朱 焱，王祿增，楊 威，于 洋，王 維，董婉維，汪 瑛，秦 英，鄭志紅

（1.中國醫(yī)科大學實驗動物部，沈陽 110001；2.沈陽市公安醫(yī)院，沈陽 110001）

STK15基因是絲/蘇氨酸激酶家族成員之一［1］。STK15基因是一種與中心體結(jié)構(gòu)及功能緊密相關(guān)的基因，并具有高水平的酪蛋白激酶活性［2］。STK15基因的擴增和過表達使中心體異常擴增，從而導致染色體的異常分配及不穩(wěn)定，最終癌基因激活，導致腫瘤產(chǎn)生［3］，所以STK15的過表達與腫瘤的發(fā)生存在一定的聯(lián)系。本實驗構(gòu)建了pcDNA3.1-STK15質(zhì)粒，并將其瞬時轉(zhuǎn)染NIH3T3，觀察STK15高表達對NIH3T3細胞的影響，以進一步闡明STK15基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、DMEM培養(yǎng)基、TR IZOL均購自Invitrogen。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、回收試劑盒均購自Qiagen。限制性內(nèi)切酶、TaqE、dNTP、連接試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒均購自TaKaRa。小牛血清購自天津灝洋。兔抗人STK15多克隆抗體購自AbD Serotec。HRP標記的山羊抗兔的二抗購自中山公司。S-P試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)公司。MTT購自華美公司。重組人基底膜購自BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 構(gòu)建質(zhì)粒pcDNA3.1-STK15：提取人胚肺細胞總RNA，RT-PCR方法擴增STK15cDNA全長，克隆到pTZ57R/T載體，測序。BamH1和XbaI雙酶切pcDNA3.1和T-STK15連接產(chǎn)物，回收、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定，構(gòu)建pcDNA3.1-STK15質(zhì)粒。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染：將對數(shù)生長期細胞（PcDNA3.1、PcDNA3.1-STK15轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞）接種于6孔板，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48h。

1.2.3 RT-PCR：提取細胞RNA，RT-PCR試劑盒檢測STK15的表達，擴增片段的長度為498bp。

1.2.4 Western印跡分析：PBS洗2次，裂解液冰上孵育30min，12 000r/min，4℃離心30min，上清液即細胞蛋白。然后加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入1∶500的兔抗人的STK15多克隆抗體，室溫震蕩2h，洗膜3次，加入1∶2 000的山羊抗兔的二抗，室溫震蕩1h，洗膜3次，顯色。

1.2.5 免疫細胞化學：將轉(zhuǎn)染后的細胞傳代于有載玻片的六孔板中，次日取出玻片，固定30min。加過氧化物酶阻斷液，室溫下孵育10min，PBS洗3次。封閉，室溫下孵育10min，甩去血清。加一抗（兔抗人STK15抗體1：500稀釋）4℃、過夜，PBS洗3次。加生物素標記的第二抗體，室溫下孵育10min，PBS洗3次。加鏈霉素—過氧化物酶溶液（D），室溫下孵育10min，PBS洗3次。加DAB顯色，自來水沖洗，蘇木素復染30s，返藍，50％甘油封片。

1.2.6 MTT方法：每孔3 000個細胞（NIH3T3細胞、pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的NIH3T3細胞、pcDNA3.1-STK15轉(zhuǎn)染的NIH3T3細胞）接種于96孔板，在24、48、72h加入MTT（終濃度5mg/mL），37℃、孵育4h，棄上清，加入DMSO 150μL，低速震蕩10min，分光光度計490nm讀取A值。每組設8個復孔，共重復3次。

1.2.7 Transwell小室法：人工基底膜膠冰浴過夜融化，用預冷的無血清的DMEM培養(yǎng)液1：5稀釋，吸取100μL包被于Trans well小室濾膜上，置5％CO2、37℃、培養(yǎng)24h。上室接種轉(zhuǎn)染的NIH3T3細胞（約2.5×104個細胞）100μL，下室加入10％FBS的DMEM 600μL作為趨化因子，置5％CO2、37℃、培養(yǎng)24h。取出Transwell小室，濾膜用多聚甲醛固定15min，蘇木素染核，200倍顯微鏡下計數(shù)上下左右中5個視野的侵襲細胞數(shù)，計算平均值。上述實驗重復3次。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR

轉(zhuǎn)染后48h，pcDNA3.1-STK15轉(zhuǎn)染組擴增出498bp目的基因片段，而pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組未能擴增出片段（圖1）。

2.2 STK15的蛋白表達

與轉(zhuǎn)染空載體組相比，STK15轉(zhuǎn)染組在48h后可檢測到STK15蛋白表達的上調(diào)。（圖2）

2.3 免疫細胞化學

藍色為蘇木素染色的細胞核，棕紅色為DAB標記的STK15蛋白表達陽性區(qū)，表明STK15質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（圖3.3）大部分STK15蛋白表達陽性，pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組（圖3.2）和普通NIH3T3細胞（3.1）中，沒有STK15蛋白表達（圖3見彩插2）。

2.4 MTT檢測

轉(zhuǎn)染STK15質(zhì)粒的NIH3T3細胞的生長增殖在48、72h顯著高于對照組（P＜0.05）。（圖4）

2.5 Transwell結(jié)果

用平均穿膜細胞數(shù)標化成相對數(shù)后進行統(tǒng)計作圖（圖5）。STK15轉(zhuǎn)染組的細胞穿膜細胞數(shù)為258.45±4.95，而NIH3T3細胞和pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組的細胞分別為20.50±4.65和21.00±5.56，，差異均有統(tǒng)計學意義（t分別 =276.00、38.47，P＜0.05）。

M：DL2000；1：陰性對照；2：N IH3T3細胞中STK15mRNA的表達；3：pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組STK15mRNA的表達；4：pcDNA3.1-STK15轉(zhuǎn)染組 STK15mRNA的表達；5：陽性對照。圖1 STK15mRNA在轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞中的表達M：DNA markerDL2000；1：Negative control；2：Product of STK15 in NIH3T3 cells；3：Product of STK15 transfected by pcDNA3.1；4：Product of STK15 in the cells transfected by pcDNA3.1-STK15；5：Positive control.Fig.1 Expression of STK15 mRNA in the pcDNA3.1-STK15-transfectN IH3T3 cells

1：NIH3T3細胞STK15蛋白的表達；2：pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組STK15蛋白的表達；3：pcDNA3.1-STK15轉(zhuǎn)染組STK15蛋白的表達圖2 Western blot檢測STK15蛋白表達1：Product of STK15 of N IH3T3 cells；2：Product of STK15 of cells transfected by pcDNA3.1；3：Product of STK15 of cells transfected by pcDNA3.1-STK15；1：Product ofβ-actin ofN IH3T3 cells；2：Product ofβ-actin of cells transfected by pcDNA3.1；3：Product oβf-actin of cells transfected by pcDNA3.1-STK15Fig.2 The results of STK15 protein expression assayed byWestern blot

圖4 兩組細胞不同時間點的MTT檢測情況Fig.4 MTT test results of the cells from two groups measured at different times

圖5 體外跨室趨化運動實驗中，質(zhì)粒pcDNA3.1-STK15轉(zhuǎn)染組與pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組及NI H3T3細胞比較Fig.5 Comparason of the results of Transwell test of the pcDNA3.1plas mid-transfected cellsandpcDNA3.1-STK15 plasmid transfected cells，and N I H3T3 cells.

3 討論

近年來腫瘤研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤與基因異常密切相關(guān)。STK15基因是有絲分裂器的基本調(diào)控蛋白，在中心體調(diào)節(jié)、紡錘體形成、染色體分離、胞質(zhì)分裂，即有絲分裂的正常進行中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。它的過表達可引起中心體擴增，染色體不穩(wěn)定，非整倍體的形成而導致腫瘤的發(fā)生［4］。

本實驗表明，體外轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STK15質(zhì)粒可以有效地使STK15在NIH3T3細胞中高表達，說明細胞轉(zhuǎn)染成功，MTT結(jié)果表明轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STK15質(zhì)粒組的細胞增殖速率明顯高于對照組（p＜0.05）說明STK15基因可以使細胞的生長速度加快，進而形成細胞的惡性增殖，誘發(fā)腫瘤；Katayama等［5］發(fā)現(xiàn)抑制STK15的表達可致細胞分裂停滯于G2/M交界點附近，認為STK15可磷酸化p53蛋白，促進了Mdm2介導的p53蛋白泛素化及降解，減弱了p53介導的細胞有絲分裂監(jiān)視點機制，促進細胞周期進程，使細胞的生長增殖加快；還有人發(fā)現(xiàn)在細胞G2/M轉(zhuǎn)換與STK15磷酸化另一下游抑癌基因產(chǎn)物-BRCA1蛋白有關(guān)，認為對細胞G2/M轉(zhuǎn)換同樣是必需的［6］；以上結(jié)論最終說明STK15基因的過表達使細胞增殖速度加快。

本實驗采用Trans well小室檢測STK15對細胞體外侵襲力的影響，癌細胞要穿透人工基底膜和直徑只有8μm的聚碳酸酯微孔濾膜，需要降解Matrigel成分。而且穿透Matrigel膜涉及細胞的粘附、基質(zhì)降解和移動3個過程，這與在人體內(nèi)的浸潤繼而轉(zhuǎn)移過程完全相似。實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STK15質(zhì)粒組的細胞穿透Matrigel基底膜的細胞數(shù)明顯高于對照組（P＜0.05），而且質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組表現(xiàn)出比對照組高20倍以上的跨膜運動能力，充分表現(xiàn)出了STK15的高表達可以提高NIH3T3細胞的轉(zhuǎn)化能力和腫瘤化能力。綜合以上兩點，我們認為將STK15基因轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞提高了NIH3T3細胞的增殖速度和體外侵襲能力，這可能是形成腫瘤發(fā)病機制之一。

鑒于STK15基因與惡性腫瘤的關(guān)系如此密切，不少研究者已經(jīng)將STK15基因作為研制抗腫瘤新藥的靶子。各種能抑制STK15基因的擴增、表達及其生物學活性的物質(zhì)已成為大家研究的焦點。Tong等［7］人將特異性抑制STK15基因表達的外源性siRNA體外瞬時轉(zhuǎn)染人的食管癌細胞系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染后48h和72h轉(zhuǎn)染siRNA的人食管癌細胞的侵襲能力明顯低于未轉(zhuǎn)染的人食管癌細胞的侵襲能力。Hamada等［8］用STK15基因和STK15反義基因轉(zhuǎn)染B細胞淋巴瘤細胞系，發(fā)現(xiàn)STK15反義基因轉(zhuǎn)染的細胞系增殖率更低，并且停頓于G1期的細胞明顯增多，此外抑制細胞增殖的程度與反義寡核苷酸的濃度成正比。隨著研究的深入，STK15基因必將為惡性腫瘤的治療提供新的有效手段，對今后癌癥的早期診斷和早期治療均具有重要的臨床意義。

［1］ReichardtW，Jung V，Brunner C，et al.The putative serine/threoninekinasegeneSTK15onchromosome 20q13.2 is amplified in human gliomas［J］.Oncol Rep，2003，10：1275-1279.

［2］Jeng Y M，Peng SY，Lin CY，et al.Overexpression and amplification of Aurora-A in hepatocellular carcinoma.［J］.Clin Cancer Res，2004；15，10（6）：2065-2071.

［3］Miyoshi Y，Iwao K，Egawa C，et al.Association of centrosomal kinaseSTK15/BTAK mRNA expressionwith chromosomal instability in human breast cancers［J］.Int J Cancer，2001，92：370-373.

［4］葉燕，李福才，王淑云.喉癌中STK15基因擴增及表達的研究［J］.中華醫(yī)學遺傳學雜志，2006，23（3）：326-329.

［5］Katayama H，Sasai K，Kawai H，et al.Phosphorylation by aurora kinase A induces Mdm22mediated destabilization and inhibition of p53.Nat Genet，2004，36：55-262.

［6］Hannak E，Kirkham M，Hyman A，et al.Aurora A kinase is required for centrosome maturation in Caenorhabditis elegans［J］.J CellBiol，2001，155：1109-21116.

［7］Tong T，Zhong Y，Kong J，et al.Overexpression of aurora-A contributes to malignant development of human esophageal squamous cell carcinoma［J］Clin Cancer Res，2004，10（21）：7304-7310.

［8］Hamada M，Yakushijin Y，Ohisuka M，et al.Aurora/BTAK/STK15 is involved in cell cycle check point and cell survival of aggressive non-Hodgkin lymphoma［J］.Br J Haematol，2003，121（3）：439-447.