袁麗杰，劉遠(yuǎn)莉，趙恒宇，劉興漢

（1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)，大慶 163319；2.大慶油田總醫(yī)院；大慶 1633001；3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)；哈爾濱 150081）

內(nèi)皮抑素（endostatin）通過抑制血管生成間接限制腫瘤細(xì)胞生長［1］。內(nèi)皮抑素治療腫瘤具有廣譜、低毒、不產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)［2］。用內(nèi)皮抑素治療腫瘤只是限制腫瘤細(xì)胞生長，并沒有消滅腫瘤細(xì)胞，停藥后腫瘤會(huì)復(fù)發(fā)。因此需要長期用藥，反復(fù)注射。國內(nèi)外都有研究者試圖采用基因療法，在體內(nèi)直接持續(xù)表達(dá)內(nèi)皮抑素以避免反復(fù)注射給病人帶來的痛苦。由于表達(dá)水平等多種原因，結(jié)果并不令人滿意。

2004年，本課題組運(yùn)用定點(diǎn)誘變技術(shù)將人內(nèi)皮抑素中的RGI RGAD改為RGDRGD，獲得更強(qiáng)抗腫瘤活性的重組內(nèi)皮抑素［3］。2005年，Tjin Tham Sjin等［4］發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮抑素抗腫瘤活性區(qū)主要在N端的1～27個(gè)氨基酸。隨后，本課題組在保留內(nèi)皮抑素的N端抗腫瘤活性區(qū)的基礎(chǔ)上，引入RGD串聯(lián)序列，組成30肽［5］。實(shí)驗(yàn)表明，此30肽在細(xì)胞體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制活性是內(nèi)皮抑素的4倍，對(duì)胃癌細(xì)胞生長抑制活性是內(nèi)皮抑素的5倍。對(duì)小鼠體內(nèi)肝癌的抑瘤率幾乎比內(nèi)皮抑素翻了一番，由于提高了抗腫瘤活性，推測將此30肽基因轉(zhuǎn)入動(dòng)物體內(nèi)，即使表達(dá)水平稍低一些，也有可能產(chǎn)生較好的治療作用。本文采用被FDA批準(zhǔn)可進(jìn)行人體實(shí)驗(yàn)的質(zhì)粒pVAX1，構(gòu)建表達(dá)分泌型內(nèi)皮抑素的重組載體pVAX1-30E，探討體內(nèi)直接注射該重組載體對(duì)小鼠體內(nèi)肝癌生長的影響。

1 材料和方法

1.1 試劑和質(zhì)粒

限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamHI、BstXI，T4-DNA連接酶，質(zhì)粒pVAX1購自Invitrogen公司；內(nèi)皮抑素ELISA檢測試劑盒購自O(shè)ncogene公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自上海生工生物工程公司；含有人內(nèi)皮抑素30肽的質(zhì)粒pTYB-30E由本室構(gòu)建并保存；通用型二步法免疫組化PictureTM試劑盒，一抗：CD34（1：100），PCNA（1：200）購自北京中山生物技術(shù)有限公司；HE染色試劑為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞和動(dòng)物

小鼠H22肝癌細(xì)胞由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)免疫教研室李殿俊教授惠贈(zèng)，5～6周齡BALB/C鼠購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK黑20020002。

1.3 引物合成

根據(jù)內(nèi)皮抑素30肽基因序列設(shè)計(jì)引物，P1引物5′端為BamHI酶切位點(diǎn)和兩個(gè)保護(hù)堿基，隨后是膠原蛋白XVIII信號(hào)肽編碼序列，內(nèi)皮抑素氨基端6個(gè)氨基酸殘基的編碼序列，具體序列如下：5′-ACGGATCCATGGCTCCGTACCCATGTGGCTGCCAC ATCCTGCTGCTGCTCTTCTGCTGCCTGGCGGCTGCCA GA GCGCACAGCCACCGTGACTTC-3′.P2引物5’端加入EcoRI酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基，終止密碼，具體序列如下：5′-CGGAATTCTTAGTCACCACGG TCACC-3′。上述引物由上海博亞生物工程公司合成。

1.4 重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建

以本課題組構(gòu)建的內(nèi)皮抑素30肽原核表達(dá)載體pTYB-30E質(zhì)粒為模板，P1、P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增內(nèi)皮抑素30肽基因。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定，用BamHI和EcoRI雙酶切。質(zhì)粒pVAX1亦用BamHI和EcoRI雙酶切，電泳回收大片段，與酶切后的目的基因重組，轉(zhuǎn)化JM109，篩選出的重組質(zhì)粒分別用EcoRI和BstXI單酶切鑒定并送上海博亞生物工程公司進(jìn)行序列測定。具體的實(shí)驗(yàn)方法參見分子克隆實(shí)驗(yàn)指南和相關(guān)的產(chǎn)品說明書。

1.5 質(zhì)粒的提取及鑒定

按試劑盒說明書大規(guī)模提取pVAX1和pVAX1-30E質(zhì)粒，測A260值推算質(zhì)粒濃度，A260/A280評(píng)價(jià)質(zhì)粒純度。

1.6 H22肝癌小鼠動(dòng)物模型的建立及體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)

將凍存的小鼠H22肝癌細(xì)胞置于37℃水浴，快速融化后取0.2mL注入一只小鼠的腹腔。10d后，待小鼠腹腔長滿腹水后，將其處死取腹水，用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度為3×107個(gè)/mL。每只Ba lB/c小鼠右前肢腋窩皮下注射0.15mL上述濃度的腹水，制造肝癌動(dòng)物模型。7d后將成瘤小鼠隨機(jī)分為3組：生理鹽水組、空質(zhì)粒組、pVAX1-30E組。pVAX1-30E組每次向瘤內(nèi)注射pVAX1-30E質(zhì)粒20μg，每周2次，共注射4次。空質(zhì)粒組注射等量的pVAX1質(zhì)粒。生理鹽水組注射等體積生理鹽水。末次注射后4d，處死動(dòng)物稱鼠重，瘤重，測腫瘤長短徑，計(jì)算體積V=0.52×長×寬2，用SPSS13.0進(jìn)行多個(gè)樣本均數(shù)比較的單因素方差分析。

1.7 腫瘤局部內(nèi)皮抑素30肽濃度的檢測

對(duì)照組、pVAX1組及pVAX1-30E組各取等量新鮮腫瘤組織，加入PBS緩沖液研磨，超聲破碎，5 000g離心取上清液，用EL ISA法檢測內(nèi)皮抑素30肽濃度，純化的重組內(nèi)皮抑素30肽為陽性對(duì)照，成骨生長肽為陰性對(duì)照。具體操作見試劑盒說明書。

1.8 蘇-伊染色及免疫組化研究

將上述處死小鼠的腫瘤切成組織塊，經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋，組織病理學(xué)切片后HE染色，顯微鏡下觀察分析。

免疫組化采用SP法，具體按照說明書操作。微血管密度（MVD）采用CD34為一抗，排除腫瘤出血及邊緣反應(yīng)區(qū)，低倍鏡下（×10）觀察確定血管密度最高的區(qū)域，然后高倍鏡（×40）計(jì)數(shù)10個(gè)視野中腫瘤內(nèi)微血管數(shù)，以平均每高培鏡（×40）視野血管數(shù)表示MVD［4］。增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）染色方法同前。PCNA以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。高倍鏡下計(jì)數(shù)10個(gè)視野，以陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分率表示PCNA指數(shù)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 真核表達(dá)載體構(gòu)建

PCR產(chǎn)物在瓊脂糖電泳中只有一條DNA條帶，堿基數(shù)與設(shè)計(jì)的相同，結(jié)果見圖1。重組質(zhì)粒在重組過程中丟失了BstXI酶識(shí)別序列，只能被EcoRI酶切，不被BstXI酶切，酶切樣品電泳結(jié)果見圖2。DNA序列測定結(jié)果與設(shè)計(jì)完全吻合。

2.2 質(zhì)粒濃度和純度測定

提取的質(zhì)粒用紫外分光光度計(jì)測A260和A280，pVAX1的A260為1.820，A280為1.006，A260/A280為1.809。pVAX1-E30質(zhì)粒的A260為1.836，A280為0.964，A260/A280為1.9。

2.3 小鼠肝癌動(dòng)物模型體內(nèi)抑瘤試驗(yàn)

小鼠肝癌動(dòng)物模型瘤體內(nèi)直接注射pVAX1-30E，抑瘤效果見表1。

pVAX1-30E組的抑瘤率=（1-1.3123/1.8275）×100％=28.19％

1.分子量標(biāo)準(zhǔn)2，3.PCR產(chǎn)物圖1 E30肽基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果1.pVAX1-E30；2.pVAX1-E30//EcoR I；3.pVAX1-E30/BstX IFig.1 The PCR produsts of E-30 peptide

1.pVAX1-E30質(zhì)粒；2.pVAX1-E30質(zhì)粒/EcoR I；3.pVAX1-E30質(zhì)粒/BstX I圖2 pVAX1-E30質(zhì)粒酶切鑒定1.marker；2，3.PCR productFig.2 Identification of the recombinantplasmids pVAX1-E30

2.4 pVAX1-30E介導(dǎo)的內(nèi)皮抑素30肽在腫瘤組織局部的表達(dá)

表1 pVAX1-30E對(duì)小鼠H22腹水型轉(zhuǎn)移型肝癌實(shí)體瘤大小的影響Tab.1 Effect of pVAX1-E30 on mouse transplanted hepatocellular carcinoma

在pVAX1-30E組腫瘤局部組織中，內(nèi)皮抑素30肽特異表達(dá)，抗體作1 000倍稀釋時(shí)A值為0.724。陽性對(duì)照組為0.948，陰性對(duì)照組為0.436，pVAX1組為0.408。pVAX1-30E組內(nèi)皮抑素30肽表達(dá)量明顯高于pVAX1組。EL ISA結(jié)果見圖3。

圖3 EL ISA法檢測內(nèi)皮抑素30肽在腫瘤中的表達(dá)Fig.3 Expression of E-30 peptide in the tumor tissue

2.5 蘇-伊染色及免疫組化研究

HE染色可見，pVAX1組腫瘤細(xì)胞生長良好，壞死區(qū)少見，血管豐富，形態(tài)正常無塌陷。pVAX1-30E組可見腫瘤組織壞死灶，血管少見，管壁塌陷、閉塞，見圖4。

CD34免疫組化顯示，pVAX1對(duì)照組有大量的呈棕黃色的微血管，部分血管無明顯管腔，呈條索狀，而pVAX1-30E組的棕黃色著色減少，提示微血管新生受到抑制，見圖5A。腫瘤增殖抗原Ki-67值經(jīng)方差分析，pVAX1組pVAX1-30E組比較差異顯著（p＜0.05），結(jié)果見圖5B（圖4，5見彩插3）。

3 討論

內(nèi)皮抑素通過抑制腫瘤組織的血管新生，斷絕腫瘤細(xì)胞的血液供應(yīng)，間接地限制腫瘤細(xì)胞的生長。用內(nèi)皮抑素治療腫瘤，可以使腫瘤細(xì)胞退回到原初狀態(tài)潛伏下來，但停止用藥后腫瘤細(xì)胞又迅速生長。所以用內(nèi)皮抑素治療腫瘤必須堅(jiān)持大劑量、長期用藥。為解決內(nèi)皮抑素必須長期用藥的困擾，有人構(gòu)建內(nèi)皮抑素真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入荷瘤小鼠，觀察到治療組腫瘤體積小于生理鹽水對(duì)照組和空載體對(duì)照組。腫瘤組織HE染色顯示治療組腫瘤細(xì)胞有壞死，而生理鹽水組和空載體組腫瘤細(xì)胞生長旺盛，證明重組內(nèi)皮抑素基因瘤內(nèi)注射對(duì)腫瘤的生長具有一定的抑制作用。

本課題組曾將內(nèi)皮抑素24-30位的氨基酸殘基改為RGDRGD序列，將這種改構(gòu)的內(nèi)皮抑素30肽基因與質(zhì)粒pTYB2重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，重組30肽對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的半數(shù)抑制量只有內(nèi)皮抑素的1/4，對(duì)腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制量只有內(nèi)皮抑素的1/5。在對(duì)肝癌模型小鼠的治療實(shí)驗(yàn)中，重組30肽的抑瘤率幾乎是內(nèi)皮抑素的1倍。重組30肽不僅增強(qiáng)了內(nèi)皮抑素的抗血管生成活性，而且能直接抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。相信將內(nèi)皮抑素30肽基因注入腫瘤組織會(huì)產(chǎn)生比內(nèi)皮抑素更有效的治療作用。

本課題選擇美國FDA批準(zhǔn)可在人體內(nèi)使用的質(zhì)粒pVAX1為載體，與改構(gòu)的內(nèi)皮抑素30肽基因重組，30肽基因的5′端加入膠原蛋白ⅩⅧ信號(hào)肽編碼序列。重組質(zhì)粒直接注入腫瘤組織后，在腫瘤組織中檢測到內(nèi)皮抑素30肽，證實(shí)注射到腫瘤組織中的重組質(zhì)粒能夠進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的內(nèi)皮抑素30肽可以借助信號(hào)肽分泌到腫瘤組織中。20μg重組質(zhì)粒腫瘤組織內(nèi)注射，每周2次，共注射4次。末次注射后4d處死動(dòng)物檢測抑瘤率，重組30肽的抑瘤率為28.19％。HE染色治療組腫瘤組織出現(xiàn)明顯的壞死，空質(zhì)粒組腫瘤細(xì)胞生長良好。治療組腫瘤組織微血管數(shù)明顯減少，增殖細(xì)胞核抗原減少?；蛑委煯a(chǎn)生確切的治療效果。

雖然本研究證實(shí)pVAX1-30E可以轉(zhuǎn)染小鼠的腫瘤細(xì)胞并在其中得到表達(dá)，產(chǎn)生一定的抗腫瘤作用，但研究中所采用的注射劑量是否最佳，這種治療作用能夠維持多長時(shí)間，如何進(jìn)一步提高質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及表達(dá)效率，會(huì)否產(chǎn)生毒、副作用等問題，還需經(jīng)過進(jìn)一步的研究才能得出結(jié)論。

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