朱甫祥，宮賢弟，劉澤隆，楊樹德，屈慧鴿，遲曉艷

1 魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，煙臺 264025

2 Department of Physiology & Biophysics, Medical college of Dalhousie University, Halifax B3H 4H7, Canada

CFTR (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) 為cAMP依賴性氯離子 (Cl?) 通道蛋白，由5個結(jié)構(gòu)域組成：2個跨膜結(jié)構(gòu)域 (Transmembrane domains，TMDs)、2個核苷酸結(jié)合域 (Nucleotidebinding domains，NBDs) 和1個調(diào)節(jié)域 (Regulatory domain，RD)。囊性纖維化 (Cystic fibrosis，CF) 是由該基因突變引起的一種常染色體隱性遺傳疾病[1]。屬于單基因突變的該病是體細胞基因治療的適應(yīng)癥。因此自1989年CFTR基因的成功克隆，對CF的基因治療研究成為熱點?；蛑委熤泻线m的基因運載體系是關(guān)鍵，在眾多已開發(fā)的載體系統(tǒng)中，腺輔助病毒 (Adeno-associated viruses，AAV) 由于非致病性、可感染非增殖期細胞、定點整合宿主基因組使轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定表達且安全性高以及不會引起宿主免疫反應(yīng)等優(yōu)點，為基因治療的理想載體，而且AAV5具有靶向感染呼吸道上皮細胞的特性[2]，使其特別適合CFTR基因的呼吸道上皮細胞的定向轉(zhuǎn)移。CFTR的編碼序列長4.4 kb，加上基因調(diào)控序列，難以為包裝容量上限為4.7 kb的AAV所承載。Intein的蛋白質(zhì)反式剪接作用為雙AAV載體轉(zhuǎn)運CFTR基因提供了一種分子手段。Intein為包埋于原核生物和單細胞真核生物某些蛋白前體中的一段多肽序列，翻譯后通過蛋白質(zhì)剪接反應(yīng)被切除，同時兩側(cè)的宿主蛋白以肽鍵相連[3]。蛋白質(zhì)剪接分順式和反式兩種形式。對split Ssp DnaB intein的研究表明其可介導(dǎo)非天然宿主蛋白的反式剪接反應(yīng)[4]。不同的intein之間氨基酸序列同源性較低，只在剪接部位存在直接參與剪接反應(yīng)的保守氨基酸殘基[5]。

本文選擇于CFTR cDNA緊鄰NBD2的Ser839密碼子前將其斷裂成兩部分，分別與split Ssp DnaB intein基因融合，構(gòu)建一對真核表達載體，共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的真核細胞，瞬時表達觀察CFTR的剪接，膜片鉗記錄細胞的 CI?電流和通道開放活性，為運用雙AAV載體轉(zhuǎn)CFTR基因的CF基因治療研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

質(zhì)粒pMST (含split Ssp DnaB intein編碼序列)由加拿大Dalhousie大學(xué)醫(yī)學(xué)院Paul Liu教授實驗室提供。含CFTR的質(zhì)粒pIRES2-EGFP-CFTR和幼年倉鼠腎臟細胞 (Baby hamster kidney，BHK) 由加拿大Dalhousie大學(xué)醫(yī)學(xué)院Paul Linsdell教授提供。綠色熒光蛋白表達質(zhì)粒 pEGFP-N1和黃色熒光蛋白表達質(zhì)粒EYFP-N1購自Clontech公司。內(nèi)切酶、DNA連接酶試劑盒為New England Biolabs公司產(chǎn)品。高保真Pfu Turbo DNA聚合酶購自Stratagene公司。Gel Extraction Kit、PCR Purification Kit、Spin Miniprep Kit為 Qiagen公司產(chǎn)品。DMEM 和Opti-MEM培養(yǎng)基、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen公司。胎牛血清購自Hyclone公司。山羊抗人CFTR的N端和C端抗體N-20和C-19購自Santa Cruz公司。兔抗山羊HRP-二抗和ECL plus Western Blotting Detection試劑盒購自 Amersham Pharmacia Biotech (GE) 公司。其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純，電生理實驗所用試劑除注明外均為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 真核表達載體的構(gòu)建

考慮到 intein下游剪接位點附近氨基酸組成對剪接反應(yīng)的影響，選擇于CFTR的TMD2后與Ssp DnaB intein天然宿主蛋白具有2個相同殘基的Ser839Ile840前斷裂CFTR。用Pfu Turbo DNA聚合酶、引物P1和P2進行PCR從pIRES2-EGFP-CFTR擴增CFTR的N端編碼序列，用引物P3和P4從pMST擴增split Ssp DnaB intein N端106個氨基酸 (IntN)的編碼序列，分別用Pst I/Nsi I和Nsi I/BamH I酶切2種 PCR產(chǎn)物，與 EcoR I/BamH I酶切的載體pEGFP-N1連接，得到CFTR的N端與IntN的融合表達質(zhì)粒pEGFP-NInt。用P5、P6和P7、P8引物對分別從pMST和pIRES2-EGFP-CFTR擴增split Ssp DnaB intein的C端48個氨基酸 (IntC) 的編碼序列和CFTR的C端編碼序列，分別用EcoR I/ApaL I和ApaL I/BamH I酶切，與EcoR I/BamH I酶切的載體pEYFP-N1連接，得到IntC與CFTR的C端的融合表達質(zhì)粒pEYFP-IntC。同時構(gòu)建CFTR的N端和C端表達載體 pEGFP-N和 pEYFP-C以及全長CFTR的表達載體pEGFP-CFTR作為對照，構(gòu)建作為所用引物及序列見表1，由上海生工公司合成。

表1 構(gòu)建載體所用寡核苷酸引物及序列Table 1 Primers and sequences used in vector construction

1.3 細胞培養(yǎng)及基因轉(zhuǎn)染

BHK細胞于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液貼壁培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1天用胰蛋白酶消化分散細胞，按每孔5×105個細胞于2 mL DMEM 培養(yǎng)液將細胞接種于含蓋玻片的 6孔培養(yǎng)板，待細胞生長融合至80%以上時，用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體按試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)染，將2種質(zhì)粒pEGFP-NInt和pEYFP-IntC按1∶1比率各4 μg混合稀釋于250 μL的Opti-MEM培養(yǎng)液，與室溫放置5 min的含20 μL脂質(zhì)體的250 μL Opti-MEM培養(yǎng)液混合后繼續(xù)室溫放置20 min，共轉(zhuǎn)染BHK細胞，同時，用4 μg的pEGFP-N和pEYFP-C共轉(zhuǎn)染并分別單獨轉(zhuǎn)染BHK細胞。用4 μg的pEGFP-CFTR作為陽性對照、4 μg的質(zhì)粒載體pEGFP-N1作為陰性對照 (Mock) 轉(zhuǎn)染BHK細胞。培養(yǎng)箱內(nèi)溫育5 h后換以2 mL的新鮮Opti-MEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞用于Western blotting檢測。用作電生理記錄的細胞基因轉(zhuǎn)染于底部放置蓋玻片的培養(yǎng)板，使細胞貼壁于玻片生長。

1.4 Western blotting觀察CFTR蛋白的剪接

將胰蛋白酶消化收集的細胞，液氮3 min、37℃3 min反復(fù)凍融3次，提取細胞總蛋白。用Bradford法進行蛋白定量，取12 μg總蛋白上樣進行還原性SDS-PAGE，半干電轉(zhuǎn)法將蛋白印跡至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h，用1∶1 000稀釋的CFTR抗體N-20或C-19于37℃輕搖孵育1 h，用HRP-抗山羊血清37℃輕搖孵育1 h，ECL plus法曝光X膠片。

1.5 膜片鉗記錄

熒光顯微鏡下觀察于蓋玻片貼壁生長的轉(zhuǎn)基因BHK細胞，根據(jù)轉(zhuǎn)基因所帶有的熒光蛋白基因的表達，選擇熒光強度高且在細胞膜上表達的細胞進行記錄。全細胞膜片鉗記錄參照筆者以前報道的方法進行[6]，細胞浴池液 (細胞外液) 的成分及濃度為：140 mmol/L HCl，2 mmol/L MgCl2，10 mmol/L N-羥甲基-2-氨基乙醇磺酸 (TES)；電極液 (細胞內(nèi)液)的成分及濃度為：110 mmol/L天冬氨酸，30 mmol/L HCl，1 mmol/L MgCl2，10 mmol/L TES，1 mmol/L MgATP，0.1 mmol/L EGTA。兩種液體均用N-甲基-D-葡糖胺調(diào)至 pH 7.4。用電極吸附細胞獲得全細胞構(gòu)型后，記錄背景電流，然后滴加以下混合液至細胞浴池中激活CFTR通道蛋白：2 μmol/L 毛喉素，100 μmol/L 8-(4-氯酚硫-3′，5′-環(huán)腺苷酸 (pCPT-cAMP)，100 μmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)。單通道膜片鉗記錄參照筆者以前報道的方法進行[7]。電極液(細胞外液) 和細胞浴池液 (細胞內(nèi)液) 的成分和濃度為：150 mmol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2，10 mmol/L TES，用 NaOH調(diào) pH至 7.4。形成內(nèi)面向外式(Inside-out membrane patches) 記錄結(jié)構(gòu)后，在細胞浴浴滴中加以下溶液激活 CFTR通道蛋白：蛋白激酶A催化亞基 (PKA，80~120 nmol/L，Promega公司產(chǎn)品) 和1 mmol/L MgATP。

細胞電流以2 kHz (全細胞) 或50 Hz (單通道)的低頻過濾，用pCLAMP8軟件 (Axon instrument)進行分析。用 pCLAMP8軟件測得的平均全細胞電容為 (25.9±1.7) pF (n=19)。

1.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 斷裂CFTR基因與intein融合真核表達載體的構(gòu)建

Intein剪接反應(yīng)除了其本身剪接位點的保守性氨基酸參與，還有賴于緊臨下游剪接位點的宿主蛋白的保守性氨基酸殘基，即Ser、Cys或Thr，選擇與Ssp DnaB intein下游天然宿主蛋白第1個殘基相同的 Ser839前斷裂 CFTR，分別與 split Ssp DnaB intein融合，插入pEGFP-N1和pEYFP-N1，得到1對融合intein的CFTR兩段基因并于3′末端分別帶有綠色熒光蛋白和黃色熒光蛋白基因的真核表達載體pEGFP-NInt和pEYFP-IntC，如圖1所示。所構(gòu)建的載體經(jīng)酶切電泳進行鑒定并通過 DNA測序進行確認。

2.2 CFTR蛋白表達和剪接的Western blotting結(jié)果

圖1 斷裂CFTR基因與intein融合重組基因結(jié)構(gòu)及剪接示意圖Fig. 1 Schematic representation of recombinant intein-fused split CFTR genes and splicing. The split CFTR half genes severed between Glu838-Ser839 were fused with intein respectively. These two fused genes are inserted into pEGFP and pEYFP vectors separately under the control of CMV promoter/enhancer with EGFP and EYFP following their C termili. The separately expressed CFTR half proteins would be ligated to an intact CFTR protein under the intein-mediated protein trans-splicing.

細胞總蛋白Western blotting分別用CFTR的N末端抗體 (N-20) 和 C末端抗 (C-19) 體檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染陽性對照質(zhì)粒pEGFP-CFTR的BHK細胞可見明顯融合有EGFP的CFTR蛋白條帶 (195 kDa)，Mock轉(zhuǎn)染細胞未見 CFTR蛋白條帶，共轉(zhuǎn)染pEGFP-NInt和pEYFP-IntC的細胞用兩種抗體均可見一明顯的與陽性對照同樣大小的剪接形成的CFTR蛋白條帶，同時可見未完全剪接的 intein融合蛋白前體 NInt和 IntC。共轉(zhuǎn)染 pEGFP-N和pEYFP-C的細胞只可見分別表達的CFTR的N端蛋白和 C端蛋白，另外，單獨轉(zhuǎn)染 pEGFP-N或pEYFP-C的細胞可見表達的CFTR的N端蛋白或C端蛋白 (圖2)。

圖2 檢測CFTR表達和剪接的Western blotting印跡結(jié)果Fig. 2 Western blotting assay of CFTR expression and splicing. (A, B) The antibodies against CFTR N-terminus (N-20) and C-terminus (C-19) were used as probes respectively. 1 and 6: mock control; 2 and 7: positive control of wild type CFTR gene transfection; 3 and 8: NInt and IntC co-transfection; 4 and 9: N and C co-transfection; 5: N transfection alone; 10: C transfection alone. N-C: ligated CFTR by protein trans-splicing; NInt and IntC: non-spliced precursor peptides; CFTR-N and CFTR-C: expressed CFTR N and C termini.

2.3 電生理記錄結(jié)果

全細胞電壓鉗模式下記錄的Cl?電流顯示，陽性對照轉(zhuǎn)染wtCFTR的BHK細胞經(jīng)cAMP激活后，記錄到較大的 Cl?電流，而 Mock轉(zhuǎn)染細胞未記錄到Cl?電流，NInt+IntC共轉(zhuǎn)染BHK細胞可記錄到明顯的Cl?電流，表明intein的蛋白質(zhì)反式剪接產(chǎn)生的完整CFTR蛋白具有與wtCFTR相似的Cl?通道功能，而N+C共轉(zhuǎn)染細胞也可記錄到低水平的Cl?電流，而單獨轉(zhuǎn)染N或C端基因的細胞未記錄到Cl?電流，說明兩段 CFTR蛋白盡管沒有 intein介導(dǎo)的共價連接，也可通過某種機制形成一定的Cl?通道功能 (圖3)。當(dāng)實驗電壓為?60 mV時，根據(jù)細胞膜電容進行標(biāo)準(zhǔn)化處理得到的電流密度 (用pA/pF表示) (每組n=4)，陽性對照轉(zhuǎn)染細胞 (wtCFTR) 經(jīng)cAMP激活后的電流密度為 495±76，NInt+IntC共轉(zhuǎn)染細胞為445±68，二者無顯著差異 (P＞0.05)，而 N+C共轉(zhuǎn)染細胞為225±34，與NInt+IntC共轉(zhuǎn)染細胞相比明顯要小 (P＜0.05) (圖4)。

內(nèi)面向外式 (Inside-out) 單通道膜片鉗記錄結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染NInt+IntC的BHK細胞表現(xiàn)的PKA和ATP依賴性Cl?通道開放活性類似于wtCFTR基因轉(zhuǎn)染細胞 (圖5A)；據(jù)此記錄計算的NInt+IntC共轉(zhuǎn)染細胞的平均通道開放概率為0.39±0.05，轉(zhuǎn)wtCFTR為0.42±0.03，二者相比差別無顯著意義 (P＞0.05)，而明顯高于N+C共轉(zhuǎn)染細胞的0.098±0.01 (P＜0.01) (圖5B)。

3 討論

圖3 全細胞模式記錄的轉(zhuǎn)基因BHK細胞Cl?電流Fig. 3 Recording of whole cell CFTR Cl? currents in gene transfected BHK cells. The cells expressing EGFP alone control or EGFP-fused wtCFTR were set as mock (left top) or positive control (left middle). The whole cell currents of cells coexpressing NInt+IntC (left bottom), N+C (right top), individual N (right middle) or C part (right bottom) of CFTR were recorded both before (Control) and after (+cAMP) addition of forskolin (2 μmol/L), pCPT-cAMP (100 μmol/L) and IBMX (100 μmol/L) to the bath solution. Voltage steps were from ?60 mV to +60 mV in 20 mV increments from a holding potential of -14.

圖4 轉(zhuǎn)基因細胞的電流密度Fig. 4 Current density of gene transferred BHK cells. Mean cAMP-activated current density was measured at ?60 mV from experiments such as those shown in Fig. 3. Mean of data from 4 patches in each case. * P>0.05 vs wtCFTR group, **P<0.01 vs NInt+IntC group.

圖5 轉(zhuǎn)基因細胞單CFTR通道門控特征Fig. 5 Gating properties of single CFTR channel from gene transferred cells. (A) Unitary currents recorded from inside-out membrane patches at a membrane potentials of ?50 mV (C means channel closed and O means channel open). (B) Mean channel open probability estimated from such recordings lasting at least 60 s. * P>0.05 vs wtCFTR group, ** P<0.01 vs NInt+IntC group.

通過于Ser839前斷裂的CFTR與split Ssp DnaB intein融合的雙載體培養(yǎng)的BHK細胞基因共轉(zhuǎn)染實驗，翻譯后 intein的蛋白質(zhì)反式剪接作用使分別表達的CFTR兩段多肽連接成完整的CFTR蛋白，并且較好地恢復(fù)了Cl?通道功能，表明intein可作為一種技術(shù)手段進行雙載體系統(tǒng)的 CFTR基因轉(zhuǎn)移。Intein的蛋白質(zhì)剪接作用包括4步反應(yīng)，直接參與剪接反應(yīng)的保守性氨基酸殘基位于 intein與宿主蛋白的交界處，即上游剪接位點 intein的第 1個殘基、下游剪接位點的 intein的最后 1個殘疾和與之緊鄰的宿主蛋白首個殘基，蛋白質(zhì)剪接的特點在于其不依賴細胞機制，也不需要消耗能量，是 1個完全自發(fā)的過程[8]。盡管如此，在滿足剪接部位保守性氨基酸殘基組成的前提下，Intein對不同的外源蛋白表現(xiàn)出不同的剪接效率，說明剪接位點附近特別是下游外源蛋白的其他殘基對剪接反應(yīng)的影響，因此，本研究所選擇的CFTR斷裂點的Ser839后為Ile840，這2個殘基與所用intein下游天然宿主蛋白相同，共轉(zhuǎn)染后的Western blotting結(jié)果顯示，Intein對此斷裂點的兩段CFTR多肽可進行有效剪接，但仍可檢測到未被完全剪接的前體蛋白，可能的原因為剪接反應(yīng)本身的不完全，或者兩種基因轉(zhuǎn)染效率和/或表達水平的不均衡性所致。電生理結(jié)果顯示，剪接所形成的CFTR蛋白具有與野生型CFTR相似的Cl?通道功能，全細胞膜片鉗記錄到較高的cAMP依賴性Cl?電流和較高的電流密度，單通道膜片鉗記錄到較高的PKA和ATP依賴性Cl?通道開放活性和開放概率，應(yīng)該注意的是，雖然蛋白質(zhì)水平表現(xiàn)出CFTR的不完全剪接，但剪接產(chǎn)生的完整CFTR蛋白足以形成與野生型 CFTR相近的 Cl?通道功能。未融合intein的兩段CFTR基因共轉(zhuǎn)染細胞結(jié)果顯示，盡管不能形成完整的 CFTR蛋白分子，亦可記錄到較低的Cl?電流，從單獨轉(zhuǎn)染CFTR的N端基因說明，兩段CFTR蛋白存在某種程度的分子間互補作用，并由此產(chǎn)生部分的Cl?通道電流，但大小和密度明顯低于融合 intein的共轉(zhuǎn)染細胞，而且通道開放活性和概率也明顯較低。最近有研究者用基于RNA剪接的雙AAV載體轉(zhuǎn)CFTR基因，但由于剪接效率不夠高使得其使用受到限制[9]。

由于蛋白質(zhì)剪接反應(yīng)的精確、無副反應(yīng)的特點，近年來在蛋白質(zhì)純化[10]、多肽環(huán)化[11]以及蛋白質(zhì)相互作用[12]等研究中得到應(yīng)用。需要指出的是，盡管intein對其天然宿主蛋白的剪接效率極高，甚至觀察不到中間產(chǎn)物，但對不同的非天然宿主蛋白，表現(xiàn)出的剪接效率高低不一，因此對于不同的目的蛋白需要測試不同的滿足剪接反應(yīng)的保守氨基酸殘基的斷裂位點，筆者曾在大腸桿菌表達實驗中證明本文中所選擇的斷裂位點以及于 Ser660前斷裂 CFTR，Ser660后亦為保守的Ile661，Intein表現(xiàn)出較高的剪接效率[13]，但對另一有 2個保守殘基 Ser707Ile708前斷裂的CFTR只觀察到很低的剪接效率，對只有一個保守殘基Ser670或Ser737前斷裂的CFTR沒有觀察到剪接反應(yīng) (數(shù)據(jù)未顯示)。最近筆者還用 intein在大腸桿菌中實現(xiàn)了對凝血VIII因子的高效剪接[14]。有報道用 intein的蛋白質(zhì)反式剪接功能肌肉注射雙AAV載體轉(zhuǎn)Dystrophin基因后的肌肉形態(tài)學(xué)證明對肌營養(yǎng)不良小鼠有較好的治療效果[15]。

鑒于AAV5對感染呼吸道上皮細胞的靶向特異性感染的特點，Sirninger等構(gòu)建了一種去除 TMD1的263個氨基酸殘基的縮減型CFTR基因的重組型AAV5，Cftr?/?小鼠氣管內(nèi)轉(zhuǎn)基因顯示對Cl?通道電流的糾正作用，并改善病菌感染引起的炎癥[16]。本研究為進一步地應(yīng)用雙AAV5載體的全長CFTR基因轉(zhuǎn)移進行CF基因治療研究奠定了基礎(chǔ)。

致謝：感謝加拿大Dalhousie大學(xué)醫(yī)學(xué)院Paul Liu教授提供的蛋白質(zhì)剪接技術(shù)的幫助和Paul Linsdell教授提供的膜片鉗技術(shù)幫助。

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