溶劑環(huán)境對乙肝表面抗原 (HBsAg) 結(jié)構(gòu)的影響

原航，李巖，黃永東，羅堅，馬光輝，蘇志國

中國科學(xué)院過程工程研究所 生化工程國家重點實驗室，北京 100190

醫(yī)學(xué)與免疫生物技術(shù)

溶劑環(huán)境對乙肝表面抗原 (HBsAg) 結(jié)構(gòu)的影響

原航，李巖，黃永東，羅堅，馬光輝，蘇志國

中國科學(xué)院過程工程研究所 生化工程國家重點實驗室，北京 100190

HBsAg作為乙肝疫苗的主要成分，是一種病毒樣顆粒，由蛋白質(zhì)和脂類通過非共價鍵作用形成。HBsAg保持完整結(jié)構(gòu)對其功能非常重要，而目前未見對其在溶液中結(jié)構(gòu)變化的研究。考察了不同溶劑環(huán)境 (溫度、pH值、離子類型和鹽濃度) 對HBsAg結(jié)構(gòu)的影響。實驗發(fā)現(xiàn)，HBsAg在常溫下比較穩(wěn)定，但在溫度超過60℃時穩(wěn)定性明顯下降；pH值小于4.0時引起不可逆聚集，但在pH 5.0時的聚集部分可逆；不同離子對HBsAg的影響基本符合Hofmeister序列，不同之處是SO42?比F?更易引起HBsAg顆粒的聚集，在所考察的鹽中，(NH4)2SO4對HBsAg有著較大的影響，0.4 mol/L時就會引起HBsAg聚集，隨著濃度增加，聚集現(xiàn)象更加嚴重，所以在HBsAg的疏水層析中要謹慎使用 (NH4)2SO4。

HBsAg，結(jié)構(gòu)變化，溶劑環(huán)境，凝膠過濾高效液相色譜

Abstract:As a virus-like particle, hepatitis B surface antigen (HBsAg) was the primary component of hepatitis B vaccine. HBsAg was maintained by the non-covalent interaction of proteins and lipids. The intact structure of HBsAg particle was vital to its function.However, there was no report about the effects of solvent environment on HBsAg structure. In this paper, we studied the effects of temperature, pH, ionic type and salt concentration on HBsAg structure. The results showed that HBsAg was stable at normal temperature, but began to denature above 60oC. The aggregation of HBsAg at pH 3.0 and 4.0 was nearly irreversible, but partly reversible at pH 5.0. The influence of ionic type on HBsAg was generally in accordance with Hofmeister sequence, except that SO42?caused more aggregation than F?. HBsAg aggregates started to be visible in 0.4 mol/L (NH4)2SO4, and the extent of aggregation increased with the salt concentration. Therefore, caution must be taken when using (NH4)2SO4in the hydrophobic chromatography purification of HBsAg.

Keywords:HBsAg, structural change, solvent environment, gel filtration-high performance liquid chromatography

隨著蛋白質(zhì)大規(guī)模制備技術(shù)的不斷進步，目前很多種蛋白類藥物可實現(xiàn)規(guī)?；?、高純度的制備，但是蛋白質(zhì)在純化和保存過程中容易發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，從而導(dǎo)致失活，降低產(chǎn)品質(zhì)量，而且變性的蛋白質(zhì)不僅無用而且可能有害。因此，提高蛋白質(zhì)在生產(chǎn)和保存過程中的穩(wěn)定性是當(dāng)前面臨的一個重大問題[1]。

維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要作用包括疏水相互作用、氫鍵、靜電力、范德華力和二硫鍵等，其中最主要的是疏水相互作用[1]。溶劑環(huán)境如溫度[2-3]、pH值[4-5]、緩沖體系[6-7]、離子類型及強度[8-10]和添加劑[11-14]等通過影響這些作用力而改變蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。

一般來說，分子體積越大，蛋白質(zhì)柔性越大，越容易變性，因此分子量超過200 kDa的蛋白質(zhì)一般含有多個亞基以提高其穩(wěn)定性。以病毒衣殼蛋白和脂類組成的病毒樣顆粒為例，它可以作為有效性和安全性都很高的疫苗使用，應(yīng)用前景廣闊。由于其主要成分是蛋白質(zhì)，且整體結(jié)構(gòu)主要靠非共價鍵維持，所以上述影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的因素同樣會引起其結(jié)構(gòu)變化。另外與單體蛋白的不同之處是，溶劑環(huán)境可能造成其四級結(jié)構(gòu)的改變，從而影響其功能。

HBsAg正是一種病毒樣顆粒，它是一種非常成功的疫苗，對預(yù)防乙型肝炎的擴散作出了巨大貢獻。在我國，乙型肝炎的攜帶率約為10% (約1.3億)，為乙型肝炎的高流行區(qū)[15]，因此乙肝疫苗的研發(fā)和改進有著重大的意義。漢遜酵母Hansenula polymorpha細胞表達的HBsAg (Hansenula-HBsAg)顆粒具有表達量高、免疫應(yīng)答率強等特點[16]，正逐漸取代中國倉鼠卵巢細胞和其他酵母細胞成為HBsAg的主要表達體系。HBsAg由多個單體靠非共價鍵作用形成，完整疫苗顆粒的免疫原性比單體高1 000倍以上[17]，所以保持HBsAg的顆粒完整性對于這種疫苗非常重要。Hansenula-HBsAg只含未糖基化的疏水性很強的S蛋白，單體分子量為24 kDa，含3～4個自由巰基，極易發(fā)生聚集。電鏡照片顯示其分子大小為20 nm，動態(tài)光散射的粒徑分析結(jié)果顯示，89%的Hansenula-HBsAg顆粒大小是 (30±8) nm，11%的顆粒聚集成 (208±79) nm[16]，不同方法測得的HBsAg的分子量在2 000～4 000 kDa之間[18-19]。本研究小組采用凝膠過濾高效液相色譜偶聯(lián)多角度激光散射儀測得其分子量為3 010 kDa，由86個亞基組成[20]。Hansenula-HBsAg中，脂類和蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為40∶60，其中脂類包括磷脂、麥角固醇、麥角固醇酯和甘油三酸酯等。HBsAg顆粒中蛋白質(zhì)與脂類的結(jié)合方式目前還有爭論，一種觀點認為HBsAg具有類似脂蛋白的結(jié)構(gòu)，其中磷脂或者膽固醇作為被膜，內(nèi)核為中性脂和部分蛋白質(zhì)；另一種觀點認為HBsAg是一個表面有大孔的非密閉囊泡，允許一些小分子擴散到內(nèi)部[16]；而 Satoh等認為脂類結(jié)合在蛋白質(zhì)表面，暴露在HBsAg的最外層[21]。

目前關(guān)于蛋白質(zhì)在溶液中結(jié)構(gòu)變化的研究大多采用結(jié)構(gòu)簡單的單體蛋白為模型，如 BSA、lysozyme等，對結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白-脂類聚集體的研究還未見報道，而這類結(jié)構(gòu)是病毒樣顆粒疫苗普遍具有的，并且在其純化和保存等方面存在許多實際問題，因此開展此方面研究具有指導(dǎo)意義。本研究采用酶聯(lián)免疫法 (ELISA) 對 HBsAg進行定量檢測，采用圓二色譜儀對二級結(jié)構(gòu)變化，熒光光譜對蛋白質(zhì)側(cè)鏈氨基酸殘基的微環(huán)境變化，凝膠過濾高效液相色譜 (HPSEC) 對四級結(jié)構(gòu)變化進行分析，綜合研究溶劑環(huán)境對HBsAg結(jié)構(gòu)影響的規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

HBsAg純品由華蘭生物股份有限公司提供，Lowery法測得其蛋白濃度為1 093 mg/L。實驗所用各種鹽類試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1溫度對HBsAg的影響

10 mL離心管中加入1.8 mL 20 mmol/L磷酸鈉鹽緩沖液 (PB)，pH 7.0，再加入0.2 mL HBsAg原料，保證HBsAg的終濃度約為100 mg/L，然后分別維持在 4℃、20℃、37℃、60℃、90℃環(huán)境中，并于1、2、4、8、12 h取樣，用ELISA試劑盒檢測抗原量，同時用HPSEC對其進行解聚和聚集分析，圓二色譜和熒光光譜檢測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的變化，實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.2pH值對HBsAg的影響

使用磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖體系配制 pH值分別為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的緩沖液，Tris-HCl緩沖體系配制 pH值為 8.0的緩沖液，碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖體系配制pH值為9.0、10.0的緩沖液，取不同 pH值的緩沖液各 1.8 mL，分別加入 0.2 mL HBsAg原料，保證HBsAg的終濃度約為100 mg/L，室溫條件下放置2 h后用ELISA試劑盒檢測抗原量，并用 HPSEC和熒光光譜檢測不同 pH值時 HBsAg的結(jié)構(gòu)變化。然后再從維持在不同pH值的樣品體系中各取100 μL加入到900 μL的pH 7.0的緩沖液中，室溫放置2 h，通過此方法將pH值調(diào)回7.0，最后進行ELISA、HPSEC和熒光光譜檢測。每個實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3離子類型對HBsAg的影響

考察硫酸鹽 ((NH4)2SO4、Na2SO4、Li2SO4) 和銨鹽 (NH4F、NH4Cl、NH4Br、NH4I、NH4NO3、NH4Ac)對 HBsAg的影響，分別配制相同濃度的上述各種鹽溶液，加入相同體積的HBsAg原料，保證HBsAg終濃度約為 100 mg/L，室溫放置 2 h后，進行ELISA、HPSEC和熒光光譜檢測，實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4鹽濃度對HBsAg的影響

配制濃度為 2 mol/L的 (NH4)2SO4溶液，分別稀釋成 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mol/L等不同濃度，加入一定量HBsAg原料，確保HBsAg終濃度約為100 mg/L，室溫放置2 h后進行ELISA、HPSEC和熒光光譜檢測，實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.3 分析方法

1.3.1圓二色譜儀

圓二色譜儀為 Jasco-810spectropolarimeter(Jasco，日本)，掃描范圍為190～250 nm，分辨率為1 nm，用樣品所處的緩沖液為空白進行校正，每個樣品重復(fù)測3次，溶液中蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的估算軟件為Jasco secondary structure estimation (version 1.00)。

1.3.2HPSEC

液相系統(tǒng)為Agilent 1 100 (Agilent，美國) 色譜柱 TSK G3 000 SW (300 mm×7.5 mm I.D.)，用于檢測蛋白質(zhì)的解聚，分析條件：流動相為50 mmol/L PB+0.1 mol/L Na2SO4，pH 6.8，流速為 0.5 mL/min，溫度為室溫，檢測波長為280 nm，進樣量為100 μL。

色譜柱 TSK G5 000 PWxl (300 mm×7.5 mm I.D.)，用于檢測蛋白質(zhì)的聚集，分析條件：流動相為50 mmol/L PB，pH 6.8，流速為0.5 mL/min，溫度為室溫，檢測波長為280 nm，進樣量為100 μL。

1.3.3HBsAg抗原量測定

通過ELISA 方法檢測HBsAg的抗原量，試劑盒為上?？迫A立可讀乙肝表面抗原測定試劑盒 (中國)。測定前，樣品需稀釋 10 000 倍，按 10×10×10×10的步驟稀釋，然后參照試劑盒說明書進行操作，最后在雙波長 (測定波長450 nm，參考波長630 nm)下用酶標(biāo)儀測定反應(yīng)終止OD值，相對抗原量= (處理后樣品OD值?空白OD值)/(未處理樣品OD值?空白OD值) ×100%。

1.3.4熒光光譜

熒光分光光度計為F-4 500 (Hitachi，日本)，用于檢測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的變化，激發(fā)光波長為280 nm，發(fā)射光檢測范圍為300～400 nm，掃描速度為1 200 nm/min，每個樣品重復(fù)測3次，數(shù)據(jù)分析軟件為FL Solutions 2.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對HBsAg穩(wěn)定性的影響

由圖1可以看出，雖然HBsAg為分子量很大的多亞基蛋白，疏水性也較強，但卻具有較好的熱穩(wěn)定性。60℃條件下處理12 h，相對抗原量仍保持在40%左右，但是在90℃的高溫條件下處理2 h便會引起HBsAg相對抗原量的急劇下降，隨著處理時間的延長，相對抗原量持續(xù)下降，但下降程度有所減緩。圓二色譜顯示HBsAg中含有大量的 α-螺旋結(jié)構(gòu) (圖 2)，這與大多數(shù)病毒的衣殼蛋白質(zhì)主要含有β-折疊有很大的區(qū)別，但這與 Wynne等[22]的研究一致。隨著處理溫度的升高，圓二色譜值有一個漸變的趨勢，190 nm處正峰，210、220 nm處負峰都逐漸變得不太明顯，90℃時的圓二色譜曲線明顯區(qū)別于其他溫度，α-螺旋特征吸收峰變的非常不明顯，原因可能是高溫使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)打開，α-螺旋變少，或者是蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀或吸附，濃度變小所致。

圖1 HBsAg在不同溫度下的相對抗原量Fig.1 Relative antigen of HBsAg at different temperatures.

圖2 HBsAg在不同溫度下的圓二色圖譜Fig.2 CD spectra of HBsAg at different temperatures.

熒光光譜和ELISA結(jié)果以及圓二色譜結(jié)果相吻合。在圖 3中，只在 60℃、90℃的高溫條件下發(fā)生了一些變化，最直觀的結(jié)果是熒光強度明顯變低，90℃時幾乎看不到明顯的峰形，并且最大發(fā)射波長有輕微的紅移現(xiàn)象，因為隨著溫度的升高，分子之間碰撞加劇，能量發(fā)生轉(zhuǎn)移，造成熒光淬滅，同時，聚集體的形成也可能造成熒光淬滅[23]，另外，溫度升高，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得舒展，熒光基團 (酪氨酸和色氨酸) 處于極性更強的環(huán)境中，造成了紅移現(xiàn)象。在圖4中，也沒有明顯的解聚現(xiàn)象，雖然圖4B中，90℃時的譜圖在27 min左右出現(xiàn)一個小峰，但已超出外水體積，不是蛋白質(zhì)解聚的產(chǎn)物。另外，高溫條件下HBsAg沒有發(fā)生聚集 (圖4A)，但是峰高卻逐漸降低，90℃時的峰高降低最明顯，可能是蛋白質(zhì)變性后沉淀或者吸附在離心管上。Gombotz等[24]研究發(fā)現(xiàn)BSA在尼龍膜片上的吸附量為220 μg/cm2，而在聚偏二氟乙烯和醋酸纖維素膜片上的吸附量為120 μg/cm2，所用離心管的表面足以引起HBsAg含量的降低。上述結(jié)果表明HBsAg顆粒對溫度并不十分敏感。

圖3 HBsAg在不同溫度下的熒光圖譜Fig.3 Fluorescence spectra of HBsAg at different temperatures.

圖4 HBsAg在不同溫度的HPSEC圖譜Fig.4 HPSEC of HBsAg at different temperatures. (A) Column size: TSK G5000 PWxl (300 mm×7.5 mm I.D.); mobile phase:50 mmol/L PB, pH 6.8; flow rate: 0.5 mL/min; temperature:(20?25)oC; detection: 280 nm; loading volume: 100 μL. (B)Column size: TSK G3000 SW (300 mm×7.5 mm I.D.); mobile phase: 50 mmol/L PB + 0.1 mol/L Na2SO4, pH 6.8; flow rate: 0.5 mL/min; Temperature: (20?25)oC; Detection: 280 nm;loading volume: 100 μL.

2.2 pH值對HBsAg穩(wěn)定性的影響

圖5顯示，低pH值時，即當(dāng)pH值為3.0、4.0、5.0時，相對抗原量明顯很低，都不超過 20%，但是重新調(diào)回pH 7.0的溶液環(huán)境后，相對抗原量均有了一定程度的提高，說明雖然低pH值會對蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，但是所引起的變性是部分可逆的。與此相對的是高pH值，即pH值為9.0、10.0時，相對抗原量則高于100%，即使調(diào)回pH 7.0的溶液環(huán)境，相對抗原量依然很高，可能是高pH值改變了HBsAg抗原決定簇局部的結(jié)構(gòu)，從而更加有利于其與ELISA抗體的結(jié)合。

圖5 HBsAg在不同pH下的相對抗原量Fig.5 Relative antigen of HBsAg at different pH values.(A) pH values range from 3.0 to 10.0. (B) Different pH values are readjusted to pH 7.0 respectively.

圖6 (部分數(shù)據(jù)未列) 顯示，低pH值時，HBsAg發(fā)生聚集，因為HBsAg純品的出峰位置是13 min，而pH 3.0、4.0時的出峰位置是11 min，明顯前移，但當(dāng)pH值調(diào)回7.0后，峰形略微有向后移動的趨勢，即靠近HBsAg純品的出峰位置。pH 5.0的凝膠過濾高效液相圖譜顯示的這種過渡更加明顯，可以看到有2個峰形，當(dāng)調(diào)回pH 7.0后，13 min的峰高明顯高于11 min的峰高，說明pH 5.0時引起的變性是可逆的，并且與ELISA結(jié)果吻合，但pH值在3.0、4.0時引起的HBsAg聚集幾乎是不可逆的。此外，無論是否調(diào)回pH 7.0，pH值從6.0增至10.0時HBsAg的出峰位置都一致，說明沒有引起HBsAg的聚集。

圖6 不同pH條件下HBsAg的HPSEC圖譜Fig.6 HPSEC of HBsAg at different pH values. (A) pH values range from 3.0 to 10.0. (B) Different pH values are readjusted to pH 7.0 respectively. Column size: TSK G5000 PWxl, for more details see Fig.4.

pH值的改變也造成熒光光譜的變化 (部分數(shù)據(jù)未列)，pH 3.0、4.0、5.0時的熒光強度明顯很低，并且隨著pH值的降低而減弱；pH值大于6.0時的熒光強度較高，且都相差很少，當(dāng)pH值都調(diào)回7.0時，HBsAg的熒光強度近似一致 (圖7)，這也說明了 pH值引起的側(cè)鏈氨基酸殘基微環(huán)境的變化可能是可逆的，但pH值本身也會造成熒光強度的變化，研究人員發(fā)現(xiàn)[23]，色氨酸和酪氨酸的量子產(chǎn)率與pH直接相關(guān)。在 pH 10.9時，色氨酸量子產(chǎn)率最高為0.51，在pH 4.0～8.0時，量子產(chǎn)率為0.2，在pH小于4時，量子產(chǎn)率最低，只有0.085。與此同時，中性溶液中，酪氨酸量子產(chǎn)率較高，pH小于4時，量子產(chǎn)率大大降低。

圖7 不同pH條件下HBsAg的熒光光譜Fig.7 The fluorescence spectra of HBsAg at different pH values. (A) pH values range from 3.0 to 10.0. (B) Different pH values are readjusted to pH 7.0 respectively.

2.3 離子類型對HBsAg穩(wěn)定性的影響

選用不同的硫酸鹽比較陽離子對 HBsAg的影響，不同的銨鹽比較陰離子對HBsAg的影響。圖8和圖9的結(jié)果表明，HBsAg的相對抗原量偏低，則其HPSEC圖譜必然提前出峰或者峰形異常，且有如下規(guī)律：陽離子中，按HBsAg的相對抗原量由大到小排序為：Li+＞Na+＞NH4+；陰離子中，SO42?對HBsAg的影響最大，因為對比F?和SO42?的HPSEC圖譜可以發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)?引起 HBsAg的聚集，而 SO42?引起HBsAg的沉淀 (色譜峰面積較小)，所以按HBsAg的相對抗原量由大到小排序為：Ac?＞I?＞Br?＞NO3?﹥Cl?﹥F?﹥SO42?。從熒光圖譜 (部分數(shù)據(jù)未列) 上也可得到類似的結(jié)果，由于(NH4)2SO4、Na2SO4、Li2SO4溶液對HBsAg抗原量的影響較大，所以熒光強度明顯低于 NH4F、NH4Cl、NH4Br、NH4Ac等溶液，也說明SO42?對HBsAg的影響強于其他陰離子 (圖10)。而NH4I，NH4NO3溶液熒光強度非常低，這與文獻報道的 I?和無機的硝化物都能引起有機物的熒光淬滅[23]相一致。

圖8 離子類型對HBsAg相對抗原量的影響Fig.8 Influence of different ions on the relative antigen of HBsAg.

圖9 不同離子環(huán)境中HBsAg的HPSEC圖譜Fig.9 HPSEC of HBsAg in different ionic environments.Column size: TSK G5 000 PWxl, for more details see Fig.4.

此實驗結(jié)果基本符合 Hofmeister序列。Hofmeister[25]在研究不同離子對蛋白沉淀性質(zhì)的影響時，發(fā)現(xiàn)陰離子的作用大于陽離子，且有如下規(guī)律：

一般認為，序列中越靠前的離子，鹽析作用越強，對疏水作用的增強效果越明顯。因為HBsAg疏水性較強，所以更易靠疏水作用聚集在一起。不同的是SO42?比F?更易引起HBsAg顆粒的聚集，這可能與 SO42?和 HBsAg的特異作用有關(guān)，并且Hofmeister序列是經(jīng)驗序列，不一定適用于所有實驗體系。

圖10 不同離子環(huán)境中HBsAg的熒光圖譜Fig.10 Fluorescence spectra of HBsAg in different ionic environments.

2.4 鹽濃度對HBsAg穩(wěn)定性的影響

前面實驗已證明 (NH4)2SO4對HBsAg的影響最顯著，因此選擇 (NH4)2SO4考察不同鹽濃度對HBsAg的影響。由圖 11可以看出，當(dāng) (NH4)2SO4濃度增至0.4 mol/L時，相對抗原量大幅降低，隨著濃度的繼續(xù)增加，相對抗原量也不斷降低，到濃度為1.8 mol/L時降至30%左右?？梢哉J為，HBsAg顆粒較大，(NH4)2SO4加入后，與蛋白質(zhì)競爭性地爭奪水分子，破壞了HBsAg表面的水化層，使HBsAg進一步形成更大的聚集體。

熒光圖譜顯示出明顯的規(guī)律性 (部分數(shù)據(jù)未列)，并且與ELISA結(jié)果相符。隨著(NH4)2SO4濃度的不斷增加，熒光強度逐漸降低，最大發(fā)射波長也輕微的藍移，1.8 mol/L時熒光強度降到最低，且藍移現(xiàn)象最明顯 (圖12)。這說明蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)發(fā)生了細微的變化，可能是因為(NH4)2SO4引起HBsAg聚集，熒光基團 (酪氨酸或色氨酸殘基) 所處微環(huán)境發(fā)生變化，被深埋于聚集體內(nèi)部更加疏水的環(huán)境，從而引起最大發(fā)射波長藍移[23]。

圖11 鹽濃度對HBsAg相對抗原量的影響Fig.11 Influence of salt concentration on the relative antigen of HBsAg.

圖12 不同鹽濃度下HBsAg的熒光圖譜Fig.12 Fluorescence spectra of HBsAg at different salt concentrations.

HPSEC與ELISA和熒光光譜的結(jié)果也是吻合的。當(dāng) (NH4)2SO4濃度增至 0.4 mol/L時，HBsAg開始在11 min提前出峰，濃度為0.6 mol/L時，11 min處的峰高明顯高于13 min，說明大部分HBsAg已發(fā)生聚集。隨著 (NH4)2SO4濃度的繼續(xù)增加，13 min處不再有峰，而11 min處的峰形更加明顯 (圖13)，說明聚集現(xiàn)象越來越嚴重。在 (NH4)2SO4濃度大于1.4 mol/L時，11 min處峰形反而變得很不明顯，可能是高鹽濃度引起蛋白質(zhì)沉淀或者蛋白質(zhì)吸附于離心管壁，使溶液中 HBsAg濃度降低，這也解釋了HBsAg在高鹽濃度時熒光強度的降低。

3 結(jié)論

圖13 不同鹽濃度下HBsAg的HPSEC圖譜Fig.13 HPSEC of HBsAg at different salt concentrations Column size: TSK G5000 PWxl, for more details see Fig.4.

HBsAg結(jié)構(gòu)復(fù)雜，為蛋白質(zhì)-脂類復(fù)合體，并且蛋白質(zhì)未糖基化，疏水性強，亞基數(shù)目多，但對于其在溶劑環(huán)境中的穩(wěn)定性卻少見報道，本文通過考察不同條件對HBsAg結(jié)構(gòu)的影響，旨在為類似疫苗在保存和純化過程中遇到的問題提供參考。

實驗發(fā)現(xiàn)，HBsAg有較好的熱穩(wěn)定性，當(dāng)溫度低于37℃時，延長處理時間并不會改變其結(jié)構(gòu)，但60℃、90℃的高溫卻會在短時間內(nèi)引起其高級結(jié)構(gòu)變化。pH 3.0、4.0時引起的HBsAg四級結(jié)構(gòu)的變化幾乎不可逆；與之相對的是，pH 5.0時引起的四級結(jié)構(gòu)變化大部分可逆，但 pH 3.0、4.0、5.0時引起的側(cè)鏈氨基酸殘基的微環(huán)境變化則完全可逆，當(dāng)pH值大于等于6.0時，HBsAg的四級結(jié)構(gòu)沒有改變。高pH值能極大提高HBsAg的相對抗原量，可能是因為高pH值改變了HBsAg抗原決定簇的局部結(jié)構(gòu)。不同離子類型對HBsAg的影響基本符合Hofmeister序列，不同之處是SO42?比F?更易引起HBsAg的聚集，這可能與SO42?和HBsAg的特異作用有關(guān)。所考察鹽中以 (NH4)2SO4對 HBsAg的聚集作用最顯著，較低濃度即引起HBsAg的聚集，隨著離子濃度的增加，HBsAg的三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu)也隨之變化，并且聚集現(xiàn)象也越來越嚴重，甚至發(fā)生沉淀。因此，在HBsAg及類似疫苗的保存和分離純化過程中，可能偏堿性的溶劑環(huán)境更有利于保持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，當(dāng)需要添加不同離子，尤其是疏水層析需要通過鹽來調(diào)節(jié)電導(dǎo)時，要謹慎使用 (NH4)2SO4或者硫酸鹽。

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Effects of solvent environment on the structure of hepatitis B surface antigen (HBsAg)

Hang Yuan, Yan Li, Yongdong Huang, Jian Luo, Guanghui Ma, and Zhiguo Su

National Key Laboratory of Biochemistry Engineering,Chinese Academy of Sciences,Beijing100190,China

Received:March 15, 2010;Accepted:May 14, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China (Nos. 20906093, 20820102036), National Basic Research Program of China (Nos.2007CB714305, 2009CB724705).

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