早在東晉《肘后方》中就有山里紅葉(山楂葉)“莖葉煮汁，洗漆瘡”的記載。一般文獻(xiàn)報(bào)道并未將其藥理作用區(qū)分。近年來(lái)，有大量的文獻(xiàn)報(bào)道:山里紅葉即山楂葉具有降壓、增加冠脈血流量、降血脂、強(qiáng)心等作用。但是，研究證明，不同采收期的山楂葉中總黃酮含量及單體有效成分的含量差異較大。由于山里紅葉在此方面研究少有報(bào)道，因此我們分別以山里紅葉總黃酮及主成分—牡荊素－2″－O－鼠李糖苷［3］為考察指標(biāo)，采用紫外分光光度法與高效液相色譜法(HPLC)對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定，最終通過(guò)研究結(jié)果分析，確定山里紅葉最佳采收期，科學(xué)合理的采收山楂葉。

1 總黃酮含量測(cè)定

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器 3010紫外分光光度計(jì)(日本日立公司);AGBP210S電子天平(德國(guó)Satorius公司);AS3120A超聲提取器。

1.1.2 試藥與藥品 蘆丁對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)080－9002);乙醇，硝酸鋁，亞硝酸鈉，氫氧化鈉，以上試劑為分析試劑;不同采收期山里紅葉采收于遼陽(yáng)(5月至10月，每周1次，共23次)。

1.2 方法與結(jié)果

1.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對(duì)照品10 mg，置50 mL量瓶中，加乙醇適量，超聲處理使之溶解，冷卻，加乙醇至刻度，搖勻，即得。(每1 mL中含無(wú)水蘆丁0.2 mg)。以蘆丁對(duì)照品溶液在紫外范圍內(nèi)掃描吸收波長(zhǎng)，測(cè)得最大吸收波長(zhǎng)為509 nm，因此選擇此波長(zhǎng)為總黃酮測(cè)定波長(zhǎng)。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取對(duì)照品溶液1，1.5，2，2.5，3 mL，分別置10 mL量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，加1 mol/L氫氧化鈉試液4 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)試劑為空白，立即照紫外分光光度法在509 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程為:A=11.406C+0.014 8，r=0.999 5。

1.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取山里紅葉0.1 g置于具塞錐形瓶中，加不同濃度乙醇適量，超聲濾過(guò)，精密吸取1 mL置于10 mL量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，加1 mol/L氫氧化鈉試液4 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，即得。

1.2.4 超聲提取條件 正交法確定超聲提取工藝條件:采用超聲波提取主要是利用超聲波破碎作用(空化作用)和強(qiáng)化傳質(zhì)(機(jī)械作用)，因此，影響超聲波提取的因素很多，如:溶劑的濃度、提取時(shí)間、溶劑量等，為了更好地比較各因素對(duì)山里紅葉提取的影響程度，并根據(jù)參考文獻(xiàn)的影響因素，選取了濃度、時(shí)間、溶劑量這3個(gè)因素，運(yùn)用正交法確定超聲提取山里紅葉的優(yōu)化條件。見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)

1.2.5 超聲提取工藝考察 結(jié)果按表1選擇的研究因素及其水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)處理見(jiàn)表2。由極差分析可知，各因素對(duì)提取率的影響的大小排序?yàn)?C(溶量)＞A(濃度)＞B(時(shí)間)，優(yōu)化條件最佳組合為A2B3C1，即50%乙醇10 mL，超聲45 min。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析

1.2.6 不同采收期山里紅葉總黃酮含量測(cè)定 在超聲萃取的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，分別提取了多個(gè)不同采收期山里紅葉樣品，在最大吸收波長(zhǎng)509 nm處測(cè)定吸收值，分別計(jì)算山里紅葉中總黃酮含量。以含量(%)為縱坐標(biāo)，以采收期(以周記)為橫坐標(biāo)作圖，見(jiàn)圖1。

2 單體有效成分含量的研究

圖1 不同采收期山里紅葉總黃酮含量

2.1 儀器與試藥

2.1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀四元泵 (美國(guó)安捷倫公司);AGBP210S電子天平(德國(guó)Satorius公司);AS3120A超聲提取器。

2.1.2 試藥與藥品 色譜純乙腈、四氫呋喃、甲醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，其它試劑均為分析純;對(duì)照品牡荊素－2″－O－鼠李糖苷［5］(自制，采用高效液相峰面積歸一化法，純度＞98%)。不同采收期山里紅葉(5月至10月，每周1次，共23周)。

2.2 方法與結(jié)果

2.2.1 色譜條件 色譜柱:(Diamonsil C18，150 mm×4.6 mm，5 μm)(迪馬公司，中國(guó)北京);流動(dòng)相:采用二元梯度系統(tǒng)，溶劑A:乙腈－四氫呋喃(97∶3);溶劑B:1%磷酸水溶液，梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表4;檢測(cè)波長(zhǎng):270 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:室溫;進(jìn)樣量:10 μL。梯度洗脫程序見(jiàn)表4。

表4 梯度洗脫程序

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取不同采收期山里紅葉0.1 g置于具塞錐形瓶中，加50%甲醇25 mL，超聲45 min，過(guò)濾，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，備用。

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備 取牡荊素－2″－O－鼠李糖苷對(duì)照品適量，精密稱定，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋到刻度，搖勻。最后配置的對(duì)照品濃度為1.33 mg/mL，備用。

2.2.4 超聲提取條件考察 精密稱取不同采收期山里紅葉(第17周采收樣品)，選取了時(shí)間、溶劑這2個(gè)因素，確定超聲提取山里紅葉的優(yōu)化條件，結(jié)果見(jiàn)表5，6。

表5 超聲時(shí)間考察

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密量取對(duì)照品溶液適量分別置6個(gè)10 mL 量瓶中，其濃度分別為 4，10，25，50，100，400 μg/mL，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為:A=5.890 4C－1.873 5，r=0.999 5。

表6 溶劑考察

2.2.6 精密度試驗(yàn) 取山里紅藥材(第17周采收)6份，按供試品溶液的制備項(xiàng)下方法進(jìn)樣操作，分別測(cè)定5次，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 精密度試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取山里紅藥材(第17周采收)6份，分別按供試品溶液的制備項(xiàng)下方法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表8。

結(jié)果表明，本方法的重復(fù)性較好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將第17周采收藥材按供試品溶液的制備項(xiàng)下方法每隔2 h進(jìn)樣1次，分別測(cè)定其色譜峰面積，結(jié)果見(jiàn)表9。

表8 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表9 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，色譜峰面積在8 h內(nèi)基本無(wú)變化，表明本實(shí)驗(yàn)條件下穩(wěn)定性良好。

2.2.9 回收率試驗(yàn) 精密吸取已知牡荊素－2″－O－鼠李糖苷含量為11.14 mg/g的山里紅藥材粉末(過(guò)2號(hào)篩)6份，各0.05 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，精密加入牡荊素－2″－O－鼠李糖苷對(duì)照品溶液(1.33 mg/mL)0.4 mL，按供試品溶液制備方法操作，即得加樣回收溶液，精密吸取加樣回收溶液10 μL，注入液相色譜儀中，結(jié)果見(jiàn)表10。

表10 回收率試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，本方法回收率較高。

2.2.10 不同采收期山里紅葉單體有效成分－牡荊素－2″－O－鼠李糖苷含量的測(cè)定［4］將制備完成的23份供試品溶液分別進(jìn)樣，進(jìn)樣量 10 μL，記錄峰面積，計(jì)算牡荊素－2″－O－鼠李糖苷含量，對(duì)照品及供試品高效液相色譜圖見(jiàn)圖2。以含量(%)為縱坐標(biāo)，以采收期(周)為橫坐標(biāo)作圖，見(jiàn)圖3。

圖2 對(duì)照品牡荊素-2″-O-鼠李糖苷(a)及山里紅葉(b)高效液相色圖

3 討論

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)對(duì)5～10月23周山里紅葉的考察研究，我們確定了紫外分光光度法測(cè)定山里紅葉的總黃酮含量的最佳工藝:50%乙醇10 mL，超聲45 min。以及高效液相色譜法測(cè)定單體有效成分－牡荊素－2″－O－鼠李糖苷含量的最佳工藝:50%甲醇25 mL，超聲45 min。綜合考慮實(shí)驗(yàn)結(jié)果及藥材采收量因素，可以看出7～9月采收的山里紅葉總黃酮含量及牡荊素－2″－O－鼠李糖苷含量較高，由此推斷7～9月為山里紅葉的最佳采收期。山里紅葉有著資源豐富，價(jià)格低廉，藥理作用顯著等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的發(fā)展前景。由于不同采收期的山里紅葉化學(xué)成分含量相差較大，因此本文以總黃酮及山里紅葉中主要成分－牡荊素－2″－O－鼠李糖苷為考察指標(biāo)，分別運(yùn)用紫外可見(jiàn)分光光度法與高效液相色譜法，確定7～9月為山里紅葉最佳采收期，為科學(xué)合理的采收山里紅葉提供了科學(xué)依據(jù)。

圖3 不同采收期山里紅葉牡荊素-2″-O-鼠李糖苷含量

［1］中國(guó)藥典［S］.一部.2005:22.

［2］國(guó)家中醫(yī)藥管理局.中華本草［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999.

［3］Ying Xixiang，Lu Xiumei，Sun Xiaohong，et al.Determination of vitexin－2″－O－rhamnoside in rat plasma by ultra－performance liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry and its application to pharmacokinetic study［J］.Talanta，2007，72(4):1500－1506.

［4］崔延萍，崔樹玉.山楂葉中牡荊素鼠李糖苷含量測(cè)定［J］.中草藥，2000，31(12):906－907.