何先元，許晉芳，王秋霜，陳媛媛

(重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 401331)

當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸 Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根，為中醫(yī)傳統(tǒng)常用補(bǔ)血藥，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便等功效，用于治療血虛萎黃、眩暈心悸、月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)、虛寒腹痛、腸燥便秘、風(fēng)濕痹痛、跌撲損傷、癰疽瘡瘍[1]。當(dāng)歸的主要成分為阿魏酸、揮發(fā)油糖、多糖等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，當(dāng)歸多糖具有多種免疫活性，對造血系統(tǒng)有明顯作用，對抗腫瘤、抗輻射損傷也有較好的療效。筆者以超聲提取-分光光度法測定當(dāng)歸多糖含量，為其開發(fā)利用提供參考[2-4]。

1 儀器與試藥

WFZ UV-2000型紫外光分光光度計(龍尼科上海儀器有限公司);SK8200H型超聲儀(上海科島超聲儀有限公司);KQ-5200DA型超聲波清洗儀(江蘇昆山);TDZ 4A-WS型低速臺式離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司);CS 101-2EBN型電熱鼓風(fēng)干燥箱(重慶永生);HZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。葡萄糖對照品(分析純，105℃干燥至恒重);當(dāng)歸供試品(粉碎成粗粒，過40目篩，60℃烘3 h);乙醇(80%，95%)、5%苯酚、硫酸、石油醚、氯仿、1%活性炭、無水乙醇、乙醚、丙酮均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 當(dāng)歸多糖的提取與精制

稱取當(dāng)歸200 g，置圓底燒瓶中，加石油醚500 mL，75℃回流1 h脫脂，過濾，殘渣揮干溶劑，然后用80%的乙醇500 mL浸漬過夜，超聲提取2次，每次1 h，過濾，藥渣加蒸餾水1 000 mL浸漬1 h，超聲提取30 min，過濾，再加500 mL蒸餾水，超聲提取30 min，過濾，合并濾液，減壓濃縮至150 mL，用氯仿萃取3次，以除去蛋白質(zhì)。加1%活性炭脫色2次，抽濾，濾液加乙醇使含醇量達(dá)80%，于冰箱中靜置過夜，過濾，殘渣先后用95%乙醇、無水乙醇、乙醚、丙酮依次洗滌，60℃ 烘干至恒重，即得精制當(dāng)歸多糖。

2.2 溶液制備

精密稱取105℃下干燥至恒重的葡萄糖對照品25.0 mg，置250 mL量瓶中，用蒸餾水溶解并稀釋至刻度，即得對照品溶液。取苯酚100 g，加鋁片0.1 g和碳酸氫鈉0.2 g，蒸餾，收集182℃餾分5 g，加100 mL蒸餾水溶解，置棕色試劑瓶中，制成5%苯酚溶液，冷藏待用。取樣品粉末(過40目篩)，60℃下干燥3 h，精密稱取0.262 9 g，置錐形瓶中，加80%的乙醇50 mL，超聲提取30 min，過濾，殘渣及濾紙加蒸餾水80 mL，超聲提取30 min，濾過，再加水80 mL超聲提取30 min，殘渣及濾紙用水洗滌(15 mL×4次)，洗液并入濾液，合并兩次提取液，然后定容于250 mL量瓶中，搖勻，作為供試品溶液。

2.3 換算因子測定

精密稱取60℃下干燥至恒重的精制當(dāng)歸多糖14.3 mg，置50 mL量瓶中，用蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻后作為貯備液。精密吸取貯備液2 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法操作，用回歸方程求出多糖供試品溶液的葡萄糖質(zhì)量濃度，按公式 f=W/(C·D)計算。式中 W為多糖的質(zhì)量(μg)，C為多糖稀釋液中葡萄糖的質(zhì)量濃度(μg/mL)，D為多糖的稀釋因子。換算因子 f=36.08。

2.4 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:精密吸取對照品溶液 0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1 mL，分置50 mL具塞試管中，依次加蒸餾水補(bǔ)足至2 mL，各管再加5%苯酚溶液1.6 mL，搖勻，迅速加濃硫酸6 mL，常溫放置25 min，于490 nm波長處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以吸光度(A)對葡萄糖質(zhì)量濃度(C)進(jìn)行回歸，得回歸方程 Y=0.691 7 X-0.0971，R2=0.9776(n=6)。

穩(wěn)定性試驗:精密吸取同一供試品溶液，分別于配制后0，1，2，4，8，24 h時依法測定其吸光度。結(jié)果的 RSD為3.13%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

精密度試驗:精密吸取對照品溶液，依法重復(fù)測定吸光度。結(jié)果的 RSD為0.86%(n=5)。

加樣回收試驗:精密稱取已知含量的樣品粉末0.122 2 g，精制當(dāng)歸多糖31.7 mg，置同一錐形瓶中，按供試品溶液制備及含量測定方法操作，計算含量及回收率。結(jié)果回收率范圍為98.44%～99.90%，平均回收率為99.85%，RSD為0.80%(n=3)。

2.5 樣品含量測定

精密吸取供試品溶液2 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項下方法操作，測定吸光度，用回歸方程求出葡萄糖含量，計算樣品中多糖含量。多糖含量(%)=C·D·f/W×100%，式中 W為供試品的質(zhì)量(μg)，C為供試品溶液中葡萄糖的質(zhì)量濃度(μg/mL)，D為供試品的稀釋因子，f為換算因子。結(jié)果平均相對百分含量為12.45%，RSD為2.04%(n=6)。

3 討論

當(dāng)歸的多糖含量較高，作為免疫調(diào)節(jié)劑和抗放射損傷劑，多糖已應(yīng)用于臨床，但多以粗多糖的形式被利用，質(zhì)量難以控制，藥效重復(fù)性差，不符合國際規(guī)范。當(dāng)歸在我國屬于大宗藥材，產(chǎn)地多，有野生的，也有種植的，種植技術(shù)、采收時間等也有差異，這些因素導(dǎo)致當(dāng)歸有效物質(zhì)存在差異。在以當(dāng)歸多糖作為藥用成分應(yīng)用時，如何分離、提取和高效快速檢測當(dāng)歸多糖是當(dāng)歸藥材質(zhì)量控制要解決的重大問題。超聲提取-分光光度法是先用80%乙醇提取，以除去單糖、低聚糖、苷類及生物堿等成分，再用超聲水提取多糖成分;多糖類成分在硫酸的作用下，先水解成單糖分子并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后和苯酚合成有色化合物，用比色法測定其含量。超聲提取方法縮短了提取時間，簡便快捷，具有分離效果好、靈敏準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，且含量測定顯色穩(wěn)定，多糖水解較完全，故本研究采用此法測定當(dāng)歸多糖的含量。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:89-174.

[2]南換杰，秦雪梅，武 濱，等.潞黨參多糖的超聲提取和含量測定[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2008，39(7):641-643.

[3]劉 云.當(dāng)歸多糖的提取及含量測定[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐，2003，17(1):49，53.

[4]胡小平，李玉云，李先何，等.當(dāng)歸多糖的成分及藥理學(xué)研究新進(jìn)展[J].中藥材，2004，27(1):70-72.