白 冰,王高學(xué),師長(zhǎng)宏,張 海

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,西安 710032;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,陜西楊凌 712100)

研究報(bào)告

噬菌蛭弧菌代謝產(chǎn)物活性成分對(duì)小鼠免疫功能的影響

白 冰1,王高學(xué)2,師長(zhǎng)宏1,張 海1

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,西安 710032;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,陜西楊凌 712100)

目的研究噬菌蛭弧菌代謝產(chǎn)物活性成分對(duì)小鼠免疫功能的影響。方法將噬菌蛭弧菌代謝產(chǎn)物的 3種有機(jī)溶劑 (石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯)提取物和提取后的剩余液體分別腹腔注射實(shí)驗(yàn)小鼠,分兩次注射,共注射 0.5 mL,注射后連續(xù)飼養(yǎng) 28 d,每隔 7 d小鼠采血檢測(cè)離體白細(xì)胞吞噬活性 (phagocytic activity)、吞噬細(xì)胞殺菌活性 (bactericidal activity)、超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase,SOD)活性、血清凝集抗體效價(jià)、血紅蛋白值和紅細(xì)胞數(shù)的變化,以研究不同提取物對(duì)小鼠免疫功能的影響。結(jié)果石油醚提取物組和三氯甲烷提取物組小鼠血清 SOD活性、血清凝集抗體效價(jià)、離體白細(xì)胞吞噬活性和吞噬細(xì)胞殺菌活性增強(qiáng)與對(duì)照組相比差異極顯著 (P< 0.01);乙酸乙酯提取物組 SOD活性和血清凝集抗體效價(jià)增強(qiáng)與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01),離體白細(xì)胞吞噬活性和吞噬細(xì)胞殺菌活性增強(qiáng)與對(duì)照組相比差異顯著 (P<0.05);石油醚提取物組的血紅蛋白值 (12.64 g/ 100 mL)和紅細(xì)胞數(shù)(11.32×106/mL)最高。各項(xiàng)指標(biāo)的峰值均出現(xiàn)在第 7天～第 21天。結(jié)論噬菌蛭弧菌代謝產(chǎn)物 3種有機(jī)溶劑提取的活性物質(zhì)具有增強(qiáng)小鼠免疫功能的作用。

噬菌蛭弧菌;代謝產(chǎn)物;活性物質(zhì);免疫功能;小鼠

近年來(lái)生物活性物質(zhì)作為飼料添加劑能增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫功能已得到證實(shí),研究發(fā)現(xiàn),微生物代謝及發(fā)酵產(chǎn)物比活菌制劑效果更好,是未來(lái)畜牧業(yè)養(yǎng)殖領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。噬菌蛭弧菌 (B dellovibro bacteriovorus)是一類專門(mén)以捕食細(xì)菌為生的寄生性細(xì)菌,廣泛存在于自然界中[1]。從上世紀(jì) 60年代由美國(guó)科學(xué)家 Stolp和 Starr發(fā)現(xiàn)以來(lái),研究表明它在動(dòng)物養(yǎng)殖上具有防病、治病、保健、促生長(zhǎng)等多種功能。已有的報(bào)道中,噬菌蛭弧菌及其代謝產(chǎn)物具有增強(qiáng)鯽魚(yú)免疫功能的作用[2]。作者以此為基礎(chǔ)對(duì)噬菌蛭弧菌代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究,采用大孔樹(shù)脂吸附和有機(jī)溶劑分離方法,分離活性物質(zhì)并研究其對(duì)小鼠免疫功能的影響,為活性物質(zhì)定位和以后分離單體物質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株及試劑

噬菌蛭弧菌由本實(shí)驗(yàn)室提供;SPF級(jí)昆明小鼠購(gòu)于第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證號(hào) SYXK (軍)2007-020,平均體重 (19.1±0.5)g;大腸桿菌(E.coli)和人源型金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)均由本實(shí)驗(yàn)室保存;MEM培養(yǎng)基、噻唑蘭(MTT)和 SOD試劑盒購(gòu)于南京建成生物研究所;淋巴細(xì)胞分離液 (Ficoll-Hypaque)由上海華精高科技有限公司生產(chǎn);LSA-10大孔吸附樹(shù)脂由西安藍(lán)曉科技有限公司生產(chǎn);TU-1810紫外分光光度計(jì):北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;Centrifuge 5810R低溫高速離心機(jī):Eppendorf公司。

1.2 菌懸液的制備

將試驗(yàn)中使用的大腸桿菌、人源型金黃色葡萄球菌分別接種普通肉湯培養(yǎng),平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)后用生理鹽水稀釋至 1×108CFU/mL。取 10 mL人源型金黃色葡萄球菌稀釋液,加入 10%甲醛液滅活 24 h,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 發(fā)酵產(chǎn)物活性部位的追蹤分離

將噬菌蛭弧菌接種于 5000 mL普通肉湯,于35℃恒溫水浴搖床培養(yǎng) 7 d,將發(fā)酵液于 4℃6000 r/min離心 10 min,收集上清液,重復(fù)離心1次,取上清液備用。

通過(guò)預(yù)試驗(yàn),選擇LSA-10大孔吸附樹(shù)脂對(duì)上述上清液進(jìn)行活性成分的吸附,并將其裝填入層析柱中,調(diào)整至一定的流速。待水液流完后,用甲醇溶液洗柱,收集甲醇,蒸餾回收甲醇,反復(fù)幾次用甲醇洗柱,收集合并各餾分并低溫減壓濃縮,分別采用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯,按極性由低到高進(jìn)行提取,經(jīng)濃縮、低溫干燥,將所得的 4種提取物用食用油分別按 5 mL/mL定容。

1.4 發(fā)酵產(chǎn)物活性部位的追蹤測(cè)定

1.4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 :將昆明系小白鼠隨機(jī)分為 5組(提取完后剩余液組、乙酸乙酯提取物組、三氯甲烷提取物組、石油醚提取物組和對(duì)照組),每組 12只,相同條件飼養(yǎng)管理。將上述4中提取物分別給小白鼠進(jìn)行腹腔注射,首次注射 0.3 mL,2 d后分別再注射 1次,劑量為 0.2 mL。對(duì)照組以相同方法注射同等劑量的食用油。每隔 7 d采血 1次,測(cè)定其免疫指標(biāo)。

1.4.2 血紅蛋白值和紅細(xì)胞數(shù)的測(cè)定 :血紅蛋白測(cè)定采用沙利氏比色法。紅細(xì)胞計(jì)數(shù)采用試管稀釋法,用沙利氏吸血管取 10μL全血樣品吹入含 2 mL紅細(xì)胞稀釋液的試管底部,吸吹數(shù)次混勻,用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.4.3 SOD活性的測(cè)定: 參照 SOD試劑盒說(shuō)明進(jìn)行,用紫外分光光度計(jì)測(cè)定 SOD活性。

1.4.4 血清凝集抗體效價(jià)的測(cè)定: 取 0.4 mL小鼠血液置于離心管中,2 000 r/min離心 6 min分離血清,以滅活的人源型金黃色葡萄球菌為反應(yīng)抗原,采用血凝板法進(jìn)行血清凝集抗體效價(jià)的測(cè)定。

1.4.5 白細(xì)胞懸液的制備:采用摘眼球采血法,取0.5 mL肝素鈉抗凝血樣置于含 0.8 mL淋巴細(xì)胞分離液的離心管中,按照李凡[3]的方法,以 2 500 r/ min離心 15 min,吸取白細(xì)胞層,用 Hank’s液調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×107個(gè) /mL,并按照司徒鎮(zhèn)強(qiáng)[4]的方法檢測(cè)白細(xì)胞活性率,活細(xì)胞不少于 90%。

1.4.6 白細(xì)胞吞噬活性的測(cè)定:取制備的 100μL白細(xì)胞懸液,參照文獻(xiàn)[5]方法用大腸桿菌進(jìn)行白細(xì)胞吞噬活性的測(cè)定。

1.4.7 吞噬細(xì)胞殺菌活性的測(cè)定:取400μL白細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè))參照文獻(xiàn)[5]方法用大腸桿菌(細(xì)菌個(gè)數(shù)為 1×105個(gè))進(jìn)行殺菌活性的測(cè)定。

1.4.8 統(tǒng)計(jì)方法:利用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件用方差分析及 p檢驗(yàn)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1 血紅蛋白值和紅細(xì)胞數(shù)

小鼠腹腔注射不同提取物后,其血紅蛋白值有不同程度的變化。石油醚提取物組和剩余液組在第 21天時(shí)達(dá)最大值,分別為 (12.64±0.08)g/100 mL和(12.11±0.04)g/100 mL,對(duì)照組在第 14天、乙酸乙酯組和三氯甲烷組在第 21天達(dá)最大值,分別為 11.25±0.02、11.33±0.12和 11.51±0.07,而在第 28天后,所有試驗(yàn)組血紅蛋白值均趨于正常水平(表 1)。小鼠腹腔注射不同提取物后,紅細(xì)胞數(shù)在一定的時(shí)間內(nèi)有明顯的增加,一般在第 14～21天出現(xiàn)峰值,最大值為石油醚提取物組第 14天 (11.32 ×106/mL),見(jiàn)表 2。

2.2 SOD活性

石油醚提取物組在第 7、14、21天的 SOD活性與對(duì)照組相比差異極顯著 (P<0.01),第 14天達(dá)峰值(118.36±0.26)U/mL,乙酸乙酯提取物組在第 14天達(dá)峰值(95.78±0.23)U/mL,與對(duì)照組相比差異極顯著 (P<0.01),三氯甲烷提取物組在

第 7天達(dá)峰值(86.23±0.31)U/mL,剩余液組與對(duì)照組相比差異不顯著,第 28天后各組差異不顯著,見(jiàn)表 3。

2.3 血清凝集抗體效價(jià)

乙酸乙酯提取物組在注射后第 21天血清凝集抗體效價(jià)達(dá)峰值為 1:64,三氯甲烷提取物組和石油醚提取物組在第 14天達(dá)峰值為 1:128,并隨著時(shí)間推移抗體水平呈平穩(wěn)下降的趨勢(shì),而剩余液組與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異,見(jiàn)表 4。

表 1 不同提取物注射小鼠后的血紅蛋白值Tab.1 Hemoglobin(Hb)values of the mice injected with the different extractions

表 2 不同提取物注射小鼠后的紅細(xì)胞數(shù)Tab.2 Erythrocyte(RBC)amounts of the mice injected with the different extractions

表 3 不同提取物注射小鼠后的 SOD活性Tab.3 SOD activities of the mice injected with the different extractions

小鼠血清離體白細(xì)胞吞噬活性以 A570nm值表示,數(shù)值越大表示活性越大。

乙酸乙酯提取物組最大值出現(xiàn)在第 14天,為0.258±0.023,與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05),而三氯甲烷提取物組最大值出現(xiàn)在第 21 d,為0.252±0.017與對(duì)照組比較差異顯著 (P<0.05),石油醚提取物組與對(duì)照組比較在第 14 d出現(xiàn)最大值 0.275±0.030且與對(duì)照組比較差異極顯著 (P< 0.01),剩余液組無(wú)明顯變化,見(jiàn)表 5。

2.5 吞噬細(xì)胞殺菌活性

小鼠吞噬細(xì)胞殺菌活性以 A570nm值表示,數(shù)值越小表示活性越大。乙酸乙酯提取物組和三氯甲烷提取物組在第 21天出現(xiàn)峰值為 0.837±0.017(P <0.05)和 0.691±0.022(P<0.01),石油醚提取物組在第 7～21天與對(duì)照組比較均有極顯著性差異,峰值為 0.578±0.018(P<0.01),剩余液組與對(duì)照組相比差異無(wú)顯著性,見(jiàn)表 6。

3 討論

表 4 不同提取物注射小鼠后的血清凝集抗體效價(jià)Tab.4 Agglutinating antibody titers of the mice injected with the different extractions

表 5 不同提取物注射小鼠后的離體白細(xì)胞吞噬活性變化Tab.5 Changes of phagocytic activity of leucocytes of the mice injected with the different extractions

表 6 不同提取物注射小鼠后的吞噬細(xì)胞殺菌活性變化Tab.6 Changes of bactericidal activity of phagocytes of the mice injected with the different extractions

細(xì)菌代謝產(chǎn)物作為飼料添加劑用于動(dòng)物養(yǎng)殖,具有低毒、低殘留的特點(diǎn),并且微生物本事作為機(jī)體內(nèi)的有益菌群能有效地改善動(dòng)物體的微生態(tài)環(huán)境和免疫功能,目前已得到認(rèn)可并得到廣泛應(yīng)用。噬菌蛭弧菌雖然在 1961年就由李明典首次在國(guó)內(nèi)介紹,但從 1997年后關(guān)于它的研究相對(duì)較少。近年來(lái),王高學(xué)等[6]將噬菌蛭弧菌代謝產(chǎn)物進(jìn)行粗分后飼養(yǎng)鯽魚(yú),發(fā)現(xiàn)對(duì)鯽魚(yú)有一定免疫增強(qiáng)功能。還有報(bào)道用噬菌蛭弧菌對(duì)致病菌攻擊小鼠保護(hù)性試驗(yàn)中揭示噬菌蛭弧菌對(duì)防制病菌攻擊,減少死亡率與空白對(duì)照組比較有明顯差異 (P<0.05)[7]。研究已證明[8,9],紅細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分,其不僅具有運(yùn)輸氧氣和二氧化碳的功能,而且具有識(shí)別黏附殺傷抗原,清除免疫復(fù)合物和參與機(jī)體免疫調(diào)控的作用。SOD活性與生物體的免疫水平密切相關(guān),對(duì)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的防御能力和整個(gè)機(jī)體的免疫功能有重要作用,可用來(lái)評(píng)判免疫調(diào)節(jié)劑對(duì)機(jī)體非特異免疫力的影響。血清凝集抗體效價(jià)則從整體上反映機(jī)體體液免疫的水平,而白細(xì)胞吞噬活性和吞噬細(xì)胞殺菌活性則反映機(jī)體細(xì)胞免疫的水平。因此,上述指標(biāo)能初步反映噬菌蛭弧菌不同提取物對(duì)小鼠免疫功能的影響。

本試驗(yàn)將噬菌蛭弧菌代謝產(chǎn)物用大孔吸附樹(shù)脂分離活性物質(zhì),并作用于哺乳動(dòng)物進(jìn)行研究,試驗(yàn)結(jié)果表明,從代謝產(chǎn)物中提取的活性物質(zhì)對(duì)增強(qiáng)小鼠免疫功能具有一定的作用?；钚晕镔|(zhì)主要集中在石油醚提取物中,說(shuō)明活性物質(zhì)極性與石油醚相似,為以后分離單體成分和化學(xué)合成提供了依據(jù)。試驗(yàn)中血紅蛋白值、紅細(xì)胞數(shù)和血清凝集抗體效價(jià)改變不是非常明顯,但都有所提高,說(shuō)明活性物質(zhì)具有增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫功能的作用。提高不明顯這可能與注射提取物劑量小有一定關(guān)系。SOD活性、吞噬活性和殺菌活性增強(qiáng)與對(duì)照組相比差異明顯,說(shuō)明活性物質(zhì)對(duì)提高小鼠非特異性免疫水平和細(xì)胞免疫水平有較為明顯的作用。然而,腹腔注射小鼠后,機(jī)體免疫功能雖能在短時(shí)間內(nèi)得到提高,但維持時(shí)間較短,到 28 d后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組差別不明顯。作者認(rèn)為,要想長(zhǎng)時(shí)間維持增強(qiáng)作用,需要持續(xù)對(duì)動(dòng)物給藥,計(jì)量可以不用很大,長(zhǎng)期低劑量的免疫刺激也許能長(zhǎng)時(shí)間使動(dòng)物保持較高免疫水平。另一方面,本實(shí)驗(yàn)并未對(duì)活性物質(zhì)的毒性進(jìn)行檢測(cè),無(wú)法預(yù)測(cè)長(zhǎng)期給藥后是否對(duì)機(jī)體有毒性作用,這可以作為以后研究的一個(gè)方向,為以后研究低毒或無(wú)毒產(chǎn)品提供數(shù)據(jù)。本實(shí)驗(yàn)的意義在于,為今后活性物質(zhì)定位,分離單體物質(zhì)和化學(xué)合成提供了重要依據(jù),降低濫用抗生素的風(fēng)險(xiǎn),減少有害物質(zhì)在動(dòng)物體內(nèi)的殘留,最終為生產(chǎn)綠色無(wú)公害農(nóng)產(chǎn)品提供依據(jù)。

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Enhancing Effect of Active Components from Bdellovibrio bacteriovorus M etabolites on I mmune Function in M ice

BA IBing1,WANG Gao-xue2,SH IChang-hong1,ZHANG Hai1
(1.LaboratoryAnimal Center,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an 710032,China; 2.College ofAnimal Science and Technology,NorthwestAgriculture and ForestryUniversity,Yangling,Shaanxi 712100,China)

ObjectiveTo study the effect of active components from Bdellovibrio bacteriovorus metabolites on immune functions in mice。MethodsTo inject the mice with ethyl acetate extraction(EAE),chloroform extraction (CE),petroleum ether extraction(PEE)and residual liquid(RL)ofBdellovibrio bacteriovorusmetabolites,respectively. The changes of immune functions in the mice were investigated by detection of Hb value,RBC amount,SOD activity, agglutinating antibody titer,phagocytic activity and bactericidal activity every 7 day. Each mouse was injected with extraction 0.5mL twice。ResultsCompared with the mice injected with edible oil in the control group,the mice in CE and PEE groups were very significantly different(P <0.01)in SOD activity,agglutinating antibody titer,phagocytic activity and bactericidal activity.The EAE group had very significantly difference(P <0.01)in SOD activity and agglutinating antibody titer.The EAE group had significantly enhanced phagocytic and bactericidal activities(P<0.05). The maximum of Hb value(12.64 g/100 mL)and the max imum of RBC amount(11.32×106/mL)were found in the PEE group and the climax of every index reached on day 7 to 21 post-injection。Conclusions The active components of Bdellovibrio bacteriovorus could enhance the immune function ofmice.

Bdellovibrio bacteriovorus;Metabolite;Active component; Immune function;Mouse

R-33

A

1671-7856(2010)02-0025-05

2009-08-26

白冰(1980-),男,獸醫(yī)師,研究方向:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫學(xué)研究。