黎 佼， 陳敏生， 楊偉健， 張振輝， 鐘 赟， 劉世明

(廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，廣州心血管疾病研究所，廣東廣州510260)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)對間充質(zhì)組織功能的維持和修復(fù)起重要作用。多項實驗和臨床研究表明:BMSCs具有分化與修復(fù)心肌組織的潛力，能夠改善心功能。干細(xì)胞在修復(fù)心肌治療中起重要作用。與年齡相關(guān)的心腦血管疾病以及肝臟、皮膚和骨骼等器官或組織的退行性疾病的發(fā)生，可能與干細(xì)胞數(shù)量減少和功能下降有關(guān)。近幾年研究發(fā)現(xiàn)年老供體來源與年輕供體來源干細(xì)胞相比，細(xì)胞功能下降［1］。供體骨髓干細(xì)胞的年齡因素可能是影響心肌梗死后干細(xì)胞修復(fù)心肌效果的重要因素。最近細(xì)胞融合機(jī)制成功解釋了骨髓來源的干細(xì)胞通過細(xì)胞融合如何使病變的肝臟細(xì)胞、心肌細(xì)胞等細(xì)胞再生。本研究探討了年輕BMSCs通過細(xì)胞融合對年老BMSCs功能的影響及其意義。

材料和方法

1 主要試劑

細(xì)胞培養(yǎng)粉(iscove's modified Dulbecco's medium，IMDM)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、細(xì)胞培養(yǎng)液 (Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)均購自 Gibco;氨芐青霉素、硫酸鏈霉素、PKH26試劑盒、異丁基甲基黃嘌呤、EDTA、胰島素、地塞米松、吲哚美辛、油紅O染色劑、VitC、β磷酸甘油鈉、茜素紅染色劑均購自 Sigma;大鼠抗小鼠CD44、Sca－1、CD34、CD117、CD31、CD45單克隆抗體及羊抗鼠 IgG AlexaFluor 633抗體均購自 BD Pharmingen;DAPI核酸染色劑購自Invitrogen;聚乙烯二醇購自Roche。

2 動物

年輕普通C57BL/6小鼠、年輕綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因 C57BL/6小鼠、年輕紅色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因C57BL/6小鼠(2－3月齡);年老普通C57BL/6小鼠、年老綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因C57BL/6小鼠(18－24月齡)，均由Tac提供。

3 小鼠BMSCs的分離和培養(yǎng)

小鼠麻醉處死后，在無菌條件下取出股骨，將骨髓沖出至無菌管中，將骨髓吹打均勻，制成細(xì)胞懸液，加入25 mL含10%FBS的IMDM培養(yǎng)液，接種于175 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，3 d后用PBS液洗掉非貼壁細(xì)胞，換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞長滿80%時用0.25%胰酶消化傳代培養(yǎng)。

4 細(xì)胞融合

實驗分為5組:(1)年輕BMSCs組(young，Y); (2)年老BMSCs組(old，O);(3)PKH26標(biāo)記的年輕BMSCs和綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因年輕BMSCs融合組(Y－Y);(4)PKH26標(biāo)記的年輕BMSCs和綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因年老BMSCs融合組 (Y－O);(5) PKH26標(biāo)記的年老BMSCs和綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因年老BMSCs融合組(O－O);取C57BL/6小鼠第3代BMSCs，按 PKH26染色說明書操作。取 1× 107cells 1 200 r/min離心5 min，用IMDM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1次，加0.5 mL稀釋劑C(PKH26試劑盒配套試劑)重懸細(xì)胞。將BMSCs懸液快速加至混合染料應(yīng)用液中(2 μL PKH26加0.5 mL稀釋劑C)混勻，在25℃無菌條件下孵化5 min，期間輕柔翻轉(zhuǎn)離心管以確保混勻;加1 mL FBS終止染色，25℃孵化1 min，再加2 mL含10%FBS的IMDM培養(yǎng)液稀釋。1 200 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移細(xì)胞至另一離心管。含10%FBS的IMDM培養(yǎng)液洗滌3次后，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。取不同年齡組等量BMSCs混合離心后，用IMDM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1次，去上清，1 min內(nèi)緩慢加入37℃預(yù)熱的PEG 1500(90 μL/1×106cells)，邊滴邊混勻細(xì)胞1 min。4 min內(nèi)緩慢加入4 mL 37℃預(yù)熱的含10%FBS的IMDM培養(yǎng)液，邊滴邊混勻細(xì)胞。加入10 mL 37℃預(yù)熱的含10%FBS的IMDM培養(yǎng)液37℃孵化5 min后離心，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，24 h后換入新鮮含10%FBS的IMDM培養(yǎng)液，培養(yǎng)7 d。

5 融合細(xì)胞的鑒定和形態(tài)觀察

取融合后培養(yǎng)7 d的BMSCs，1 200 r/min離心5 min，PBS洗滌2次，將細(xì)胞重懸于500 μL PBS中，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞膜表面熒光蛋白的表達(dá)。取融合后培養(yǎng)7 d的BMSCs及普通BMSCs，1 200 r/min離心5 min，用冷清洗液(含1%FBS的PBS)洗滌2次，分別滴加大鼠抗小鼠抗體CD44(1∶50)、Sca－1 (1∶20)、CD34(1∶50)、CD117(1∶50)、CD31(1∶400)、CD45(1∶40)混勻后4℃反應(yīng)60 min;冷清洗液洗2次，加入羊抗鼠IgG抗體(1∶200)4℃反應(yīng)60 min，低溫離心5 min棄上清;冷PBS洗2次，流式細(xì)胞儀檢測，存取數(shù)據(jù)后分析。年輕綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因C57BL/6小鼠與年輕紅色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因C57BL/6小鼠BMSCs融合，分別培養(yǎng)7 d、14 d、21 d，用DAPI對細(xì)胞核染色，在免疫熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞核特征。

6 細(xì)胞增殖能力檢測

將5組細(xì)胞分別接種于直徑35 mm的培養(yǎng)皿中(1×103cells/cm2)。在第1、2、4、6、8 d，胰酶消化細(xì)胞，血細(xì)胞計數(shù)儀對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。

7 BMSCs成骨細(xì)胞分化能力檢測

將5組細(xì)胞分別接種于直徑35 mm的培養(yǎng)皿中(1×103cells/cm2)。細(xì)胞在含10%FBS的IMDM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后，換誘導(dǎo)液培養(yǎng)，每3 d換1次液，培養(yǎng)3周。誘導(dǎo)液為1×10－4mmol/L地塞米松，0.05 mmol/L VitC，10 mmol/L β磷酸甘油鈉，含10%FBS低糖DMDM培養(yǎng)液。3周后細(xì)胞用PBS洗滌1次，70% 冰乙醇固定1 h。茜素紅室溫染色10 min后蒸餾水洗滌。在顯微鏡下，每個培養(yǎng)皿隨機(jī)選取3個區(qū)域，用Image J軟件對染色陽性區(qū)域進(jìn)行定量分析。

8 BMSCs脂肪細(xì)胞分化能力檢測

將5組細(xì)胞分別接種于直徑35 mm的培養(yǎng)皿中(1×103cells/cm2)。細(xì)胞在含10%FBS的IMDM培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后，換誘導(dǎo)液培養(yǎng)，每3 d換1次液，培養(yǎng)3周。誘導(dǎo)液為含1×10－3mmol/L地塞米松、0.5 mmol/L異丁基甲基黃嘌呤、0.01 mmol/L胰島素、0.2 mmol/L吲哚美辛的含10%FBS的DMDM培養(yǎng)液。3周后細(xì)胞用PBS洗滌1次，4%多聚甲醛固定10 min，60%異丙醇洗滌1次，油紅O室溫染色5 min后，60%異丙醇及蒸餾水各洗滌1次。在顯微鏡下，每個培養(yǎng)皿隨機(jī)選取3個區(qū)域，用Image J軟件對染色陽性區(qū)域進(jìn)行定量分析。

9 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié)果

1 細(xì)胞融合率測定

PKH26標(biāo)記的普通小鼠BMSCs細(xì)胞膜表達(dá)紅色熒光，綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠BMSCs細(xì)胞膜表達(dá)綠色熒光。紅色熒光及綠色熒光均表達(dá)的為融合細(xì)胞。以融合細(xì)胞數(shù)除以觀察的總細(xì)胞數(shù)即為細(xì)胞融合率。細(xì)胞融合率百分?jǐn)?shù)可達(dá)30.45%±4.13%，3組融合組間無顯著差異［(29.41% ±3.00%)vs(30.54± 1.20%)vs(31.41%±6.63%)，P>0.05］，見圖1。

Figure 1.The fusion rate(%)of the three fusion groups detected by flow cytometry.Young(Y，2－3 months)and old(O，18－24 months)C57BL/6 mice BMSCs labeled with PKH26 membrane fluorescent kit were fused with young and old GFP transgenic C57BL/6 mice BMSCs by using PEG 1500.30.45%±4.13%fusion cells were obtained，and there were no significant difference in the fusion rate from three groups(Y－Y group，Y－O group，O－O group).±s.n=7.圖1 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞融合率

2 融合細(xì)胞形態(tài)特征及表面抗原表達(dá)

免疫熒光顯微鏡下紅色熒光及綠色熒光均表達(dá)的為融合細(xì)胞(黃色)。誘導(dǎo)融合培養(yǎng)7 d時，可見正在融合的雙核或已完全融合的單核融合細(xì)胞;培養(yǎng)14 d及21d時只見已完全融合的單核融合細(xì)胞，見圖2。流式細(xì)胞儀檢測普通BMSCs及融合BMSCs表面特異性抗原表達(dá)結(jié)果顯示，表達(dá)BMSCs特異性抗原CD44(94.48%±2.20%)、Sca－1(79.70% ± 1.10%)，而不表達(dá)造血干細(xì)胞表面特異性抗原CD34(1.22%±0.28%)、CD117(0.23%±0.10%)、CD31(1.43%±0.22%)、CD45(0.41%±0.10%)，見圖3。

Figure 2.Morphology and nuclear characteristics of fusion cells were detected by fluorescence microscopy(×400).Fusing cells(two nuclears)and fused cells(one nuclear)can be found at 7 d;only fused cells can be found at 14 and 21 d.Blue(DAPI)，green(GFP cell)，red(RFP cell)，yellow(fusion cell).圖2 熒光顯微鏡觀察融合細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征

Figure 3.Cell surface markers were detected by flow cytometry.Fusion BMSCs coincided with the normol BMSCs were reactive to the BMSCs lineage－specific CD44，Sca－1 surface markers(A)and negative for the hematopoietic stem cells(HSCs)lineage－specific surface markers such as CD34，CD117，CD31，CD45(B).±s.n=4.圖3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面特異性抗原表達(dá)

3 細(xì)胞增殖能力檢測

在2 d、4 d、6 d、8 d，Y組細(xì)胞增殖能力均比O組強(qiáng)，細(xì)胞增加百分率具體數(shù)值為:(145.15% ± 8.25%)vs(105.09% ±5.58%)、(251.83% ± 10.62%)vs(154.05% ±11.18%)、(397.27% ± 32.44%)vs(256.52% ±20.52%)、(555.68% ± 31.09%)vs(367.71% ±18.71%)，P<0.05。Y－O組細(xì)胞數(shù)量增加百分率比O－O組均顯著增高，分別為:(122.20% ±4.60%)vs(104.64% ±1.25%)、(213.25% ±15.29%)vs(130.02% ±6.82%)、 (318.46% ±19.86%)vs(179.40% ±9.54%)、(439.98%±24.09%)vs(240.03%±28.07%)，P< 0.05。Y－Y組與Y組、O－O組與O組細(xì)胞增殖能力無顯著差異，見圖4。

4 成骨細(xì)胞分化能力檢測

Y組成骨細(xì)胞分化能力比O組強(qiáng)，茜素紅染色陽性百分率為:(30.55% ±3.18%)vs(16.25% ± 2.70%)，P<0.01。Y－O組茜素紅染色陽性百分率比 O－O組顯著增高:(25.46% ±1.52%)vs (13.85%±1.69%)，P<0.01。Y－Y組與Y組、O－O組與O組成骨細(xì)胞分化能力無顯著差異，見圖5。

Figure 4.The percentage of increase cell number of five groups. At d 2，4，6，and 8，Y group compared to O group and Y－O group compared to O－O group were significantly greater.Y vs O were(145.15%±8.25%)vs (105.09% ±5.58%);(251.83% ±10.62%)vs (154.05% ±11.18%);(397.27% ±32.44%)vs (256.52% ±20.52%);(555.68% ±31.09%)vs (367.71% ±18.71%);Y－O vs O－O were (122.20% ±4.60%)vs(104.64% ±1.25%); (213.25% ±15.29%)vs(130.02% ±6.82%); (318.46% ±19.86%)vs(179.40% ±9.54%); (439.98%±24.09%)vs(240.03%±28.07%).±s.n=3.*P<0.05 vs O，Y－O vs O－O.圖4 細(xì)胞增殖能力檢測

Figure 5.Osteogenic differentiation potential of five groups.The positive area(×40)stained with Alizarin red shows significantly higher in Y group as compared to O group (30.55% ±3.18%)vs(16.25% ±2.70%)，and Y－O group as compared to O－O group(25.46% ± 1.52%)vs(13.85% ±1.69%).±s.n=3.**P <0.01 vs O group;##P<0.01 vs O－O group.圖5 成骨細(xì)胞分化能力檢測

5 脂肪細(xì)胞分化能力檢測

Y組脂肪細(xì)胞分化能力比O組強(qiáng)，油紅O染色陽性百分率為:(14.46% ±2.63%)vs(6.52% ± 2.35%)，P<0.05。Y－O組油紅O染色陽性百分率比 O－O組顯著增高:(12.99% ±2.61%)vs (6.03%±1.71%)，P<0.05。Y－Y組與Y組、OO組與O組脂肪細(xì)胞分化能力無顯著差異，見圖6。

Figure 6.Adipogenic differentiation potential of five groups.The positive area stained with oil red(×200)shows significantly higher in Y group as compared to O group (14.46%±2.63%)vs(6.52% ±2.35%)，and Y－O group as compared to O－O group(12.99% ± 2.61%)vs(6.03%±1.71%).±s.n=3.*P< 0.05 vs O group;#P<0.05 vs O－O group.圖6 脂肪細(xì)胞分化能力檢測

討論

BMSCs作為具有自我更新能力和多向分化潛能的細(xì)胞，有著非常重要的理論研究意義和臨床應(yīng)用價值，廣泛用于干細(xì)胞移植、損傷器官修復(fù)、基因治療等研究［2，3］。衰老是多細(xì)胞生物機(jī)體功能退變的過程，一般隨著年齡的增長，體細(xì)胞逐漸出現(xiàn)自我更新能力的降低和功能紊亂。BMSCs隨著供體年齡的增加，也相應(yīng)出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能的改變，細(xì)胞形態(tài)變大、變長，細(xì)胞集落形成單位的數(shù)量下降，細(xì)胞增殖能力、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及成軟骨細(xì)胞分化能力下降［4］，細(xì)胞端粒酶變短以及轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF－β)［5］、白細(xì)胞介素－6 (interleukin－6，IL－6)、白細(xì)胞介素－11(interleukin－11，IL－11)等細(xì)胞因子、生長因子及酶類功能下降。

細(xì)胞融合是近30年來迅速發(fā)展起來的細(xì)胞工程技術(shù)，是指細(xì)胞通過介導(dǎo)和培養(yǎng)，在離體條件下用人工方法將不同種的細(xì)胞通過無性方式融合(合并)成1個核或多核的雜合細(xì)胞的過程。雜合細(xì)胞得到了來自2個細(xì)胞的遺傳物質(zhì)(細(xì)胞核核外和染色體組合基因)，具有新的遺傳或生物特性。最近的研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的干細(xì)胞可以發(fā)生自身融合［6］，骨髓干細(xì)胞可與浦肯野神經(jīng)元細(xì)胞、心肌細(xì)胞［7］、小腸干細(xì)胞融合，骨髓干細(xì)胞通過分化和細(xì)胞融合修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞，骨髓干細(xì)胞通過細(xì)胞融合可使肝臟細(xì)胞再生［8］，細(xì)胞融合被認(rèn)為是使細(xì)胞功能恢復(fù)的1種有效方法。

通過本實驗，我們發(fā)現(xiàn):(1)在其它條件相同的情況下，隨著年齡的增長，BMSCs增殖功能、成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞分化功能明顯減退;(2)年輕與年老BMSCs通過PEG誘導(dǎo)融合后，能保持干細(xì)胞的特性;(3)年輕BMSCs可通過細(xì)胞融合改善年老BMSCs增殖功能、成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞分化功能。我們認(rèn)為其可能的機(jī)制包括以下3種:(1)年輕BMSCs改善了年老BMSCs端粒酶功能:有研究發(fā)現(xiàn)端粒酶可能通過延長端粒的長度恢復(fù)其再生和復(fù)制功能［9］。年輕BMSCs與年老BMSCs細(xì)胞核的融合可能改善了年老BMSCs端粒酶功能，從而改善其增殖及分化功能;(2)年輕BMSCs改變了年老BMSCs細(xì)胞因子或基因的表達(dá):有研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞分化功能與TGF－β、骨形成蛋白－2/4 (bone morphogenetic protein 2/4，BMP2/4)等細(xì)胞因子或基因的表達(dá)相關(guān)［3］。融合后細(xì)胞因子或基因表達(dá)等的改變可能改善了年老BMSCs多樣分化功能; (3)年輕BMSCs改變了年老BMSCs細(xì)胞內(nèi)外微環(huán)境:有研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞再生功能受周圍環(huán)境的影響［10］，年輕祖細(xì)胞微環(huán)境可促使年老祖細(xì)胞再生［11］。年輕 BMSCs內(nèi)外微環(huán)境可能促進(jìn)了融合BMSCs的增殖及分化。本研究尚未包括此方面的內(nèi)容，這些研究只是初步的結(jié)果，尚不完整，但對將來的研究提供有益的線索和基礎(chǔ)。

綜上所述，年齡的增加是導(dǎo)致干細(xì)胞功能的重要因素，隨著年齡的增加，干細(xì)胞的增殖和分化功能減退。通過聚乙烯二醇可建立年輕及年老骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞融合模型。通過細(xì)胞融合，年輕骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞改善了年老骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖功能及成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞分化功能。這對干細(xì)胞再生能力研究及干細(xì)胞移植的臨床治療提供了更多的途徑和依據(jù)。

(致謝:本實驗在加拿大Toronto General Research Institute完成，感謝李曙紅老師的悉心指導(dǎo)。)

［1］ Stolzing A，Scutt A.Age－related impairment of mesenchymal progenitor cell function［J］.Aging Cell，2006，5 (3):213－224.

［2］ 陳柏齡，陳東平，張志堅，等.Ang－1基因修飾的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植治療腦梗死的實驗研究［J］.中國病理生理雜志，2009，25(2):241－247.

［3］ 李映紅，吳正治，吳偉康，等.天然腦活素定向誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的實驗研究［J］.中國病理生理雜志，2009，25(8):1548－1553.

［4］ Baxter MA，Wynn RF，Jowitt SN，et al.Study of telomere length reveals rapid aging of human marrow stromal cells following in vitro expansion［J］.Stem Cells，2004，22 (5):675－682.

［5］ Moerman EJ，Teng K，Lipschitz DA，et al.Aging activates adipogenic and suppresses osteogenic programs in mesenchymal marrow stroma/stem cells:the role of PPAR－gamma 2 transcription factor and TGF－beta/BMP signaling pathways［J］.Aging Cell，2004，3(6):379－389.

［6］ Terada N，Hamazaki T，Oka M，et al.Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion［J］.Nature，2002，416(6880):542－545.

［7］ Alvarez－Dolado M，Pardal R，Garcia－Verdugo JM，et al.Fusion of bone－marrow－derived cells with Purkinje neurons，cardiomyocytes and hepatocytes［J］.Nature，2003，425(6961):968－973.

［8］ Vassilopoulos G，Wang PR，Russell DW.Transplanted bone marrow regenerates liver by cell fusion［J］.Nature，2003，422(6934):901－904.

［9］ Allsopp RC，Cheshier S，Weissman IL.Telomerase activation and rejuvenation of telomere length in stimulated T cells derived from serially transplanted hematopoietic stem cells［J］.J Exp Med，2002，196(11):1427－1433.

［10］Ryu BY，Orwig KE，Oatley JM，et al.Effects of aging and niche microenvironment on spermatogonial stem cell self－renewal［J］.Stem Cells，2006，24(6):1505－1511.

［11］Conboy IM，Conboy MJ，Wagers AJ，et al.Rejuvenation of aged progenitor cells by exposure to a young systemic environment［J］.Nature，2005，433(7027):760－764.