蘆 起， 余加林， 楊錫強(qiáng)， 劉 偉

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，重慶400015)

銅綠假單胞菌是醫(yī)院感染中最常見的機(jī)會(huì)致病菌。它常引起急性和慢性肺部感染，多見于局部或全身免疫功能障礙的患者?，F(xiàn)代微生物學(xué)觀點(diǎn)認(rèn)為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)感染大多以生物膜形式存在［1］。PA內(nèi)各個(gè)細(xì)胞間的交流有賴于群體感應(yīng)系統(tǒng)(quorum－sensing，QS系統(tǒng))。QS系統(tǒng)不僅在調(diào)節(jié)銅綠假單胞菌生物膜形成上，而且在免疫調(diào)節(jié)上均有關(guān)鍵作用［2］。Toll樣受體(Toll－like receptor，TLR)是一組重要的免疫模式識(shí)別受體，TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在啟動(dòng)機(jī)體的固有免疫反應(yīng)、介導(dǎo)獲得性免疫反應(yīng)中起到重要作用。本研究探討QS系統(tǒng)信號(hào)分子對(duì)外周血淋巴細(xì)胞增殖、TLR 2、TLR4表達(dá)，及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis－α，TNF－α)分泌的影響。

材料和方法

1主要試劑

3－氧十二烷酰高絲氨酸內(nèi)酯(3－oxo－C12－h(huán)omoserine lactone，3－O－C12－HSL)購(gòu)自Cayman公司，R/MINI－1640培養(yǎng)基和小牛血清購(gòu)自杭州四季青生物制品公司。MTT和 DMSO購(gòu)自Sigma，淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?。RNA提取試劑盒購(gòu)自北京Biotake公司，逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT－PCR)試劑盒和DNA marker購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，PCR引物由上海生工生物工程公司合成，CD3單克隆抗體、人TNF－α試劑盒購(gòu)自深圳晶美生物工程有限公司。

2 外周血淋巴細(xì)胞的分離和分組

取健康獻(xiàn)血者外周靜脈血40 mL，肝素抗凝，以淋巴細(xì)胞分離液分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，PBS充分洗滌，用含10%小牛血清RPMI－1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×1010cells/L，采用12孔塑料培養(yǎng)板，隨機(jī)分成5組。分別加入0、1、10、50、100 μmol/L 3－O－C12－HSL各10 μL，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。吸取上層淋巴液。經(jīng)CD3單克隆熒光抗體染色后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，證實(shí)所得的細(xì)胞85%以上為CD3+淋巴細(xì)胞。

3 TLR 2和4 mRNA的表達(dá)檢測(cè)

按Trizo1說明書抽提總RNA。以oligod T為引物將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄，然后采用25 μL反應(yīng)體系，運(yùn)用PCR方法對(duì)TLR2和4及內(nèi)參照β－actin同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列:TLR2:正義鏈5'－ggacttctcccatttccgtct－3，反義鏈5'－ctccaggtaggtcttggtgttc－3，產(chǎn)物138 bp;TLR4:正義鏈5'－ctgtccctgaaccctatgaact－3，反義鏈5'－cttctaaaccagccagaccttg－3’，產(chǎn)物135 bp;β－actin正義鏈5'－ccacgaaactaccttcaactcc－3，反義鏈5'－gtgatctccttctgcatcctgt－3'，產(chǎn)物131 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳分離(電泳條件:100 V，20 min)，溴化乙啶(5 mg/L)紫外燈下照相，用圖像分析系統(tǒng)分析計(jì)算吸光度值(A)，表達(dá)的相對(duì)量用目的基因/β－actin A值表示。

4 MTT法測(cè)定

淋巴細(xì)胞懸液置于96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入7×l09cells/L細(xì)胞100 μL，隨機(jī)分成5組。同時(shí)分別加入0、1、10、50、100 μmol/L 3－O－C12－HSL 1 μL，各設(shè)6個(gè)重復(fù)孔，另設(shè)培養(yǎng)液空白對(duì)照孔，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h，加入20 μL MTT(5 g/L)。37℃繼續(xù)培養(yǎng)6 h，加入150 μL DMSO低速振蕩10 min。用酶聯(lián)儀測(cè)定波長(zhǎng)490 nm A值。

5 ELISA法檢測(cè)TNF－α

將加入0、1、10、50、100 μmol/L 3－O－C12－HSL加入1×1010cells/L外周血單個(gè)核細(xì)胞，培養(yǎng)12 h后，收集培養(yǎng)上清，14 000 r/min離心10 min，保存于－80℃冰箱中。用人TNF－α試劑盒按其說明書進(jìn)行操作。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

1 不同劑量3－O－C12－HSL對(duì)CD3+淋巴細(xì)胞TLR2/4 mRNA的表達(dá)

未處理組TLR2/4 mRNA表達(dá)最低，隨著3－O－C12－HSL劑量的加大，單核細(xì)胞TLR 2/4 mRNA逐漸增高，僅TLR4 mRNA未處理組和1 μmol/L比較P>0.05，余組間比較P<0.05，差異顯著，見圖1、表1。

Figure 1.TLR2/4 mRNA expression in lymphocyte cells stimulated with 3－O－C12－HSL at different concentrations for 12 h.Lane 1:3－O－C12－HSL 0 μmol/L; Lane 2:1 μmol/L;Lane 3:10 μmol/L;Lane 4:50 μmol/L;Lane 5:100 μmol/L.圖1 不同濃度3－O－C12－HSL刺激后CD3+淋巴細(xì)胞TLR2/4 mRNA的表達(dá)

表1 不同濃度3－O－C12－HSL刺激后淋巴細(xì)胞TLR2/4 mRNATable 1 .Comparison of TLR2/4 mRNA expression in lymphocyte cells stimulated with 3－O－C12－HSL at different concentrations for 12 h(±s.n=3)

表1 不同濃度3－O－C12－HSL刺激后淋巴細(xì)胞TLR2/4 mRNATable 1 .Comparison of TLR2/4 mRNA expression in lymphocyte cells stimulated with 3－O－C12－HSL at different concentrations for 12 h(±s.n=3)

△P<0.05 vs 0 μmol/L 3－O－C12－HSL;#P<0.05 TLR2 mRNA at same dose of 3－O－C12－HSL.

?

2 不同劑量3－O－C12－HSL對(duì)CD3+淋巴細(xì)胞活力的影響

淋巴細(xì)胞的活力與未處理組比較增高，P<0.05，差異顯著。100 μmol/L 3－O－C12－HSL促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用最明顯，見表2。

表2 不同濃度3－O－C12－HSL刺激淋巴細(xì)胞MTT比色結(jié)果Table 2 .Comparison of MTT results in 3－O－C12－HSL－stimulated lymphocytes(±s.n=4)

表2 不同濃度3－O－C12－HSL刺激淋巴細(xì)胞MTT比色結(jié)果Table 2 .Comparison of MTT results in 3－O－C12－HSL－stimulated lymphocytes(±s.n=4)

△P<0.05 vs 0 μmol/L 3－O－C12－HSL.

?

3 不同劑量3－O－C12－HSL對(duì)TNF－α分泌的影響

不同劑量3－O－C12－HSL作用于外周血單個(gè)核細(xì)胞12 h后，在0 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L 3－O－C12－HSL濃度組，單個(gè)核細(xì)胞TNF－α分別為719.968±5.732、593.256 ±25.040、490.649 ±9.654、367.137±15.386、267.090±13.878。與0 μmol/L組相比，其余各劑量組均可抑制外周血單個(gè)核細(xì)胞上清中的TNF－α的表達(dá)(P<0.05)，差異顯著。100 μmol/L組3－O－C12－HSL抑制TNF－α分泌作用最明顯，見圖2。

Figure 2.Effect of 3－O－C12－HSL on production of TNF－α in mononuclear cells.±s.n=3.*P<0.05 vs 3－O－C12－HSL.圖2 不同濃度3－O－C12－HSL抑制單個(gè)核細(xì)胞TNF－α的分泌

討論

PA主要產(chǎn)生2種QS系統(tǒng)信號(hào)分子:3－氧十二烷酰高絲氨酸內(nèi)酯［N－(3－oxododecanoyl)－L－h(huán)omoserine lactone，3－O－C12－HSL］和N－丁?；呓z氨酸內(nèi)酯［N－butyryl－L－h(huán)omoserine lactone，C4－HSL］。QS系統(tǒng)信號(hào)分子具有調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)的作用。研究發(fā)現(xiàn):lasI基因或lasI rhlI雙基因缺失的銅綠假單胞菌不能在C57BL/6鼠肺部形成感染模型［3］。QS系統(tǒng)缺陷銅綠假單胞菌與相對(duì)應(yīng)的野生型比較誘導(dǎo)HCE細(xì)胞產(chǎn)生IL－8能力降低［4］。3－O－C12－HSL能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性導(dǎo)致凋亡［7］。將3－OC12－HSL直接注射到小鼠皮膚里，其可通過NF－κB通路導(dǎo)致某些細(xì)胞因子的分泌，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)皮膚組織中的IL－1、IL－6、MIP－2、MIP－1 mRNAs表達(dá)增高［5］。

TLRs是一組與固有免疫密切相關(guān)的受體家族［6］?？山閷?dǎo)固有免疫應(yīng)答的產(chǎn)生和細(xì)胞因子的分泌［7］。TLR 2、TLR4在非特異性免疫中可廣泛識(shí)別配體，在識(shí)別危險(xiǎn)信號(hào)并誘發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)中具有重要作用。感染后細(xì)胞TLR2和TLR4表達(dá)上調(diào)，并可誘導(dǎo)合成一系列炎性介質(zhì)，是機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)感染的一種防御反應(yīng)，清除外來病原菌。目前對(duì)于抗原呈遞細(xì)胞上TLRs研究較透徹，而淋巴細(xì)胞上的TLRs研究較少，多集中在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞上。研究表明，TLR2可以引起調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(T regulate cell，Treg)增殖，但同時(shí)Treg抑制活性發(fā)生了一過性消除;隨著TLR2配體的清除，Treg抑制活性可以完全恢復(fù)。離體實(shí)驗(yàn)顯示，細(xì)菌產(chǎn)物可以直接作用于Treg的TLR4，增強(qiáng)Treg的抑制活性［8，9］。

本研究結(jié)果表明，不同濃度的3－O－C12－HSL刺激單個(gè)核細(xì)胞后，淋巴細(xì)胞TLR 2、TLR4表達(dá)幾乎均上調(diào)，TLR2亞家族的上調(diào)較TLR4為明顯，提示TLR 2、TLR4上調(diào)不僅僅是增殖的結(jié)果，3－O－C12－HSL可影響淋巴細(xì)胞TLR 2、TLR4的不同表達(dá)，其原因可能為TLR 2、TLR4對(duì)3－O－C12－HSL的刺激有著明顯的差異，TLR 2對(duì)3－O－C12－HSL更易感。其次RT－PCR檢測(cè)存在一定誤差，可通過實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)一步證實(shí)。此外，3－O－C12－HSL能誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的增殖，與Hooi等［10］報(bào)道的QS系統(tǒng)可以通過抑制T細(xì)胞的增殖，擾亂免疫調(diào)節(jié)活動(dòng)的結(jié)果不一致，這可能與Hooi等［10］直接用3－O－C12－HSL刺激淋巴細(xì)胞，而本研究是用3－O－C12－HSL刺激單個(gè)核細(xì)胞后，然后收集淋巴細(xì)胞有關(guān)，其原因可能為3－O－C12－HSL刺激單核細(xì)胞后，其分泌的細(xì)胞因子影響淋巴細(xì)胞TLR 2、TLR4表達(dá)有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)TNF－α表達(dá)是隨著3－O－C12－HSL增高而降低，而Kim等［11］發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+Foxp3－或CD8+T細(xì)胞能夠抑制不同固有免疫細(xì)胞的細(xì)胞因子的釋放。因此，我們推測(cè)淋巴細(xì)胞的TLR 2、TLR4表達(dá)抑制了TNF－α表達(dá)，獲得性免疫對(duì)固有免疫有反饋?zhàn)饔谩Ｖ劣谑悄姆N(CD4+或CD8+)淋巴細(xì)胞亞型的增高，以及該亞群淋巴細(xì)胞的增高，對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，尚不清楚，還需進(jìn)一步深入研究和探討。

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