張燕 綜述 王謝桐 審校

（山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東 濟(jì)南 250021）

甲型血友病是由于凝血因子Ⅷ（coagulation factorⅧ，F(xiàn)Ⅷ）的遺傳性缺陷或缺乏，以致凝血活酶生成障礙的一種常見X連鎖隱性遺傳性疾病，約占先天性出血性疾病的85%，是目前已經(jīng)明確的單基因遺傳性疾病。男性患病率約為1／5 000，約60%患者有遺傳病家族史。目前本病尚無根治性措施，只能由凝血因子Ⅷ制品或新鮮全血預(yù)防和替代治療，但輸注血制品極有可能傳播傳染??；而且隨著使用FⅧ制品的時間延長，約2.4%～50%的患者會產(chǎn)生抗FⅧ的同種抗體［1，2］，大大降低了FⅧ的促凝血活性，使FⅧ的替代效果減低甚至無效，為家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。所以血友病攜帶者的檢測及早期診斷是有效控制致病基因傳遞，防止患兒出生，降低發(fā)病率的主要措施。血友病的產(chǎn)前診斷對于血友病家系的遺傳咨詢，減輕血友病家庭的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)，具有重要的應(yīng)用價(jià)值和社會效益。

1 甲型血友病的遺傳咨詢

甲型血友病是一種常見的X連鎖隱性遺傳性疾病，該病主要是女性傳遞，男性發(fā)病，多見隔代遺傳：① 甲型血友病男性患者與正常女性結(jié)婚，其兒子100%正常，其女兒100%為攜帶者，無甲型血友病患者出現(xiàn)；② 正常男性與甲型血友病女性攜帶者結(jié)婚，其兒子50%正常，50%為患者；其女兒50%正常，50%為攜帶者；③ 甲型血友病男性患者與甲型血友病女性攜帶者結(jié)婚，其兒子50%正常，50%發(fā)??；其女兒50%為攜帶者，50%發(fā)??；④ 正常男性與甲型血友病女性患者結(jié)婚，其兒子100%為患者，其女兒100%為攜帶者。

在甲型血友病的診斷中判斷女性攜帶者很重要，一般判斷女性攜帶者的方法有3種：① 肯定攜帶者：甲型血友病患者的女兒；生育2個或更多甲型血友病患者的母親；生育1個甲型血友病患者的母親，其家系中常有1個以上的甲型血友病患者。②可能攜帶者：某女性的母系成員中有甲型血友病患者，而她自己所生的兒子中無甲型血友病患者，或未生兒子；血友病患者的姊妹和她們所生的女兒；血友病甲患者的姨母和她們的女兒；1個兒子有血友病，而沒有其他家庭成員患有血友病的女性。③ 甲型血友病患者中，有近40%為散發(fā)病例，其母系中無他人患甲型血友病，但可檢測家系的基因情況，以發(fā)現(xiàn)攜帶者。

以前，血友病攜帶者是通過系譜分析和FⅧ活性（FⅧ：C）／血管性血友病因子抗原（vWF：Ag）的測定診斷的［3］，然而，僅能診斷出55%～60%的攜帶者。FⅧ基因是1個比較龐大的基因，其突變的異質(zhì)性非常豐富，突變類型眾多，相互異質(zhì)，且不存在種族和群體的特異性，甚至每1個甲型血友病家庭都有可能攜帶1種新的突變類型，使得該疾病的直接基因診斷難度較大。

2 甲型血友病的產(chǎn)前診斷

2.1 甲型血友病的基因突變位點(diǎn)

目前世界血友病網(wǎng)站、血友病A數(shù)據(jù)庫HAM STeRS已報(bào)道的突變有1 900多種，包括倒位、點(diǎn)突變、插入和缺失，而重型甲型血友病中22內(nèi)含子倒位約占40%～50%［4］，其次為小片段缺失／插入（10.2%）和無義突變（9.3%），而大片段缺失（3%）、剪接位點(diǎn)有關(guān)的突變（2.6%）則較少見。最近Bagnall［5］報(bào)道，F(xiàn)Ⅷ基因內(nèi)含子一斷裂引起的倒位，占重型甲型血友病的5%。中型和輕型血友病中，86%為錯義突變，此外還有5.8%患者未找到任何突變位點(diǎn)［6］。多數(shù)這些突變的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。極少數(shù)患者即不存在內(nèi)含子1或22倒位，也沒有點(diǎn)突變或插入和缺失，甚至對整個F8基因外顯子和與其相鄰的內(nèi)含子序列測序后仍找不到基因突變位點(diǎn)，只能解釋為相應(yīng)基因產(chǎn)物活性的缺失或減少，推測F8基因的不表達(dá)或表達(dá)不均衡及mRNA的快速降解是導(dǎo)致此類患者發(fā)病的病因［7-8］。

2.2 甲型血友病的產(chǎn)前診斷取材方法

2.1.1 臍帶穿刺術(shù)（cordocentesis） 妊娠中晚期（20～35周）B超引導(dǎo)下經(jīng)腹抽取胎兒臍靜脈血，成功率高，也較安全［9，10］，使用此方法較多，優(yōu)點(diǎn)是可以直接檢測FⅧ活性，不需要較高的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，20世紀(jì)國外有報(bào)道用此法進(jìn)行產(chǎn)前診斷，抽取胎兒血后提取DNA做基因診斷。

2.2.2 羊膜腔穿刺術(shù)（amniocentesis） 抽取羊水最佳時間是妊娠16～23周。此時羊水量多、胎兒浮動，穿刺容易，不易傷及胎兒?？梢灾苯訌难蛩刑旱拿撀浼?xì)胞內(nèi)提取DNA作基因診斷。國內(nèi)已有醫(yī)院開始使用此類方法對血友病進(jìn)行產(chǎn)前診斷［11］。國外已有較多應(yīng)用。

2.2.3 絨毛吸取術(shù)（chorionic villi aspiration sampling） 妊娠9～11周在B超監(jiān)視下經(jīng)宮頸取絨毛組織，絨毛枝與蛻膜嚴(yán)格分離后直接抽取DNA進(jìn)行基因分析［12，13］。此方法的優(yōu)點(diǎn)是若診斷為患者即可在孕早期終止妊娠，但流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)稍高。

2.2.4 利用流式細(xì)胞術(shù)、梯度分離法、免疫磁珠分離技術(shù)等方法從孕婦外周血中分離胎兒細(xì)胞，這是1項(xiàng)非創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷技術(shù)，目前已成為研究熱點(diǎn)［14，15］。孕婦外周血中的胎兒細(xì)胞至少有3種，即滋養(yǎng)葉細(xì)胞、有核紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，數(shù)量雖然不多，但已有用單克隆抗體或以滋養(yǎng)葉細(xì)胞表面特異性抗原的抗體作為標(biāo)記等來識別胎兒細(xì)胞。目前這項(xiàng)技術(shù)正成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，尚無臨床應(yīng)用。

2.2.5 植入前診斷（preimplantation diagnosis）［16，17］胚泡植入前，利用微操作技術(shù)和DNA擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行檢測。目前已有用PCR技術(shù)作甲型血友病的產(chǎn)前診斷，雖然僅有個別成功先例，而且操作難度大，還不能用于臨床，但前景是可觀的。

2.3 臍帶血FⅧ活性檢測應(yīng)用于甲型血友病產(chǎn)前診斷

胎兒期肝臟可以生成凝血因子，妊娠19周的胎兒血中已可測到FⅧ抗原。林琳華等［18，19］對264例19～36周胎齡的臍帶血進(jìn)行了凝血因子活性測定，結(jié)果顯示妊娠中晚期正常胎兒的FⅧ活性為45%～80%，高于甲型血友病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，提示了中晚期妊娠胎兒的臍帶血FⅧ活性測定可以作為甲型血友病高危胎兒產(chǎn)前篩查的可行性指標(biāo)。由于FⅧ活性隨著胎齡的增長而升高，個別FⅧ活性低于30%的胎兒可能只是凝血因子合成器官發(fā)育不健全而已，容易被誤診，但其誤診率低于5%［19］，顯示出明顯的優(yōu)越性。另Panigrahi等［9］在18～23周間應(yīng)用臍帶穿刺術(shù)抽取臍帶血，用于血友病和地中海貧血的產(chǎn)前診斷，結(jié)果表明臍帶血檢驗(yàn)結(jié)果和分娩后復(fù)查結(jié)果沒有偏差。15年來本院一直采用妊娠20～35周的胎兒臍帶血檢測FⅧ：C和vWF：Ag，篩查血友病患兒，結(jié)果和分娩后復(fù)查結(jié)果一致，生后至今隨訪結(jié)果無偏差。故認(rèn)為妊娠20周以后的胎兒臍帶血可以用于血友病的產(chǎn)前診斷。北京朝陽醫(yī)院趙耘等［20］報(bào)道在他們醫(yī)院曾有1例胎兒血FⅧ：C為2%，但基因診斷為正常胎兒并隨訪1年FⅧ水平正常，但有無檢測的誤差尚不清楚。到目前為止尚未有明確的甲型血友病胎兒血FⅧ：C的診斷標(biāo)準(zhǔn)，還需要大樣本的試驗(yàn)來證實(shí)。

2.4 基因檢測用于甲型血友病產(chǎn)前診斷

甲型血友病的產(chǎn)前基因診斷分為直接診斷和間接診斷。直接檢測法直接揭示遺傳缺陷，在無法獲得甲型血友病先證者DNA樣本及某些連鎖分析未能提供診斷信息時也能完成診斷，提高了診斷的可靠性。以往檢測內(nèi)含子22倒位通常采用Southern印跡雜交技術(shù)，但此技術(shù)操作步驟繁多，流程長，出結(jié)果慢，難度大，且要操作放射性同位素標(biāo)記的探針等，而LD-PCR技術(shù)則能簡便快速地檢測出FⅧ基因內(nèi)含子22倒位，并能檢出攜帶者，進(jìn)行產(chǎn)前診斷［21］。Bagnall等［5］建立了檢測內(nèi)含子1倒位的雙管多重PCR的方法。對于較大的缺失、插入（＞50 bp），以及影響限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的突變，一般用Southern印跡雜交方法檢測。對于單個堿基置換、小缺失或插入，則需對FⅧ基因的所有編碼區(qū)、側(cè)翼內(nèi)含子序列及5′端和3′端UTR進(jìn)行全面分析，設(shè)計(jì)37對引物擴(kuò)增所有外顯子及其側(cè)翼內(nèi)含子序列。隨著PCR的廣泛應(yīng)用，單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、異源雙鏈分析、變形梯度凝膠電泳、化學(xué)錯配切割、構(gòu)象敏感凝膠電泳等結(jié)合DNA測序已被廣泛用于FⅧ基因突變的篩查。常用直接診斷方法有：

2.4.1 長距離PCR 目前國內(nèi)外均有學(xué)者報(bào)道應(yīng)用LD-PCR技術(shù)對內(nèi)含子22進(jìn)行診斷并取得滿意的結(jié)果，成為擴(kuò)增內(nèi)含子22倒位的首選方法。

長距離PCR（LD-PCR）引物設(shè)計(jì)及檢測FⅧ基因倒位的原理：22內(nèi)含子含有兩個巢式基因（FⅧA和FⅧB），F(xiàn)ⅧA在FⅧ基因上游約400kb及500 kb有2個同源拷貝（A2和A3），由于FⅧA1與FⅧA2、FⅧA3的高度同源序列長達(dá)9.5kb，倒位可發(fā)生在該9.5kb范圍內(nèi)的任何位置，無法確定，因此必須把引物設(shè)計(jì)在9.5kb序列以外的非同源序列區(qū)。引物P、Q是只特異于IVS-22（22內(nèi)含子倒位）中FⅧA 1的兩側(cè)各約1.2kb處的序列。引物A、B則是特異于FⅧA2、FⅧA3的兩側(cè)各約100～200bp處的序列。當(dāng)同時使用4個引物，即P、Q、A、B進(jìn)行LD-PCR時，如果模板基因組DNA沒有FⅧ基因倒位，那么將引物PQ及野生型FⅧ基因得到12kb的擴(kuò)增帶，從FⅧA2、FⅧA3及引物AB得到10kb的擴(kuò)增帶。如果模板基因組DNA是這種基因倒位的重型甲型血友病患者的DNA，從引物P和B將會得到11Kb擴(kuò)增帶，引物A與Q也將發(fā)揮作用而產(chǎn)生同樣長度即11kb的擴(kuò)增帶；同時，由于該基因倒位只改變了FⅧA2及FⅧA3中1個基因的結(jié)構(gòu)，而另1個仍然保持野生型，因此A、B引物對仍能從這一野生型FⅧA模板擴(kuò)增出10kb的產(chǎn)物，但無法得到12kb產(chǎn)物。如果模板DNA是來自1位女性攜帶者，則其LD PCR產(chǎn)物中將有11kb，12kb及10kb條帶。這3種擴(kuò)增產(chǎn)物能夠用0.6%瓊脂糖凝膠電泳很好地分開。也有學(xué)者用P、Q、B及P、Q、A 3個引物的系統(tǒng)進(jìn)行了一些研究，取得了滿意的結(jié)果。

2.4.2 直接測序法（direct sequencing，DS） 通過DNA自動測序儀對FⅧ基因直接進(jìn)行測序，找出突變的確切位置，可提供最為準(zhǔn)確的信息。目前，測序模板主要來源于PCR產(chǎn)物，將雙鏈PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為單鏈測序模板。DS是最直接、最準(zhǔn)確的基因診斷方法，但是，由于是對整段基因進(jìn)行測序，工作量大、時間長、限制了其在甲型血友病產(chǎn)前診斷上的廣泛應(yīng)用［22］。

2.4.3 變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel ectrophoresis，DGGE） DGGE是1種根據(jù)DNA解鏈特性分離鑒定DNA片段的技術(shù)，利用野生型和突變型DNA在變性梯度凝膠電泳過程中遷移率不同來檢測基因突變。PCR／DGGE法很適合于大基因點(diǎn)突變的篩選，將PCR產(chǎn)生的雙鏈DNA在含濃度遞增的變性劑（尿素和甲酰胺）的凝膠上電泳。隨著DNA的遷移，具有序列依賴性的低解鏈溫度區(qū)的雙鏈漸漸打開，這部分的解鏈導(dǎo)致遷移率下降。發(fā)生突變的片段形成的異二聚體在較低的變性溫度下就發(fā)生變性，從而與正常條帶分離，實(shí)驗(yàn)證明僅有1個堿基的替換即可用此法檢測出來，檢出泳動部位后行DNA測序。與SSCP相比，DGGE較可靠、精確，無同位素污染，且檢測的DNA長度增加。

2.4.4 單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single strand conformation polymorphism，SSCP） 近年常用PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法（PCR-SSCP）。PCR產(chǎn)物變性后得到2條互補(bǔ)的單鏈，若其中任1條存在基因突變，其構(gòu)象即改變，在非變性聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）中電泳的遷移率亦改變，借此找到突變位點(diǎn)。異源雙鏈分析法（heterodup lex analysis，HA）同SSCP方法相似，此法對于小片段DNA（小于300bp）的敏感性同SSCP。SSCP的優(yōu)點(diǎn)是簡便易行，亦較敏感，只要基因突變影響了單鏈構(gòu)象，小至單個堿基的改變即可被檢出。但其敏感性隨DNA長度增加而降低，受檢片段最適長度約為300bp，不超過350bp。

2.4.5 構(gòu)象敏感凝膠電泳（conformation sensitive gel electrophoresis，CSGE） 原理是用多重PCR方法分別擴(kuò)增FⅧ的各外顯子及其側(cè)翼和5′、3′區(qū)，然后與正常的PCR產(chǎn)物混和，發(fā)生突變的DNA片段形成異二聚體，在輕度變性的凝膠上電泳。插入、缺失和單堿基改變都會引起二聚體構(gòu)象的改變，從而阻滯或促進(jìn)異二聚體的電泳速度，與正常對照相比其電泳條帶發(fā)生改變。插入或缺失的片段越大，其條帶與正常條帶分開的距離越大。

2.4.6 變性高效液相色譜（denaturing high performance liquid chromatograthy，dHPLC）是1種新的高效的突變檢測技術(shù)，對FⅧ基因內(nèi)突變的檢測率達(dá)96%。利用高效液相色譜原理，通過1個DNASep分離柱進(jìn)行核苷酸片段的分離和分析。該法快速高效，易于自動化。正如SSCP、DGGE一樣，dHPLC不能確定突變的具體位置，但被檢片斷的長度可達(dá)1 500bp以上。

2.4.7 化學(xué)錯配裂解法（chemical mismatch cleavage，CMC）其原理是將同位素標(biāo)記的野生型DNA分子和突變型的DNA（或RNA）片段混合變性，復(fù)性時可形成DNA-DNA或DNA-RNA異源雙鏈，然后對突變部位的錯配堿基進(jìn)行化學(xué)修飾，氮雜環(huán)已烷在修飾位點(diǎn)可裂解標(biāo)記的DNA片段，通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及放射自顯影即可確定有無突變。

應(yīng)用直接基因診斷方法雖然可檢測出大多數(shù)甲型血友病患者的基因突變，但一部分病例需要應(yīng)用基因內(nèi)外多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行連鎖分析［23］，通過間接基因診斷尋找突變位點(diǎn)。間接診斷可適用的情況包括：① 曾做過多態(tài)性位點(diǎn)的連鎖分析，但未能找到突變位點(diǎn)的家系；② 不能確定或找不到基因的致病突變；③ 基因大部分缺失導(dǎo)致突變的家系。對于散發(fā)的血友病A家系，連鎖分析僅能在女性成員的多態(tài)性位點(diǎn)不同于先證者時，可以對女性成員排除其為攜帶者的診斷。常用的間接診斷方法：

① 限制性片段長度多態(tài)性法（restriction fragment length polymorphisms，RFLP）利用致病基因內(nèi)外的限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）作為特異分子遺傳標(biāo)志物，通過家系成員間的連鎖關(guān)系確定血友病基因的遺傳情況，進(jìn)行DNA多態(tài)性分析的遺傳學(xué)診斷方法［24］。RFLP通過與疾病基因的連鎖關(guān)系而直接分析，不需要分析基因產(chǎn)物，大大拓寬了基因定位范圍。但是，RFLP應(yīng)用也有其局限性：首先必須具有先證者的標(biāo)本；其次母親要求是該多態(tài)位點(diǎn)的雜合子；最后必須聯(lián)合多個RFLP才可診斷。FⅧ基因內(nèi)共有四個基因內(nèi)多態(tài)性位點(diǎn)：BclⅠ／內(nèi)含子18、HindⅢ／內(nèi)含子19、XbaⅠ／內(nèi)含子22和BglⅠ／內(nèi)含子25，和兩個基因外的多態(tài)性變異：TaqⅠ／位點(diǎn)DXS52（St14DNA檢驗(yàn)）和BglⅡ／位點(diǎn)DXS15（DX13DNA檢驗(yàn)）。其中最有信息的多態(tài)性位點(diǎn)為FⅧ基因BclⅠ和Xbal、TaqⅠ／St14。隨著PCR技術(shù)的日趨完善，現(xiàn)已使用PCR結(jié)合酶解進(jìn)行限制性內(nèi)切酶片段長度態(tài)性分析（PCRRFLP）取代了RFLP，成為臨床的對非倒位輕、中型甲型 血 友 病 的 產(chǎn) 前 診 斷 的 經(jīng) 典 方 法 之 一［25，26］。PCR從方法上解決了RFLP的困難，但理論上仍無法提高RFLP多態(tài)位點(diǎn)的雜合性。

② 可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)序列（variable number of tandem repeat，VNTR）又稱小衛(wèi)星DNA，是人類基因組中種類多、分布廣又具有高度多態(tài)性的小片段重復(fù)序列，其長度多為60～70bp，是人類基因組中常見的1種多態(tài)標(biāo)記，其應(yīng)用十分廣泛，已報(bào)道2種VNTR：int13和stl4-1（DXS52）。其中St14位點(diǎn)內(nèi)含VNTR多態(tài)序列，與FⅧ基因緊密連鎖，因此以此為遺傳標(biāo)記可進(jìn)行甲型血友病的基因診斷。DXS52（ST14）位點(diǎn)［27］是1個具有多個等位基因的可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)順序（variable number tandem repeat，VNTR）位點(diǎn)，女性的雜合頻率高，而且PCR擴(kuò)增后可直接進(jìn)行瓊脂糖電泳，簡便快速，但在進(jìn)行結(jié)果分析和遺傳咨詢分析時不能忽視St14位點(diǎn)VNTR與FⅧ基因存在的重組率。

對于不存在內(nèi)含子22倒位的家系進(jìn)行攜帶者或產(chǎn)前診斷，利用基因多態(tài)性進(jìn)行遺傳連鎖分析則成為重要手段。二核苷酸重復(fù)序列屬于微衛(wèi)星的1種，作為第2代遺傳標(biāo)記，廣泛地運(yùn)用于遺傳性疾病的基因診斷和個體識別［28，29］。

間接診斷存在的問題主要有：① 缺乏家族史時，由于產(chǎn)生新的突變及嵌合體現(xiàn)象的存在，間接診斷可能是不正確的；② 家系中的先證者去世，不能提供有效依據(jù)的信息，連鎖分析往往不能進(jìn)行；③當(dāng)關(guān)鍵的家系女性成員如先證者母親在選擇的多態(tài)性位點(diǎn)上表現(xiàn)為純合子時，不能為連鎖分析提供有效信息，給連鎖分析帶來困難；④選擇的多態(tài)性位點(diǎn)可能與基因發(fā)生重組，會造成誤診。

血友病攜帶者診斷的目的是區(qū)別攜帶者及正常女性，使后者可以正常婚育及對攜帶者的胎兒進(jìn)行基因檢測，以避免患兒出生。由于導(dǎo)致甲型血友病的FⅧ基因突變主要為內(nèi)含子22倒位和異質(zhì)性極強(qiáng)的點(diǎn)突變，因此，對于HA可疑攜帶者作基因診斷及產(chǎn)前診斷的方案，是比較合理的：先用LDPCR、多重PCR的方法檢測是否有倒位突變，這使近30%的患者得到直接診斷，對于對非倒位的重型甲型血友病患者和輕、中型甲型血友病的家系可用連鎖分析方法，最后對仍未能診斷的病例采取基因測序的方法，以便發(fā)現(xiàn)新突變。對于無家族史的或無先證者的，排除倒位后直接進(jìn)行基因測序以求尋找突變位點(diǎn)。產(chǎn)前診斷的取材技術(shù)應(yīng)根據(jù)孕婦的孕齡，家屬的要求，接受程度及經(jīng)濟(jì)基礎(chǔ)等情況來選擇，做到因人而異，因孕周而異。

目前，本院主要是通過對妊娠20～35周血友病高危且懷有男性胎兒的孕婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷。于妊娠20～35周，在B超引導(dǎo)下行胎兒臍靜脈血穿刺術(shù)，血液離心后血漿測FⅧ：C，根據(jù)血漿FⅧ：C結(jié)果判斷胎兒是否為血友病高危兒。血細(xì)胞用于基因診斷，來驗(yàn)證血漿FⅧ：C檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，雖然實(shí)驗(yàn)室基因診斷已較為成熟，但由于各種因素，本院尚未正式進(jìn)行血友病的臨床基因診斷工作。

行產(chǎn)前診斷后的孕婦，根據(jù)產(chǎn)前診斷的不同結(jié)果給予不同的意見。FⅧ：C過低，及基因診斷結(jié)果異常的胎兒給予引產(chǎn)；FⅧ：C達(dá)到正常成人范圍的，及基因診斷結(jié)果正常的胎兒繼續(xù)妊娠。對于攜帶者，待其妊娠19周時先行B超檢查，如為女性胎兒則繼續(xù)妊娠，出生后行攜帶者診斷或妊娠后產(chǎn)前診斷，如為男性胎兒則進(jìn)行胎兒血FⅧ：C檢測和基因診斷。

由于FⅧ基因分子量較大，目前僅了解其部分的基因序列，基因診斷仍會漏診部分患兒。血友病是1個終生疾病，現(xiàn)在尚無治愈方法，替代治療又給血友病患者帶來嚴(yán)重的并發(fā)癥，給家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)。因此認(rèn)為有必要對血友病高危人群的孕婦進(jìn)行積極的遺傳篩查和產(chǎn)前診斷，以減少血友病患兒的出生并減輕血友病家庭的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)。

［1］ McMillan CW，Shapiro SS， Whitehurst D，et al.The Natural History of Factor VⅢ：C Inhibitors in Patients With Hemophilia A： A National Cooperative Study. Ⅱ.Observations on the initial Development of Factor VⅢ：C Inhibitors［J］.Blood，1988，71：344-348.

［2］ Ehrenforth S，Kreuz W，Scharrer I，et al.Incidence of Development of Factor VⅢand FactorⅨInhibitors in Haemophiliacs［J］.Lancet，1992，339：594-598.

［3］ Ahmed R，Gupta PK，Kannan M，et al.Hemophilia A：role of FVIIIC／VWF Ag in assisting linkage analysis for carrier detection［J］.Clin Appl Thromb Hemost，2004，10：127-131.

［4］ Lakich D， Kazazian HH Jr， Antonarakis SE，et al.Inversions disrupting the factorⅧgene are a common cause of severe haemophilia A［J］.Nat Genet，1993，3：236-241.

［5］ Bagnall RD，Waseem N，Green PM，et al.Recurrent inversion breaking intron 1of the factor VⅢgene is a frequent cause of severe hemophilia A［J］.Blood，2002，1：168-174.

［6］ Goodeve AC，Peake IR.The molecular basis of hemophilia A：geno typephenotype relationships and inhibitor development［J］.Sem in Thromb Hemost，2003，1：23-30.

［7］ El-Maarri O，Herbiniaux U，Graw J，et al.Detailed RNA analysis in haemophilia A patients with previously undetectable mutations［J］.J Thromb Haemost，2005，3：332-339.

［8］ Klopp N，Oldenburg J，Uen C，et al.11Hemophilia A patients without mutations in the factor VⅢencoding gene［J］.Thromb Hemost，2002，88：357-360.

［9］ Panigrahi I，Ahmed RP，Kannan M，et al.Cord Blood Analysis for Prenatal Diagnosis of Thalassemia major and Hemophilia A［J］.Indian Pediatr，2005，6：577-581.

［10］ 王謝桐，陳延琴，賈濤，等.應(yīng)用PTC針取胎兒血進(jìn)行產(chǎn)前診斷49例臨床分析［J］.中國實(shí)用婦科與產(chǎn)科，2001，5：295-296.

［11］ 陸曄玲，丁秋蘭，戴菁，等.血友病攜帶者與產(chǎn)前基因診斷［J］.中國輸血雜志，2008，21：259-264.

［12］ Acquila M，Bicocchi MP，Bottini F，et al.A rap id p renatal diagnosis of hemophilia A by DNA analysis on crude chorionic villus biopsy［J］.Haematologica，1999，4：382-383.

［13］ Ranjan R，Biswas A，Kannan M，et al.Prenatal diagnosis of haemophilia A by chorionic villus sampling and cordocentesis：All India institute of Mdeical Science experience［J］.Vox Sanguinis，2007，92：79-84.

［14］ 黃艷儀，陳小蔓，孔舒，等.孕婦血漿中胎兒DNA檢測在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2002，12：715-717.

［15］ Choe J，Hwang D，Kim KC，et al.gender determination and BclI polymorphism using nucleated erythrocytes in maternal blood［J］.J Histochem Cytochem，2005，3：323-327.

［16］ Xu Y，Zhuang G，Shu Y.Preimp lantation gender diagnosis by fluorescence in situ hybridization［J］.Chin Med J（Engl），2002，6：874-877.

［17］ 徐艷文，莊廣倫，李滿，等.熒光原位雜交技術(shù)在胚胎植入前性別診斷中的應(yīng)用［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2000，8：465-467

［18］ 林琳華，霍梅，袁紅，等.不同胎齡胎兒部分凝血因子水平測定［J］.中華血液學(xué)雜志，2006，8：561-562.

［19］ 林琳華，袁紅，任景慧，等.胎兒凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ的生成趨勢［J］.中國產(chǎn)前診斷雜志（電子版），2009，1（1）：15-18.

［20］ 趙耘，梁燕，王戰(zhàn)勇，等.胎兒甲型血友病的基因診斷［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2008，4：262-265.

［21］ Fang Y，Wang XF，Dai J，et al.A rapid multifluorescent polymerase chain reaction for genetic counselling in Chinese haemophilia A families［J］.Haemophilia，2006，121：62-67.

［22］ Fiorentino F， MagliM C， Podini D， et al.The minisequencing method：an alternative strategy for p reimp lantation genetic diagnosis of single gene disorders［J］.Mol Hum Rep rod，2003，7：399-410.

［23］ Pandey GS，Mittal B.Molecular Diagnosis in Haemophilia A［J］.J Postgrad Med，2001，47：274-280.

［24］ Nuzhat Husain.Carrier anarysis for hemophilia A：ideal versus acceptable［J］.Expert Rev Mol Diagn，2009，3：203-207.

［25］ Petkova R，Chakarov S，Kremensky I.Genetic analysis of haemophilia A in Bulgaria［J］.BMC Blood Disord，2004，1：2.

［26］ Pandey GS，Mittal B.Molecular diagnosis in haemophilia A［J］.J Postgrad Med，2001，4：274-280.

［27］ Hussein IR，EL-Beshlaway A，Salem A，et al.The use of DNA markers for carrier detection and prenatal diagnosis of haemophilia A in Egyptian families［J］.Haemophilia，2008，14：1082-1087.

［28］ B Rabbani，A Rezaeian，H Khanahmad，et al.Analysing two dinucleotide repeats of FVⅢgene in Iranian population［J］.Haemophilia，2007，13：740-744.

［29］ A Vencesla，M Baena，L Farestaie.Application of intron 9 and intron 25dinucleotide repeats of the factor VIII gene for carrier diagnosis in haemophilia A［J］.Haemophilia，2008，14：489-493.