汪禮坤， 匡 銘， 彭寶崗， 何 強(qiáng)， 李紹強(qiáng)， 華赟鵬， 陳 斌， 王 曄

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科，廣東廣州510080)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)發(fā)病率居世界最常見癌癥第5位，居最常見癌癥死亡原因第3位。目前早期肝細(xì)胞癌傳統(tǒng)的治療方法包括外科手術(shù)切除、肝臟移植和局部消融(射頻消融或無水酒精注射)，其5年生存率達(dá)到50%－70%，但較高的復(fù)發(fā)率影響手術(shù)切除和局部消融的療效，輔助治療難以預(yù)防復(fù)發(fā)，且肝臟移植仍存在供體短缺問題［1］。

肝細(xì)胞癌免疫治療方法包括過繼免疫活性細(xì)胞、應(yīng)用呈遞腫瘤抗原的樹突狀細(xì)胞或腫瘤疫苗等措施，臨床應(yīng)用表明可產(chǎn)生不同程度的免疫效應(yīng)，影響肝癌病人的復(fù)發(fā)率和生存率［2］。然而腫瘤免疫抑制微環(huán)境與腫瘤抗原弱免疫原性不利于免疫效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮作用和激發(fā)產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)。臨床研究顯示小肝癌局部腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocytes，TILs)高濃度的患者肝切除術(shù)后的復(fù)發(fā)率顯著低于腫瘤局部無淋巴細(xì)胞浸潤者［3］，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Tregs)使TILs功能低下［4］。CD4+CD25+Foxp3+Treg不僅調(diào)節(jié)自體免疫耐受［5］，而且通過其免疫抑制作用影響抗腫瘤免疫反應(yīng)的產(chǎn)生，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，維持腫瘤免疫耐受微環(huán)境，影響臨床免疫治療療效［6，7］。腫瘤病人存在免疫抑制現(xiàn)象，腫瘤引起機(jī)體免疫耐受和抑制抗腫瘤免疫效應(yīng)的產(chǎn)生及機(jī)制有待闡明。許多證據(jù)表明腫瘤引流淋巴結(jié)(tumor－draining lymph nodes，TDLNs)體積雖小，卻是一個(gè)免疫特惠/耐受位點(diǎn)，TDLNs內(nèi)抗原提呈細(xì)胞(APCs)的表型和功能發(fā)生活性改變，呈遞腫瘤抗原偏向于耐受產(chǎn)生，在產(chǎn)生和維持腫瘤抗原獲得性外周耐受進(jìn)而導(dǎo)致全身耐受中發(fā)揮重要作用。已知TDLNs內(nèi)Treg數(shù)量增加且抑制活性增強(qiáng)［8］，Tregs可能是影響TDLNs免疫狀態(tài)的關(guān)鍵因素，然而其確切機(jī)制尚未闡明。本研究旨在通過建立小鼠肝癌TDLNs模型，探討TDLNs內(nèi)Tregs影響機(jī)體全身免疫耐受狀態(tài)和抑制特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)的作用及機(jī)制。

材料和方法

1 主要試劑

RPMI－1640培養(yǎng)基和Trizol試劑購自Invitrogen，細(xì)菌脂多糖(LPS，L2880)購自Sigma，免疫組化Ⅰ抗 rabbit anti－mouse Foxp3、rat anti－mouse CD4、rat anti－mouse CD8均購自Biolegend，兔二步法和大鼠二步法檢測試劑盒(Ⅱ抗)購自北京中杉金橋。流式細(xì)胞術(shù)抗體APC－conjugated anti－mouse Foxp3、FITC－conjugated anti－mouse CD4和PE－conjugated anti－mouse CD25均購自eBioscience。RT－PCR kit和SYBR green realtime PCR master mix購自Toyobo。Anti－CD3抗體(clone:145－2C11)購自eBioscience。小鼠IFN－γ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(enzyme－linked immunosorbent spot technique，ELISPOT)試劑盒購自R＆D Systems。

2 Hepa1－6細(xì)胞培養(yǎng)

Hepa1－6肝癌細(xì)胞株來源于C57BL/6J小鼠的化學(xué)誘導(dǎo)肝腫瘤。應(yīng)用含10%FBS、100 mg/L青霉素G和1×105U/L鏈霉素的RPMI－1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2環(huán)境培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)Hepa1－6細(xì)胞，傳代后收集細(xì)胞。

3 建立小鼠肝癌TDLNs模型

6－8周齡大小雌性C57BL/6J小鼠購自中山大學(xué)和南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，飼養(yǎng)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。懸浮于20 μL PBS的Hepa1－6細(xì)胞(6×105cells)注射于每只小鼠右后肢足掌皮下，觀察腫瘤生長，每隔3 d測量腫瘤長徑。第12 d處死小鼠，獲取足掌腫瘤側(cè)的腘淋巴結(jié)(TDLNs)并稱重，同時(shí)獲取同側(cè)腹股溝淋巴結(jié)(第二站引流淋巴結(jié))以及脾臟，小鼠腫瘤足重量減去對側(cè)正常足重量測得腫瘤重量，最后剖檢小鼠，觀察肺、肝外觀及有無轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。作為對照，細(xì)菌脂多糖(LPS)溶于蒸餾水中，濃度1 g/L，每只小鼠右后肢足掌皮下每天注射20 μg，連續(xù)2 d，2 d后處死小鼠并收集上述淋巴結(jié)標(biāo)本和脾臟。

4 免疫組織化學(xué)染色

Foxp3染色所用標(biāo)本為4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，每例蠟塊連續(xù)切片數(shù)張，厚4 μm，1張備染，其余行HE染色，鏡下觀察有無腫瘤細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。組織切片置檸檬酸緩沖液(pH 6.0)中高壓抗原修復(fù)4 min，0.3%Triton破膜40 min，室溫放置于3%H2O2中15 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，滴加Ⅰ抗rabbit anti－mouse Foxp3(稀釋度1∶150)，4℃孵育過夜，加Ⅱ抗室溫孵育2.5 h，DAB顯色。CD8和CD4染色采用OCT包埋的新鮮標(biāo)本的冰凍切片(厚6 μm)，4℃丙酮固定切片10 min，－20℃保存?zhèn)溆?。CD8和CD4Ⅰ抗稀釋度1∶200，滴加Ⅰ抗后室溫孵育3 h，加Ⅱ抗室溫孵育1.5 h，DAB顯色。

5 流式細(xì)胞術(shù)檢測

采用細(xì)針頭刺入淋巴結(jié)或脾臟，再向組織內(nèi)注入細(xì)胞培養(yǎng)基，將細(xì)胞沖出，然后用塑料針芯鈍端在培養(yǎng)基中輕壓組織，最后通過不銹鋼篩網(wǎng)(孔徑75 μm)過濾制成單細(xì)胞懸液，脾臟組織制成的單細(xì)胞懸液再加入紅細(xì)胞裂解液，反復(fù)沖洗2次。APC－conjugated anti－mouse Foxp3、FITC－conjugated anti－mouse CD4和PE－conjugated anti－mouse CD25 3種抗體用以標(biāo)記Tregs，操作按說明書步驟進(jìn)行。

6 實(shí)時(shí)定量PCR檢測

通過Trizol試劑從淋巴結(jié)和脾臟組織抽提總RNA，按照RT－PCR kit的操作步驟合成cDNA。應(yīng)用SYBR green染料法，通過ABI7000定量PCR儀檢測，擴(kuò)增條件:95℃變性60 s，95℃15 s，60℃15 s，72℃ 45 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。引物如下:小鼠Foxp3，5′－GGG AGC AGT GTG GAC CGT AG－3′，5′－CCA CAG CCT CAG TCT CAT GGT－3′;小鼠β－actin，5′－CTT CAA CAC CCC AGC CAT GT－3，5′－TGG CGT GAG GGA GAG CAT AG－3′。結(jié)果根據(jù)目標(biāo)基因相對于內(nèi)參照 β －actin的△Ct值 = 2－(Ct［Foxp3］﹣Ct［β－actin］)進(jìn)行分析。

7 ELISPOT檢測

按上述方法從淋巴結(jié)和脾臟制成的單細(xì)胞懸液(8×106－1×107cells)加入6孔板或預(yù)包被anti－CD3抗體的6孔板中，每孔2 mL RPMI－1640培養(yǎng)基(含10%FBS、2 mmol/L L－glutamine、25 mmol/L Hepes、100 mg/L penicillin G和1×105U/L streptomycin)，置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后收集淋巴細(xì)胞并計(jì)數(shù)，然后在小鼠IFN－γ ELISPOT試劑盒96孔板中進(jìn)行細(xì)胞種板，重復(fù)3孔，設(shè)陰性和陽性對照孔，按試劑盒操作說明依次加入生物素化檢測抗體(biotinylated detection Ab)、抗生蛋白鏈菌素堿性磷酸酶(streptavidin－alkaline phosphatase)和BCIP/NBT發(fā)色團(tuán)(BCIP/NBT chromagen)，每步驟之間均以沖洗液反復(fù)沖洗，37℃烤干30 min后應(yīng)用ImmunoSpot Series 3B Analyzer(CTL，Cleveland，OH)進(jìn)行斑點(diǎn)計(jì)數(shù)并分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以1×106接種細(xì)胞中形成IFN－γ斑點(diǎn)細(xì)胞數(shù)(IFN－γ spot－forming cells，SFCs)表示。實(shí)驗(yàn)設(shè)定≥30 IFN－γ SFC/ 106cells為特異性淋巴細(xì)胞分泌反應(yīng)陽性，與評估人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)對記憶抗原刺激陽性反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)一致［9］。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

1 小鼠足掌腫瘤生長速度和TDLNs組織學(xué)改變

Hepa1－6細(xì)胞接種小鼠足掌皮下后第4 d可見足掌中心局部稍隆起，呈暗紫褐色，此后足掌腫瘤逐漸增大。第12 d腫瘤長徑達(dá)5 mm(圖1A)，重量為(0.0614 ± 0.0250)g，同時(shí)腫瘤側(cè)腘淋巴結(jié)(TDLNs)重量為(0.0042±0.0002)g，明顯大于對側(cè)腘淋巴結(jié)［(0.0007±0.0001)g，P<0.01］和足掌注射LPS組小鼠炎性腘淋巴結(jié)的重量［(0.0009± 0.0001)g，P<0.01］，且體積較腫瘤同側(cè)的腹股溝淋巴結(jié)大(圖1B)。HE染色鏡下見TDLNs內(nèi)淋巴細(xì)胞密集，生發(fā)中心擴(kuò)增，未見淋巴結(jié)中心髓竇擴(kuò)大和淋巴液增多現(xiàn)象(圖4A)。

2 TDLNs中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞擴(kuò)增

除TDLNs體積較正常腘淋巴結(jié)明顯增大外，免疫組化顯示 TDLNs的髓質(zhì)和副皮質(zhì)區(qū) CD4+和CD8+兩類T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯增多(圖4B、C)。

Figure 1.Growth curve of Hepa1－6 tumor after Hepa1－6 footpad challenge.A:footpad tumor largest dimension was measured every three days after Hepa1－6 cells(6×105cells)were injected s.c.into the footpad of right hind limb of each mouse(n= 20);B:representative photographs of tumor－draining lymph nodes(popliteal lymph nodes)(black arrow)and inguinal lymph nodes(white arrow)12 d after inoculation;C:representative photographs of draining popliteal lymph nodes(black arrow)and inguinal lymph nodes(white arrow)two days after LPS footpad injection.圖1 小鼠足掌腫瘤生長曲線和腘淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)大小改變

3 Foxp3+Tregs在TDLNs中聚集

Figure 2.Analysis of CD4+Foxp3+T cell frequency.A representative flow cytometry data showed the frequency of CD4+lymphocytes and CD4+Foxp3+T cells in the popliteal lymph nodes(TDLN)，inguinal lymph nodes and spleen，which were obtained from two mice 12 d after Hepa1－6 inoculation.Frequency of CD4+ Foxp3+T cells after tumor inoculation respectively was 13.32%，10.88%and 11.86%of total CD4－positive cells.Frequency of CD4+CD25+T cells(data not shown)was slightly higher than that of CD4+ Foxp3+T cells because CD4+CD25+Foxp3+T cells were really Tregs.圖2 腫瘤引流腘淋巴結(jié)、同側(cè)腹股溝淋巴結(jié)及脾臟組織中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞流式細(xì)胞儀分析

轉(zhuǎn)錄因子Foxp3是Tregs的特異標(biāo)志［10］。流式細(xì)胞分析顯示TDLNs中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞總數(shù)的13.32%，大于在腹股溝淋巴結(jié)(10.88%)和脾臟(11.86%)中的比例，見圖2。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示小鼠TDLNs內(nèi)Foxp3 mRNA表達(dá)水平明顯高于同側(cè)腹股溝淋巴結(jié)(0.01393± 0.00283 vs 0.01045±0.00308;P<0.01)和脾臟(0.01393±0.00283 vs 0.01039±0.00362;P< 0.01)，而腹股溝淋巴結(jié)和脾臟之間的表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)。荷瘤小鼠TDLNs和脾臟Foxp3 mRNA的表達(dá)水平明顯高于足掌注射LPS的對照組小鼠炎性腘淋巴結(jié)(0.01393±0.00283 vs 0.00743± 0.00378;P<0.01)和脾臟(0.01039±0.00362 vs 0.00549±0.00383;P<0.01)的表達(dá)水平，見圖3。荷瘤小鼠TDLNs、同側(cè)腹股溝淋巴結(jié)和脾臟免疫組化染色的結(jié)果顯示Foxp3定位于細(xì)胞核，F(xiàn)oxp3陽性細(xì)胞彌散分布于T細(xì)胞區(qū)，與淋巴結(jié)內(nèi)CD8+T細(xì)胞分布區(qū)域基本一致。與同側(cè)腹股溝淋巴結(jié)和脾臟相比，TDLNs內(nèi)的Foxp3陽性細(xì)胞數(shù)量最多，見圖4D、E、F。

Figure 3.Foxp3 expression in lymph nodes and spleen.Relative quantity of Foxp3 mRNA by real－time PCR using the ΔCt method(n=20)in draining lymph nodes and spleen 12 d after Hepa1－6 footpad inoculation or 2 d after LPS footpad injection.**P<0.01 vs popliteal LNs in Hepa1－6－inoculated mice;##P<0.01 vs spleen in LPS－injected mice.圖3Foxp3 mRNA表達(dá)實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果

Figure 4.Representative features of CD4+，CD8+，or Foxp3+T lymphocytes in TDLNs(popliteal lymph nodes)and Foxp3+T lymphocytes in inguinal lymph nodes and spleen after Hepa1－6 inoculation(A，B，C，×100);(D，E，F(xiàn)，×200).TDLN(AD)，inguinal lymph nodes(E)and spleen(F).HE staining(A)and immunostaining for CD4(B)，CD8(C)，and Foxp3(D，E，and F).圖4 CD4，CD8和Foxp3免疫組織化學(xué)染色

4 Treg抑制TDLNs內(nèi)CD8+T細(xì)胞分泌IFN－γ的功能

由淋巴結(jié)和脾臟制成的單個(gè)淋巴細(xì)胞懸液經(jīng)過單純培養(yǎng)基培養(yǎng)或anti－CD3抗體刺激激活后種板觀察顯示:荷瘤小鼠TDLNs、同側(cè)腹股溝淋巴結(jié)和脾臟分泌IFN－γ的細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為2、0和0 IFN－γSFC/106cells。經(jīng)anti－CD3抗體激活處理后，荷瘤小鼠TDLNs、同側(cè)腹股溝淋巴結(jié)和脾臟分泌IFN－γ的細(xì)胞計(jì)數(shù)上升為179、54和13 IFN－γ SFC/106cells，而足掌注射LPS的炎性腘淋巴結(jié)、同側(cè)腹股溝淋巴結(jié)和脾臟分泌IFN－γ的細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為6、19和20 IFN－γ SFC/106cells，見圖5。

Figure 5.Detection of CD8+T cells by IFN－γ ELISPOT in the draining lymph nodes and spleen(n=10).The same pool of lymphocytes were plated 48 h after single－cell suspension from popliteal lymph nodes(A，D，G)，inguinal lymph nodes(B，E，H)，and spleen(C，F(xiàn)，I)was stimulated via anti－CD3 Ab or was cultured in the absence of anti－CD3 stimulation. Representative wells were shown after plate development and spots quantified by automated digital image analysis.Responses are reported as SFC/106input cells.圖5 ELISPOT觀測CD8+T細(xì)胞IFN－γ分泌功能

討論

研究證實(shí)腫瘤可以使 TDLNs內(nèi)高內(nèi)皮靜脈(HEV)被重構(gòu)改造成血管、淋巴竇增多并擴(kuò)張和淋巴液增加等結(jié)構(gòu)和功能改變［11，12］，而我們建立的小鼠Hepa1－6肝細(xì)胞癌腫瘤引流腘淋巴結(jié)內(nèi)未發(fā)現(xiàn)明顯的類似結(jié)構(gòu)改變，而主要表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞擴(kuò)增聚集，提示不同腫瘤細(xì)胞系發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的潛能存在差異，因此可能引起TDLNs不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。

我們的研究顯示TDLNs重量與體積明顯大于足掌注射LPS的炎性腘淋巴結(jié)，CD4+和CD8+2類T淋巴細(xì)胞在TDLNs中明顯擴(kuò)增，表明TDLNs內(nèi)發(fā)生了與炎癥引流淋巴結(jié)不同程度或特征性的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

腫瘤進(jìn)展引起TDLNs中的Tregs和抗腫瘤效應(yīng)性T細(xì)胞被初始化，兩者之間的相互作用決定了TDLNs的免疫狀態(tài)［13］。臨床研究顯示Tregs在調(diào)控機(jī)體對肝細(xì)胞癌的免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其具有的免疫抑制效應(yīng)使 TILs功能低下［4，14，15］。表達(dá)Foxp3是Tregs的基本特征，同時(shí)也是鑒別Tregs的特異標(biāo)志［16］。我們的研究發(fā)現(xiàn)隨著肝細(xì)胞癌逐漸生長成瘤，F(xiàn)oxp3+Tregs首先聚集于TDLNs，數(shù)量明顯增加，而非TDLNs(腹股溝淋巴結(jié))和脾臟中卻無Tregs數(shù)量擴(kuò)增現(xiàn)象，提示TDLNs在形成機(jī)體對腫瘤免疫耐受的過程中是一個(gè)啟動位點(diǎn)。已有研究發(fā)現(xiàn)移植耐受條件下Tregs聚居外周淋巴結(jié)內(nèi)而非脾臟對于主動維持移植物耐受是必需的［17］。體外實(shí)驗(yàn)表明培養(yǎng)的肝細(xì)胞癌細(xì)胞系上清液導(dǎo)致CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞擴(kuò)增且抑制功能增強(qiáng)［18］。因此我們認(rèn)為引流進(jìn)入TDLNs的腫瘤抗原或腫瘤分泌因子可能誘導(dǎo)天然的Tregs擴(kuò)增或Tregs由CD4+T細(xì)胞新生而來。

腫瘤主動地改變了腫瘤引流淋巴結(jié)的免疫微環(huán)境，表現(xiàn)為 Tregs較均勻彌散地分布于 CD4+或CD8+T細(xì)胞聚居的副皮質(zhì)和髓質(zhì)區(qū)。這種分布方式促使細(xì)胞間直接相互接觸，進(jìn)而Tregs通過表達(dá)CD86和CD4+效應(yīng)T細(xì)胞的CTLA－4相互作用而抑制其發(fā)揮效應(yīng)功能［13］，然而有研究認(rèn)為Tregs表達(dá)并分泌TGF－β是抑制CD8+T細(xì)胞功能的一種機(jī)制［19，20］，我們的研究顯示Tregs彌散分布模式也符合細(xì)胞因子局部發(fā)揮作用的特性，因而可以認(rèn)為Tregs分泌的細(xì)胞因子影響其周圍的CD8+T細(xì)胞的功能。CD8+T細(xì)胞在抗腫瘤免疫中具有至關(guān)重要的作用，我們的研究發(fā)現(xiàn)TDLNs中CD8+T細(xì)胞的功能受到了抑制，這種抑制并未使CD8+T細(xì)胞徹底喪失效應(yīng)功能，在一定的條件下CD8+T細(xì)胞仍可對外界刺激產(chǎn)生應(yīng)答并恢復(fù)分泌IFN－γ能力。因此，消除TDLNs內(nèi)Tregs對特異性抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞的抑制，打破Tregs維持的TDLNs免疫耐受環(huán)境或TDLNs的效應(yīng)細(xì)胞在體外經(jīng)短期激活和擴(kuò)增用于過繼免疫治療可能成為一種有效的腫瘤免疫治療新途徑。

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