姜軼飛， 沈華浩

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院呼吸科，浙江 杭州 310009)

#現(xiàn)工作單位:浙江省嘉興市第二醫(yī)院呼吸科，浙江嘉興 314000

哮喘的一個(gè)重要特征是杯狀細(xì)胞增生和黏液過度分泌，大量黏液難以清除引起小氣道阻塞并導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性，急性哮喘死亡患者尸檢顯示大小氣道均有杯狀細(xì)胞增生和黏液過度分泌，這種黏液過度分泌導(dǎo)致的氣道阻塞是重癥哮喘主要死因之一，有研究證實(shí)黏液過度分泌是第1秒用力呼氣容積(FEV1)下降加速的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［1］。一直以來(lái)黏蛋白(mucin，MUC)基因被認(rèn)為是哮喘患者中調(diào)控杯狀細(xì)胞黏液分泌的主要基因，但近年來(lái)一個(gè)新的基因－鈣激活氯離子通道基因在哮喘黏液分泌中的作用逐漸被人們認(rèn)識(shí)，進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)其與哮喘的氣道炎癥形成有相關(guān)性。抑制該基因調(diào)控的鈣激活氯離子通道不僅能控制哮喘的黏液分泌還能抑制血管旁氣道組織炎癥?，F(xiàn)在有大量文獻(xiàn)通過描述該基因的表達(dá)來(lái)反映氣道杯狀細(xì)胞的黏液高分泌狀態(tài)，該基因與哮喘致病性的相關(guān)研究也取得了很大進(jìn)展，但也有研究從不同角度指出不同觀點(diǎn)。本文簡(jiǎn)要介紹鈣激活氯離子通道的結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)，及該通道與哮喘黏液分泌和氣道炎癥的相關(guān)性和一些最新研究進(jìn)展。

1 鈣激活氯離子通道的結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)

氯離子是體內(nèi)含量最大的負(fù)離子，氯離子通道是指分布于細(xì)胞膜和細(xì)胞器質(zhì)膜上的一種跨膜蛋白，一般是由幾個(gè)結(jié)構(gòu)域組成的多次跨膜結(jié)構(gòu)，對(duì)氯離子和其它陰離子如碘離子(iodide ion，I－)、硝酸根離子(nitrate ion，NO3－)、硫氰酸根離子(thiocyanate ion，SCN－)、氟離子(fluoride ion，F(xiàn)－)有通透性，有時(shí)運(yùn)轉(zhuǎn)其它陰離子反而更有效。按照氯離子通道開啟關(guān)閉的調(diào)節(jié)因素差異可分為以下幾類:電壓門控氯通道家族、環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophostate，cAMP)/蛋白激酶A激活的氯通道、鈣激活氯通道、容量調(diào)節(jié)氯通道、配體激活氯通道和細(xì)胞內(nèi)氯通道家族。它參與細(xì)胞的電荷和離子傳輸，有調(diào)節(jié)pH值、細(xì)胞容量大小、細(xì)胞興奮性和細(xì)胞發(fā)育凋亡的功能。

鈣激活氯通道(calcium－activated chloride channels，CaCC;或 chloride channels，calcium activated，CLCA)廣泛分布于自然界各種生物中，在人體和小鼠的多種組織中介導(dǎo)鈣離子來(lái)激活氯通道，由國(guó)際基因命名系統(tǒng)(international system for gene nomencalture，ISGN)命名，是一個(gè)近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的新的蛋白家族。目前這一家族在6個(gè)哺乳動(dòng)物中有15個(gè)成員［2］，其中bCLCA1和bCLCA2在牛類表達(dá);mCLCA1、mCLCA2、mCLCA3(Gob －5，因與杯狀細(xì)胞Goblet cell 相關(guān)而命名)、mCLCA4、mCLCA5、mCLCA6在鼠類表達(dá);而人類主要表達(dá) hCLCA1、hCLCA2、hCLCA 3、hCLCA4;此外在豬、馬中也有該基因表達(dá)。

鈣激活氯通道在許多生理過程中起重要的作用，如分泌蛋白和鹽的跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)、神經(jīng)元興奮、平滑肌生理特性的維持、卵母細(xì)胞受精和心臟動(dòng)作電位復(fù)極化。鈣激活氯通道的通道蛋白孔內(nèi)對(duì)陰離子結(jié)合位點(diǎn)較弱，故對(duì)除氯離子之外的許多陰離子均有通透性，且特異性識(shí)別能力較差，因正常情況下，陰離子以氯離子為主，故稱之為鈣激活氯通道。在不同物種和不同組織中，激活所需要的游離鈣離子濃度也不同，該通道的物理特性呈現(xiàn)時(shí)間和電壓特異性，當(dāng)胞內(nèi) Ca2+濃度 ＜1 μmol/L時(shí)，該通道為單向通道，而當(dāng)胞內(nèi)Ca2+濃度＞1 μmol/L時(shí)，則通道完全打開呈現(xiàn)出雙向?qū)ㄐ裕?］。Ca2+對(duì)通道的調(diào)節(jié)有可能通過直接結(jié)合通道的位點(diǎn)來(lái)控制通道開放;或通過鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶Ⅱ產(chǎn)生的鈣依賴磷酸化途徑。鈣激活氯通道的單通道調(diào)節(jié)具有多樣性，這預(yù)示著存在多個(gè)CaCC異構(gòu)體和其在正常生理情況下起著重要的調(diào)節(jié)作用。鈣激活氯通道的激活機(jī)制包括細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放 Ca2+，胞外 Ca2+內(nèi)流和Na+/Ca2+交換，結(jié)構(gòu)－功能研究表明離子載體伊屋諾霉素能誘導(dǎo)鈣激活氯通道蛋白表達(dá)引起的氯離子電流，目前尚未發(fā)現(xiàn)特異性的阻斷劑，但9－AC、尼氟滅酸(niflumic acid，NFA)、DCDPC、DIDS 都能部分阻斷該通道。其中NFA是目前公認(rèn)的較為常用的阻斷劑［4］，Nakano等［5］證實(shí) NFA 不僅能抑制 IL －13誘導(dǎo)的杯狀細(xì)胞增生而且能抑制哮喘的氣道高反應(yīng)性和嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)，IL－13能上調(diào)mCLCA3和hCLCA1的表達(dá)。

小鼠mCLCA3(Gob－5)和人hCLCA1是異種同源通道蛋白，兩者之間有75%的相似度。mCLCA3是4次跨膜糖蛋白，有3個(gè)胞外段，分別為氨基酸胞外段、中間胞外段和羧基胞外段。mCLCA3 cDNA全長(zhǎng)2931 bp，開放讀框編碼913個(gè)氨基酸殘基。Gob－5主要分布在在胃腸道、呼吸道的黏液顆粒膜，尿道杯狀上皮和其它產(chǎn)生黏液的細(xì)胞上，提示它可能與黏液的合成、聚集、分泌相關(guān)［6］。

2 調(diào)節(jié)鈣激活氯通道的機(jī)制

調(diào)節(jié)Gob－5基因的因素尚不完全明確，該基因起作用的方式也不是很清楚，對(duì)于其產(chǎn)生作用的假設(shè)是基于其氯通道的結(jié)構(gòu)，但是體外研究利用培養(yǎng)細(xì)胞系統(tǒng)(NCI－H292、Caco－2)顯示 hCLCA1和Gob－5的過度表達(dá)誘導(dǎo)了MUC5AC的轉(zhuǎn)錄和分泌［7］。

IL－9是決定哮喘易感性的重要Th2細(xì)胞因子，過度表達(dá)IL－9的小鼠表現(xiàn)出很多人類哮喘的特征。通過抑制消減雜交(supression subtractive hybridization，SSH)技術(shù)分析IL－9轉(zhuǎn)基因小鼠和對(duì)照組，發(fā)現(xiàn)Gob－5能被IL－9轉(zhuǎn)基因小鼠特異性地誘導(dǎo)，IL－9和其它Th2細(xì)胞因子IL－4、IL－13滴注小鼠同樣能誘導(dǎo)Gob－5的表達(dá)，滴注IFN－γ和Th1細(xì)胞因子則沒有這個(gè)作用。進(jìn)一步研究顯示這種暴露于抗原誘導(dǎo)的Gob－5表達(dá)能被IL－9抗體治療所抑制，提示IL－9在哮喘模型中是誘導(dǎo)Gob－5的重要條件。最后，該研究顯示Th2細(xì)胞因子在體外人原代肺細(xì)胞中誘導(dǎo)了hCLCA1的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)均強(qiáng)烈說明hCLCA1和Gob－5參與了Th2介導(dǎo)的哮喘病理生理過程［8］。另外也有研究認(rèn)為Gob－5基因的表達(dá)由其它Th2細(xì)胞因子如IL－13調(diào)節(jié)的，IL－13促進(jìn)了杯狀細(xì)胞增生和黏液分泌［9］。mCLCA3基因的5'調(diào)控區(qū)被認(rèn)為包含1個(gè)stat6的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子能介導(dǎo)IL－13的轉(zhuǎn)導(dǎo)［10］。

組胺在黏液分泌、黏膜水腫和平滑肌收縮中起中心的作用，它是一種強(qiáng)烈刺激杯狀細(xì)胞增生的化學(xué)物質(zhì)，有報(bào)道稱組胺能調(diào)節(jié)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，IgE介導(dǎo)免疫反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞－肥大細(xì)胞和嗜堿粒細(xì)胞通過分泌組胺來(lái)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。Yamauchi等［11，12］在 2008 年和 2009 年比較了組胺基因敲除小鼠(HDC－/－C57BL/6)和OVA致敏野生型小鼠(C57BL/6N)，結(jié)果顯示組胺基因敲除哮喘老鼠氣道的嗜酸性粒細(xì)胞比例明顯低于對(duì)照組，但是上皮杯狀細(xì)胞比例、Gob－5基因和MUC5AC基因的RNA水平明顯高于野生型哮喘小鼠。這一結(jié)果提示組胺可能通過抑制杯狀細(xì)胞增生和Gob－5的RNA水平而對(duì)氣道急性炎癥起調(diào)節(jié)作用。2組小鼠的TNF－α、IL－4、IL－5、IL－13和 IFN－γ均比生理鹽水組有所增高，但是組胺敲除小鼠(HDC－/－C57BL/6)中的TNF－α比相同條件下的對(duì)照組有明顯增高，提示組胺通過Th2細(xì)胞因子起調(diào)節(jié)作用。Zhao等［13］的研究也證明通過抑制Th2細(xì)胞因子治療哮喘的藥物糖皮質(zhì)激素(地塞米松)能抑制哮喘小鼠BALF中Gob－5的RNA的表達(dá)和蛋白分泌。

3 鈣激活氯離子通道與哮喘黏液分泌和氣道炎癥的關(guān)系

2001年Nakanish等［7］首先利用SSH技術(shù)在過敏性哮喘小鼠模型的肺中確定了1個(gè)特異性引起氣道高反應(yīng)性基因－Gob－5。之前Komiya等［14］報(bào)道Gob－5基因在小腸、結(jié)腸、胃和尿道中大量表達(dá)，在氣道組織中只有少量表達(dá)，Nakanish等［7］則證實(shí)了Gob－5在氣道高反應(yīng)性模型小鼠中大量表達(dá)，并且Gob－5的表達(dá)產(chǎn)物主要分布在分泌黏液的杯狀細(xì)胞中。在氣道高反應(yīng)性小鼠模型的氣道內(nèi)滴注Gob－5反義RNA顯著抑制了氣道高反應(yīng)性和黏液分泌等哮喘表現(xiàn)，反之利用腺病毒載體在上皮中過度表達(dá)Gob－5基因則惡化了哮喘的上述表現(xiàn)。Nakanish等［7］進(jìn)一步利用 hCLCA1導(dǎo)入人黏液上皮系細(xì)胞NCI－H292后，誘導(dǎo)了黏液產(chǎn)生和MUC5AC的表達(dá)。MUC基因的上調(diào)與杯狀細(xì)胞的增生有關(guān)，被認(rèn)為是氣道杯狀細(xì)胞增生的標(biāo)志，MUC基因編碼了各種黏液的糖蛋白，它包括1組基因(例如MUC1，MUC2和MUC4)，MUC5AC、MUC2和MUC5B是主要在氣道內(nèi)表達(dá)的基因，在哮喘患者和哮喘動(dòng)物模型的組織中，MUC5AC的水平均有顯著的增高。Gob－5在人類黏液表皮樣細(xì)胞NCI－H292中能誘導(dǎo)MUC5表達(dá)的增加，被認(rèn)為是黏液細(xì)胞化生和過度增生的第1步。氣道上皮Gob－5的過度表達(dá)加重了哮喘小鼠模型的氣道高反應(yīng)性，并促使杯狀細(xì)胞增生，黏液過度產(chǎn)生和嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)。

小鼠中的Gob－5基因?qū)?yīng)人類中的hCACL1基因，研究報(bào)道hCACL1基因的過度表達(dá)惡化了哮喘。hCLCA1在疾病中的病理生理依據(jù)主要來(lái)源于2個(gè)方面:首先，臨床研究提示COPD、哮喘和肺囊性纖維化病人體內(nèi)的hCLCA1表達(dá)增高［15］，其次基因分析顯示hCLCA1和4種哮喘的表現(xiàn)相關(guān)(支氣管反應(yīng)性、皮膚劃痕實(shí)驗(yàn)、總IgE、嗜酸粒細(xì)胞計(jì)數(shù))，進(jìn)一步的hCLCA基因SNP分析顯示其與COPD、成人和兒童哮喘有相關(guān)性［16］。

2005年Long等［17］用OVA致敏 Gob－5基因敲除小鼠發(fā)現(xiàn)BALF的炎癥比對(duì)照組小鼠明顯增強(qiáng)，構(gòu)成BALF炎癥的主要細(xì)胞是中性粒細(xì)胞，Gob－5基因敲除小鼠的血管旁組織炎癥、杯狀細(xì)胞增生、黏液過度分泌則明顯下降，乙酰甲膽堿激發(fā)后，Gob－5基因敲除小鼠的氣道高反應(yīng)性顯著好于對(duì)照組。氣道內(nèi)注入LPS后，Gob－5基因敲除小鼠與對(duì)照組小鼠相比，BALF中性粒細(xì)胞炎癥增強(qiáng)而血管旁組織炎癥減少，對(duì)黏液分泌和杯狀細(xì)胞增生則幾乎沒有什么作用，這證實(shí)了過敏性免疫反應(yīng)中Gob－5與杯狀細(xì)胞增生和黏液分泌的關(guān)系，同時(shí)提示Gob－5在啟動(dòng)免疫反應(yīng)中與組織炎癥相關(guān)。

但是Robichaud等［18］在2005年利用 Gob－5基因敲除小鼠建立的過敏性哮喘小鼠模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，用OVA和IL－13致敏的Gob－5基因敲除小鼠和對(duì)照小鼠在杯狀細(xì)胞增生和氣道炎癥方面沒有區(qū)別，體外實(shí)驗(yàn)用siRNA敲除CLCA－1的人肺上皮細(xì)胞也不能減少黏液表達(dá)，提示Gob－5的表達(dá)并非過敏性哮喘小鼠和體外細(xì)胞黏液分泌的必要條件。同時(shí) Robichaud 等［18］研究了mCLCA1、mCLCA2 和mCLCA4，發(fā)現(xiàn)這些基因并不能代償mCLCA3所起的作用。這和之前報(bào)道的結(jié)果［7，17］產(chǎn)生了矛盾，分析可能的原因是Gob－5并不直接分泌黏液，而是作為1個(gè)黏液分泌的啟動(dòng)因素起作用，當(dāng)Gob－5基因被敲除后，機(jī)體有可能通過其它鈣激活氯通道基因或者其它機(jī)制進(jìn)行代償，從而導(dǎo)致兩者之間不產(chǎn)生差異，代償機(jī)制的一個(gè)可能是2組之間有3倍差異的精氨酸酶，有文獻(xiàn)［19－21］報(bào)道它可能會(huì)導(dǎo)致肺黏液分泌增加;另一個(gè)可能的原因是研究所用的小鼠基因背景不同，Robichaud等［18］使用小鼠品系為 C57/BL6，而既往研究的小鼠為 BALB/c;當(dāng)時(shí)未檢測(cè)mCLCA5也是一個(gè)重要的原因。該文顯示雖然RNAi敲除hCLCA1基因表達(dá)不能改變MUC5AC的RNA產(chǎn)物，但是對(duì)照組 hCLCA1過度表達(dá)卻使得MUC5AC大量增生，一種可能的解釋是hCLCA1是黏液分泌的一種共啟動(dòng)因素或者信號(hào)通路，一旦黏液信號(hào)瀑布被激發(fā)，則反饋性地抑制hCLCA1的活動(dòng)。

Mundhenk等［2］通過mCLCA3轉(zhuǎn)染人類胚胎腎臟293細(xì)胞證明110 kD的mCLCA3前體產(chǎn)生75 kD的氨基端和35 kD的羧基端蛋白質(zhì)，并以可溶性糖蛋白的囊泡形式分泌出胞而不是在細(xì)胞膜上出現(xiàn)。這個(gè)結(jié)果提示2種mCLCA3的分裂產(chǎn)物可能沒有形成陰離子通道，而是作為細(xì)胞外的信號(hào)分子而起作用，這也證明了Robichaud等［18］的假設(shè)。另外Gibson等［22］也認(rèn)為hCLCA1和mCLCA3是作為細(xì)胞間的信號(hào)分子而不是作為離子通道起作用。

Petel等［10］使用2種品系的小鼠雜交，其中C57BL/6J近交系小鼠產(chǎn)生黏液過度分泌和氣道高反應(yīng)性，BALB/cJ小鼠則近期產(chǎn)生相同的反應(yīng)，長(zhǎng)期則沒有這種作用，分析F2代中只出現(xiàn)上述一種表現(xiàn)的小鼠發(fā)現(xiàn)mCLCA3能誘導(dǎo)黏液細(xì)胞化生而對(duì)氣道高反應(yīng)性沒有作用。進(jìn)一步研究利用生物信息分析鈣激活氯通道的基因座時(shí)發(fā)現(xiàn)mCLCA5在mCLCA3－/－小鼠中也能促使氣道杯狀細(xì)胞化生，mCLCA5在mCLCA3缺失的情況下起到了代償作用。

總之，鈣激活氯通道家族作為一種重要的蛋白，與哮喘杯狀細(xì)胞增生和黏液過度分泌狀態(tài)明確相關(guān)，起著起始和調(diào)控黏液分泌和氣道炎癥的作用，它能通過上調(diào)MUC5AC的基因而促使杯狀細(xì)胞增生和黏液過度分泌，調(diào)節(jié)該家族的方式是通過Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子起作用。進(jìn)一步研究鈣激活氯通道的結(jié)構(gòu)和功能，能為治療干預(yù)哮喘高黏液分泌狀態(tài)提供新的靶點(diǎn)。

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