胡智興, 耿菊敏, 梁道明

(昆明醫(yī)學(xué)院1藥理學(xué)教研室,2云南省高校生物醫(yī)學(xué)工程中心,4第二附屬醫(yī)院,云南昆明 650500; 3云南省疾病預(yù)防控制中心檢驗中心毒理室,云南昆明 650022)

人胚胎干細(xì)胞 (human embryonic stem cells, hESCs)在一定條件下可以誘導(dǎo)神經(jīng)分化。迄今為止,人們已經(jīng)建立起 hESCs向神經(jīng)分化的許多方法,證實了多種內(nèi)外源性神經(jīng)誘導(dǎo)物質(zhì)或因子如視黃酸[1]、堿性成纖維細(xì)胞因子 (basic fibroblast growth factor,bFGF)[2]、表皮生長因子 (epidermal growth factor,EGF)[3]、骨形成蛋白 4抑制劑 noggin[4]等,可以誘導(dǎo) hESCs分化為神經(jīng)細(xì)胞。近年的研究發(fā)現(xiàn),肝細(xì)胞生長因子 (hepatocyte growth factor,HGF)可能具有神經(jīng)誘導(dǎo)作用[5,6],HGF聯(lián)合無血清培養(yǎng)基添加劑 G5 supplement可以誘導(dǎo)獼猴胚胎干細(xì)胞定向分化成高純度的神經(jīng)前體細(xì)胞 (neural progenitors, NPs),并能整合到大鼠腦部,發(fā)生遷移和分化[7]?？紤]到不同物種胚胎干細(xì)胞基因表達(dá)、生長特性,對發(fā)育信號的反應(yīng)等諸多方面均有差異,HGF是否能夠誘導(dǎo) hESCs的神經(jīng)分化,產(chǎn)生特定腦區(qū)的終末分化神經(jīng)細(xì)胞,需要進(jìn)一步研究。本研究運用人胚胎干細(xì)胞,探討HGF聯(lián)合 G5 supplement誘導(dǎo) hESCs定向分化為NPs的作用,并觀察所誘導(dǎo)的 NPs對于腦區(qū)神經(jīng)信號的反應(yīng)性,并為最終誘導(dǎo)特定腦區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 主要材料與試劑

人胚胎干細(xì)胞株 BG02購自美國 BresaGen公司;DMEM/F12培養(yǎng)基、knockout血清替代品(knockout serum replacement,KSR)、非必需氨基酸、G5 supplement(成分:胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸、生物素、氫化可的松、bFGF、EGF)、層黏連蛋白 (laminin)、音猥因子 (sonic hedgehog,Shh)購自 Gibco;新生牛血清購自 HyClone;明膠 (gelatin)、青霉素、鏈霉素、絲裂霉素 C、β-巰基乙醇、L-谷氨酰胺、多聚賴氨酸 (poly-D-lysine,PLL)購自 Sigma;巢蛋白(nestin)鼠抗單克隆抗體、β微管蛋白Ⅲ(βⅢ-tubulin)鼠抗單克隆抗體、O4鼠抗單克隆抗體、神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白 (glial fibrillary acidic protein, GFAP)兔抗多克隆抗體、musashi-1兔抗多克隆抗體、配對盒基因 6(paired box protein 6,Pax6)-兔抗多克隆抗體、HGF、bFGF購自 Chemicon;Trizol RNA試劑盒購自 Invitrogen。

2 方法

2.1 hESCs的培養(yǎng) hESCs細(xì)胞株BG02培養(yǎng)在絲裂霉素 C(5 mg/L)處理的小鼠成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層,培養(yǎng)基成分為:DMEM/F12、1 mmol/L谷氨酰胺、0.1 mmol/Lβ-巰基乙醇、1%非必需氨基酸、20%KSR, 4μg/L bFGF和 1×104U/L青霉素,100 mg/L鏈霉素。hESCs集落生長 5-6 d后,采用機(jī)械法對hESCs進(jìn)行傳代。

2.2 hESCs向 NPs分化[6]將 hESCs集落切割成100-200個細(xì)胞大小的團(tuán)塊,在撤除 bFGF的 hESCs培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng) 4 d,誘導(dǎo)擬胚體 (embryonid bodies, EBs)形成。隨機(jī)將 EBs分為 4組:(1)正常對照組, EBs培養(yǎng)在神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基 (DMEM/F12,1×ITS,2 mmol/L谷氨酰胺);(2)G5組,EBs培養(yǎng)在含 G5 supplement的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基;(3)HGF組,EBs培養(yǎng)在含 10μg/L HGF的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基;(4)HGF +G5組,EBs培養(yǎng)在含 10μg/L HGF和 G5 supplement的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基。各組細(xì)胞懸浮培養(yǎng) 7 d,將EBs轉(zhuǎn)移至 PLL/laminin(20 mg/L)包被的 24孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng) 7-10 d,待鋪展生長的細(xì)胞中出現(xiàn)玫瑰花結(jié)樣 NPs時,用 0.3 g/L dispase消化,細(xì)胞重新接種于 PLL/laminin包被的 24孔培養(yǎng)板。用 nestin,Pax6和 musashi-1進(jìn)行染色,統(tǒng)計各組 nestin陽性細(xì)胞的比例。

2.3 NPs的擴(kuò)增和分化 NPs懸浮培養(yǎng)于含有 10 μg/L HGF+G5 supplement的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。機(jī)械法傳代,用拉細(xì)的玻璃針切割成小團(tuán)塊,每周換液2次。

為了檢測NPs的體外分化能力,將神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基撤除 G5 supplement和 HGF,將 NPs消化為單個細(xì)胞后,接種于 PLL/laminin包被的培養(yǎng)板上,誘導(dǎo)分化 14 d,分別采用神經(jīng)元特異性標(biāo)記βIII-tubulin、星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記 GFAP、少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記 O4細(xì)胞染色,統(tǒng)計各陽性細(xì)胞的比例。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測不同誘導(dǎo)時間 nestin陽性細(xì)胞的比例 在含 HGF和 G5 supplement的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中分別誘導(dǎo) 0、4、7、10和 12 d的 EBs轉(zhuǎn)移到PLL/laminin包被的培養(yǎng)板上,貼壁培養(yǎng) 10 d。胰酶消化為單細(xì)胞,4%多聚甲醛室溫固定 20 min;PBS沖洗,加 0.4%Triton X-100室溫透膜處理 15 min; PBS沖洗,加入鼠抗單克隆抗體 nestin(1∶200)37℃孵育 1 h;PBS沖洗,加Ⅱ抗室溫孵育 30 min;PBS沖洗,PBS重懸細(xì)胞;流式細(xì)胞儀 (Becton Dickinson, FACS Vantage S)檢測,每次實驗檢測細(xì)胞數(shù)大約為1×106個,實驗重復(fù) 3次。

2.5 RT-PCR檢測NPs中腦區(qū)標(biāo)記基因的表達(dá)在含 100 mg/L Shh的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基,培養(yǎng) NPs 14 d。RT-PCR檢測神經(jīng)上皮前體細(xì)胞標(biāo)記基因Pax6、7、前腦前體細(xì)胞標(biāo)記基因 [腦因子 1(brain factor 1,Bf1)、正小齒同源框 1(orthodenticle homeobox 2,Otx2)],后腦、脊索前體細(xì)胞標(biāo)記基因[同源盒基因 (homeobox gene,Hox)b9、HoxC8、HoxC5、Hoxb4、原腸胚形成腦組織同源盒 2(gastrulation brain homeobox,Gbx2)]、中腦 NPs標(biāo)記[齒狀基因 2(engrailed 2,En2)]、腹側(cè) NPs標(biāo)記 NK2家族同源框基因 (NK2 homeobox 1,N kx2.1)和 (NK2 homeobox 2, Nkx2.2)的表達(dá)。

細(xì)胞總 RNA采用 Trizol RNA試劑盒提取。將總RNA(3μg)逆轉(zhuǎn)錄成單鏈 cDNA,加入引物進(jìn)行RCR擴(kuò)增。PCR引物的序列以及相應(yīng)的 PCR條件、產(chǎn)物的大小見表 1。PCR產(chǎn)物在 1.5%瓊脂糖凝膠上電泳,溴化乙啶染色后,在紫外下觀察。以看家基因 GAPDH為標(biāo)準(zhǔn),通過電泳條帶的強弱程度,評價基因表達(dá)量的高低。

2.6 免疫細(xì)胞染色

細(xì)胞用 4%多聚甲醛在室溫下固定 10 min,PBS洗后 0.1%Triton X-100透膜 15 min,加入 10%的羊血清在 37℃封閉 40 min,加入以下Ⅰ抗 4℃過夜:nestin鼠抗單克隆抗體 (1∶200)、βⅢ-tubulin鼠抗單克隆抗體 (1∶200)、O4鼠抗單克隆抗體(1∶100)、GFAP兔抗多克隆抗體 (1∶1 000)、musashi -1兔抗多克隆抗體(1∶200)、Pax6兔抗多克隆抗體(1∶200)。去掉Ⅰ抗后,PBS沖洗 3次,加入Ⅱ抗在37℃下孵育 1 h。以不添加Ⅰ抗而添加Ⅱ抗的細(xì)胞作為陰性對照組,檢測Ⅱ抗的非特異性結(jié)合情況。染色后的細(xì)胞用 Hoechst33342標(biāo)記細(xì)胞核,激光共聚焦顯微鏡(Zeiss,LS M 510 META)進(jìn)行檢測。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

表1 PCR引物的序列以及產(chǎn)物的大小Table 1 .Genes PCR pr imer sequences and product lengths

結(jié) 果

1 hESCs分化成 NPs細(xì)胞及鑒定

機(jī)械法將未分化的 hESCs集落 (圖 1A)切割成團(tuán)塊,懸浮培養(yǎng)于胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基中。4 d形成球狀 EBs樣結(jié)構(gòu)(圖 1B),將 EBs團(tuán)塊進(jìn)行隨機(jī)分組,轉(zhuǎn)移至 PLL/laminin包被的 24孔培養(yǎng)板上,貼壁生長。第 3-4 d,HGF、G5和 HGF+G5組的 EBs中間開始出現(xiàn)細(xì)長的細(xì)胞,并排列成玫瑰花樣 NPs(圖1C)。第 8-10 d,在玫瑰花結(jié)中間,出現(xiàn)神經(jīng)管樣NPs(圖 1D);而正常對照組基本上以扁平細(xì)胞為主,并未出現(xiàn)玫瑰花樣NPs(圖 1E)。

NPs生長了 10 d后,用 0.3 g/L dispase消化,繼續(xù)在 PLL/laminin包被的培養(yǎng)板上進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。免疫細(xì)胞染色表明這些細(xì)胞表達(dá) nestin(圖 1F),也表達(dá)NPs標(biāo)志musashi-1(圖 1G)和 Pax6(圖 1H)。NPs在去掉 HGF和 G5后,接種在包被有 0.1%明膠的 24孔培養(yǎng)板上,細(xì)胞形成單層細(xì)胞,連續(xù)培養(yǎng) 14 d,分化的細(xì)胞出現(xiàn)βIII-tubulin+神經(jīng)元 (圖 1 I),表達(dá)O4的少突細(xì)胞(圖 1J)以及 GFAP+的星型膠質(zhì)細(xì)胞(圖 1K)。提示所獲得的 NPs具有分化為 3個譜系的神經(jīng)細(xì)胞的能力。

隨著培養(yǎng)時間的增長,NPs的貼壁能力逐步降低,逐步形成神經(jīng)球(圖 1L),在含 HGF+G5的神經(jīng)培養(yǎng)基保持增殖能力。在體外培養(yǎng)了 3個月的神經(jīng)球采用 nestin染色,結(jié)果表明,神經(jīng)球仍然表達(dá) nestin(圖 1M),說明 HGF+G5能夠長期地支持NPs的生長。

Figure 1.HGF induces human embryonic stem cells(hESCs)to differentiate into neural progenitors(NPs). A:phase contrast microscopic image of human embryonic stem cell line BG02 propagated on mouse embryonic fibroblast cells;B:four-day-old embryoid bodies(EBs)derived from hESCs;C:neural rosette-like structures(arrows)formed in the center of the differentiating cells 10 d after G5 and/or HGF treatment(10 mg/L)treatment;D:neural tube-like structures(arrow)formed on 14 d after G5 and/or HGF(10mg/L)treatment;E:differentiated cells in neural induction medium without G5 and HGF;F:immunofluorescence staining of nestin protein(a NP marker)on NP clump attached on culture plate for 3 d;G:immunofluorescence staining ofMusashi(a neuroepithelium/NP marker)on NPs;H1-H3: immunofluorescence stainingof nestin and Pax6(another neuroepithelium/NPmarker)in neuralprogenitors differentiated from hESCs;I-K:immunofluorescence analysis of three neural lineages differentiated from NPs.NPs differentiated from hESCs were cultured on 0.1%glutin-coated plateswithout growth factors for 7 d to determine the multipotency ofNPs generated. The differentiated cellswere stained for oligodendrocyte markerO4(I),neuron markerβIII-tubulin(TuJ,J),and astrocyte maker GFAP(K);L:NPs cultured in medium supplied with G5 and 10mg/L HGF for 3 mouths could proliferate as neurospheres;M:immunofluorescence staining of nestin on the neurosphere.Blue:Hoechst33342 labeled nuclei.Scale bar:50μm.圖 1 HGF誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞分化成神經(jīng)前體細(xì)胞

2 HGF促進(jìn) hESCs分化成 NPs細(xì)胞

流式細(xì)胞儀定量檢測各組 nestin+細(xì)胞占整個分化細(xì)胞的比例。如圖 2所示,與正常對照組相比, HGF組和 G5組的 nestin+NPs明顯增多 (P＜0.05), HGF+G5組NPs的 nestin+比例(87.3%±3.9%)顯著高于其它組(P＜0.05)。

Figure 2.The proportion of nestin positive cells differentiated from hESCs in various treatment groups detected by fluorescent activated cell sorter(FACS).A:FACS results of nestin+cells in NPs of various groups;B:the percentages of the nestin+cells in NPs of various groups.±s.n=6.＊P＜0.05vscontrol group;#P＜0.05vsHGF group or G5 group.圖 2 流式細(xì)胞儀檢測不同處理組人胚胎干細(xì)胞分化的 nestin+細(xì)胞比例

3 不同日齡 EB的分化特征

將分別懸浮培養(yǎng) 0、4、7、10和 12 d的 EBs轉(zhuǎn)移到 PLL/laminin包被的培養(yǎng)板上,貼壁培養(yǎng) 10 d,培養(yǎng)基為含10 mg/L HGF+G5的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基。流式細(xì)胞儀檢測 nestin陽性細(xì)胞的比例,結(jié)果見圖 3,表明隨著 EBs日齡的增加,nestin陽性細(xì)胞的比例增加,7 d時達(dá)到最大,進(jìn)入平臺期。

Figure 3.The proportion of nestin positive cells in differentiated cells from embryoid bodies(EBs)in different culture days.EBs cultured in different dayswere further attached on poly-D-lysine/laminin-coated plates for 10 d.The percentages of the nestin+cellswere determined by FACS.±s.n=4.圖 3 不同日齡擬胚體分化的 nest in陽性細(xì)胞比例

4 NPs的腦區(qū)標(biāo)記及對神經(jīng)信號分子 Shh的反應(yīng)性

用 RT-PCR分析NPs腦區(qū)標(biāo)記的表達(dá),結(jié)果如圖 4,HGF(10 mg/L)+G5誘導(dǎo)的NPs表達(dá)神經(jīng)上皮前體細(xì)胞標(biāo)記 (Pax6、Pax7)、前腦前體細(xì)胞標(biāo)記(O tx2、B f1)、中腦前體細(xì)胞標(biāo)記 (En2),而弱表達(dá)后腦、脊索前體細(xì)胞標(biāo)記 (Gbx2,Hoxb4),不表達(dá)后腦、脊索前體細(xì)胞標(biāo)記 (HoxC8、HoxC5、Hoxb9),也不表達(dá)腹側(cè) NPs標(biāo)記 (Nkk2.1和 Nkk2.2)。這提示所獲得的NPs具有多個腦區(qū)前體細(xì)胞的特征,而沒有腹側(cè)NPs的特征。而在含有 Shh的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng) 14 d后,腹側(cè) NPs標(biāo)志N kk2.1和 Nkk2.2表達(dá)增強,前腦標(biāo)志 O tx2、B f1表達(dá)減弱,后腦標(biāo)志 Gbx2、Hoxb4表達(dá)增強。表明NPs在 Shh作用下,初步具有后腦、腹側(cè)NPs的特征。

討 論

HGF是一種多效性生長因子,具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、形態(tài)發(fā)生等作用。研究表明 HGF及其受體在胚胎及成體神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)[8],HGF能夠促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新[9],以及神經(jīng)元存活、再生和功能修復(fù)[10]。Schuldiner等[5]的研究表明 HGF能誘導(dǎo) hESCs分化成神經(jīng)外胚層細(xì)胞,而 HGF聯(lián)合 G5 supplement可以誘導(dǎo)獼猴胚胎干細(xì)胞定向分化成高純度的NPs[7]。在本實驗中,我們應(yīng)用 HGF和 G5 supplement有效地誘導(dǎo)hESCs分化成高純度的NPs,并保持NPs的長期增殖培養(yǎng)。NPs可進(jìn)一步分化成神經(jīng)元、少突和星型膠質(zhì)細(xì)胞。

Figure 4.Comparison of brain region marker gene expression levels of neural progenitors treated with Shh,a ventralizingmolecule for 14 d.A:brain region marker genes includingPax6,Pax7,Bf1,O tx2,Hoxb9,HoxC8,HoxC5,Hoxb4,Gbx2,En2, Nkx2.1andNkx2.2were analyzed byRT-PCR.Lane 1:neuralprogenitors cultured inmedium without Shh;Lane 2:neural progenitors cultured inmedium with Shh.B:the relative levelof brain regionmarker genes in neuralprogenitors cultured in medium without Shh(untreated group)and neural progenitors cultured in medium with Shh(treated group).±s.n=4.＊P＜0.05vsuntreated group.圖 4 RT-PCR檢測神經(jīng)前體細(xì)胞腦區(qū)標(biāo)記基因的表達(dá)

誘導(dǎo) EBs形成是 hESCs分化最常用的方法,優(yōu)點是具有空間三維結(jié)構(gòu),與胚胎發(fā)育進(jìn)程相仿[11]。本實驗發(fā)現(xiàn) EBs的日齡對NPs的誘導(dǎo)有影響,7d的EBs所誘導(dǎo) nestin+細(xì)胞的比例最大。這可能是由于隨著時間增加,EBs直徑增加,內(nèi)部細(xì)胞由于缺乏養(yǎng)分和因子而死亡。此外,以前將獼猴胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞時[7],采用了含血清的神經(jīng)誘導(dǎo)體系,而我們采用無血清誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞分化。無血清、成分明確的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)體系是研究神經(jīng)細(xì)胞分化機(jī)制以及細(xì)胞替代治療所必須的,因而本研究所使用的神經(jīng)誘導(dǎo)體系可為今后的研究提供細(xì)胞來源。

本研究中分化得到的細(xì)胞表達(dá) NPs特征標(biāo)記(nestin+、Pax6+、musashi+),與以往的報道相符[12],且細(xì)胞表達(dá)前腦前體細(xì)胞標(biāo)記 (O tx2、B f1)、中腦前體細(xì)胞標(biāo)記 (En2)、后腦、脊索前體細(xì)胞標(biāo)記(Hoxb4),提示 HGF和 G5 supplement所誘導(dǎo)的 NPs具有多個腦區(qū)的特征,而 Yan等[13]用 bFGF誘導(dǎo)的神經(jīng)上皮細(xì)胞只具有前腦前體細(xì)胞特征。這是否說明 HGF和 G5 supplement所誘導(dǎo)的 NPs具有更廣泛的腦區(qū)特征,還有待于今后的研究。此外,神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生包含了若干個由信號分子精密控制的連續(xù)步驟,其中第一步就是外胚層分化成神經(jīng)上皮細(xì)胞,然后神經(jīng)上皮細(xì)胞在特定的神經(jīng)信號分子的作用下,分化為特定腦區(qū)的前體細(xì)胞,繼而分化為終末分化的細(xì)胞。我們把腹側(cè)化神經(jīng)信號分子 Shh添加到神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,結(jié)果細(xì)胞表達(dá)腹側(cè)化基因 (N kk2.1和Nkk2.2),前腦標(biāo)記表達(dá)下調(diào),而后腦標(biāo)記表達(dá)上調(diào)。提示誘導(dǎo)得到的NPs能對神經(jīng)信號分子產(chǎn)生反應(yīng),有可能產(chǎn)生特定腦區(qū)的終末分化神經(jīng)細(xì)胞。將NPs分化成高純度的終末分化細(xì)胞是下一步工作重點。

本研究中采用了 G5 supplement,主要活性成分為 EGF和 bFGF。以前的研究表明 EGF和 bFGF在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中起著重要的作用,已用于NPs的誘導(dǎo)分化和增殖[14,15]。我們的結(jié)果表明 HGF+ G5能夠更加有效誘導(dǎo) hESCs的神經(jīng)分化,nestin陽性細(xì)胞的比例高于 G5組,說明 HGF和 G5 supplement之間有協(xié)同作用。然而這種協(xié)同作用到底是如何誘導(dǎo) hESCs向神經(jīng)細(xì)胞分化,有待于深入的研究。

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