許婷婷, 周艷華, 李 軍, 譚廣銷, 劉革修

(暨南大學醫(yī)學院血液病研究所,廣東廣州 510632)

人骨髓從嬰兒出生直到年老,經(jīng)歷了紅骨髓向黃骨髓的轉(zhuǎn)變。黃骨髓主要由脂肪組織構成,其造血功能甚微,而且大量的脂肪細胞會明顯減慢骨髓中血細胞的形成速度,骨髓的脂肪化在骨質(zhì)疏松癥、股骨頭壞死等常見老年疾病中尤為明顯,這些變化將嚴重影響骨髓造血、進而影響人體健康。骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSC)是位于骨髓腔內(nèi)一種具有多向分化潛能、造血支持和免疫調(diào)控功能的成體干細胞,可以向成骨和成脂分化,是骨髓脂肪細胞和成骨細胞的來源[1]。本研究擬采用新生兒臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSC)對小鼠自然衰老過程中骨髓脂肪化進行干預研究,觀察其是否能抑制脂肪化,以期為延緩造血系統(tǒng)衰老的研究開辟一條新思路。

材 料 和 方 法

1 材料

足月剖宮產(chǎn)健康新生兒的臍帶取自暨南大學華僑醫(yī)院,產(chǎn)婦無傳染性疾病,并按 2005年國務院《醫(yī)院管理條例》第33條規(guī)定對產(chǎn)婦的治療及風險進行如實告知,產(chǎn)婦及其家屬對胎盤可能用于科學研究均簽署知情同意書,實驗方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。6月齡 SPF級雌性BALB/c純系小鼠 40只,購自南方醫(yī)科大實驗動物中心 (動物合格證號: 0043640)。DMEMF12培養(yǎng)基、膠原酶Ⅳ和胰蛋白酶均購自Gibco。胎牛血清購自 PAA。PE標記的抗 CD34、CD45、CD106及 FITC標記的抗 CD44、CD29、CDHLA-DR單克隆抗體及小鼠相應的同型對照購自 Becton Dickinson。PPARγ免疫組織化學試劑盒購自福州邁新生物技術公司產(chǎn)品。地塞米松、胰島素、抗壞血酸、β-磷酸甘油與油紅O購自 Sigma。

2 方法

2.1 間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)與鑒定 (1)臍帶MSC 臍帶經(jīng) PBS液清洗,并剪碎,經(jīng)等體積 0.2%膠原酶Ⅳ消化 4 h,得到的混懸液過 200目篩網(wǎng),收集濾過液,用 PBS充分稀釋后,離心并漂洗,得到懸浮細胞,計數(shù)接種于含 10%FBS的DMEMF12完全培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中,置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),3 d后全量換液,棄去非貼壁細胞,約 5 d或細胞融合達 80%時,用 0.25%胰酶消化,按 1∶2傳代。以后每 2 d完全換液 1次,約 4 d傳代 1次,留第 2-4代細胞備用。(2)成年小鼠骨髓MSC 按本實驗室已建立的方法進行,取6月齡小鼠斷頸處死后乙醇浸泡,取出雙側(cè)股骨并剪開2端,用含 10%FBS的DMEMF12培養(yǎng)基從干骺端反復沖洗骨髓腔,將沖洗下來的液體離心后重懸接種。分別取第 3代骨髓MSC與 hUC-MSC,進行成骨成脂誘導分化。MSC的鑒定采用傳代培養(yǎng)、形態(tài)觀察及流式細胞儀檢測其表面標志(CD106、CD45、CD34、CD29、CD44、HLA-DR)及成骨成脂誘導分化實驗。

2.2 hUC-MSC與成年小鼠骨髓MSC生長增殖與成骨成脂分化比較 分別取第3代 hUC-MSC、成年小鼠骨髓MSC進行生長曲線測定。成骨細胞誘導采用含有 0.1μmol/L地塞米松、10 mmol/Lβ-磷酸甘油、50μmol/L抗壞血酸和含 10% FBS的DMEMF12培養(yǎng)基,分別在誘導培養(yǎng)第 7 d和第 14 d時,收集細胞,加入 PBS放入 -20℃冰箱反復凍融3次,采用以磷酸對硝基苯為底物的動力學測定方法檢測細胞堿性磷酸酶活性(ALP)。脂肪細胞誘導采用含有 1μmol/L地塞米松、5×103U/L胰島素和 5%FBS的DMEMF12培養(yǎng)基進行,觀察到胞質(zhì)中有脂滴形成時,4%多聚甲醛固定、0.375%油紅O染色檢測。

2.3 hUC-MSC干預小鼠自然衰老過程中骨髓脂肪化的觀察 6月齡雌性BALB/c小鼠40只,隨機留取8只小鼠,用于成年小鼠骨髓MSC的成骨成脂分化研究,剩下的隨機分為實驗組和對照組,每組各 16只。飼養(yǎng)于層流無菌環(huán)境,無菌飲食、飲水。(1)實驗組為MSC干預組:經(jīng)尾靜脈輸注第 2代hUC-MSC 0.1 mL(含 5×105個細胞),每個月后重復輸注hUC-MSC 1次,共 6次;(2)對照組為未干預組:相應經(jīng)尾靜脈輸注 0.1 mL生理鹽水。于第 6個月處死小鼠,得到的股骨快速放入 4%的鹽酸甲醛脫鈣固定液中,12 h后進行常規(guī)脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片,HE染色后在顯微鏡下觀察骨髓造血組織情況并攝像。同時取部分骨髓組織切片,采用免疫組織化學染色檢測 PPARγ蛋白的表達 (操作步驟按試劑盒說明進行),從分子水平了解骨髓成脂分化情況。

3 統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1 人臍帶間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)及免疫表型鑒定結(jié)果

觀察發(fā)現(xiàn),采用上述方法從臍帶組織中分離的細胞,一部分于 12 h內(nèi)開始貼壁,3 d內(nèi)大部分細胞貼壁,細胞呈梭形、多角形,并可見多個細胞形成集落,但仍有圓形細胞混雜其中。4-5 d后傳代,傳代后的細胞主要呈長梭形,形態(tài)較原代均一,以平行排列生長為主,或呈漩渦狀生長。第3代細胞經(jīng)成骨成脂分化誘導,可分化為成骨細胞和脂肪細胞;流式細胞術檢測,人臍帶MSC強表達 CD44、CD29,不表達造血干細胞標志CD34和CD45,不表達HLA-DR和CD106。

2 hUC-M SC與成年小鼠骨髓M SC生長增殖與成骨成脂分化的比較結(jié)果

hUC-MSC生長曲線呈上升陡直的“S”形,接種后第 1、2 d為潛伏適應期,從第 3 d細胞開始增殖加速并進入對數(shù)生長期,第 5-6 d達到高峰,以后進入平臺期。成年小鼠骨髓MSC生長曲線呈上升遲緩的“S”形,細胞倍增速度慢。MSC經(jīng)成脂誘導后,形態(tài)發(fā)生明顯變化,由長梭形變成類圓形、圓形細胞,胞漿內(nèi)有很多脂滴形成。油紅O染色后,可以看到 2組MSCs內(nèi)均有紅色脂滴。與 hUC-MSC相比,骨髓MSC組發(fā)生形態(tài)改變的細胞數(shù)量多,脂滴形成的時間早 (第 6 d出現(xiàn))且體積大,而 hUC-MSC組脂滴形成晚(第 11 d出現(xiàn))且呈碎點狀分布,見圖 1A、B。ALP是MSC成骨分化后最早出現(xiàn)的成骨性標志,2組ALP表達量變化見表 1,在成骨誘導后第 7 d,2組ALP表達量無明顯差異 (P＞0.05);在成骨誘導后第 14 d,hUC-MSC組ALP表達量明顯增加,是骨髓MSC組的2.3倍(P＜0.01),差異顯著。這些結(jié)果說明 hUC-MSC屬于原始年輕的MSC,具有更強的生物學功能。

表1 成骨誘導后第 7 d、14 d時各組細胞 ALP表達量Table 1 . The expression level ofALP on 7 d,14 d(±s.n=8)

表1 成骨誘導后第 7 d、14 d時各組細胞 ALP表達量Table 1 . The expression level ofALP on 7 d,14 d(±s.n=8)

▲▲P＜0.01vsbone marrowMSC group.

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3 hUC-M SC輸注對小鼠骨髓病理變化及 PPARγ蛋白表達的影響

實驗組骨髓切片的造血組織明顯多于對照組,有核細胞較多;而對照組骨髓切片的脂肪組織明顯多于實驗組,見圖1C、D、E、F。PPARγ蛋白陽性表達為棕色,多定位于基質(zhì)細胞胞漿內(nèi),也有部分位于胞核內(nèi),實驗組骨髓細胞中 PPARγ蛋白的陽性表達明顯低于對照組,見圖 1G、H。

Figure 1.Lightmicroscopy image of cells.A:the differentiation of hUC-MSC to adipose cells;B:the differentiation of bonemarrow MSC to adipose cells(oil red O,×200);C,D:cross and longitudinal section of bone marrow in experimental group;E, F:cross and longitudinal section of bone marrow in control group(HE,×50);G:immunohistochemistry staining for PPARγof exper imental group;H:immunohistochemistry staining for PPARγof control group(SP,×200).圖 1 光學顯微鏡下的細胞形態(tài)

Figure 2.Growth curve of hUC-MSC and bone marrow MSC.圖2 hUC-M SC和成年小鼠骨髓M SC的生長曲線

討 論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),hUC-MSC屬于較原始的MSC,比中老年小鼠骨髓MSC具有更強的生物學功能,給中老年小鼠定期輸注該細胞,其骨髓組織切片觀察發(fā)現(xiàn)實驗組造血組織比同期對照組豐富、脂肪化輕;未經(jīng) hUC-MSC干預的小鼠骨髓細胞 PPARγ蛋白表達量明顯高于 hUC-MSC干預小鼠。這些結(jié)果說明 hUC-MSC干預可抑制小鼠自然衰老進程中骨髓的脂肪化,可用于造血系統(tǒng)抗衰老研究,根據(jù)現(xiàn)有資料推測其機制可能有多方面因素。

骨髓MSC是骨髓中成骨細胞和脂肪細胞的共同來源,在個體正常發(fā)育過程中,這 2種分化途徑通過 TEG-β、BMPs、PPARγ2、生長激素、1,25(OH)2D3和雌激素等的調(diào)節(jié)而維持在平衡狀態(tài)[2]。當機體年輕時,骨髓MSC成骨相關基因表達活躍,分泌成骨刺激因子,促進成骨分化;這些因子也可能抑制MSC成脂基因的表達,使得該平衡趨向于成骨細胞方向分化,這不僅參與骨組織的構成,還是修復 HSC壁龕的關鍵細胞成分,同時年輕的MSC可以分泌許多造血干細胞 (hematopoietic stem cell,HSC)相關生長因子,促進造血。當機體逐漸衰老時,骨髓MSC數(shù)量與活性不斷下降,成骨相關基因表達減少,相反地,與成脂相關的基因逐漸活躍并表達,介導MSC成脂分化過程中起關鍵性作用的轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)[3]表達升高[4],使得該平衡轉(zhuǎn)為成脂分化占優(yōu)勢,導致骨髓中脂肪組織增多。此時,首先成骨受到抑制,HSC龕位減少,黏附分子也發(fā)生改變,進而抑制了造血干/祖細胞的增殖和分化;其次,骨髓內(nèi)的脂肪細胞可誘導骨髓MSC的凋亡[5];再則,骨髓中HSC與MSC是相互作用相互影響的細胞體系,當機體進入老年階段時,HSC和MSC都會出現(xiàn)衰老,出現(xiàn)相互削弱對方作用的惡性循環(huán),骨髓造血被進一步抑制。

從上述分析中我們認為將具有更強生物學功能的 hUC -MSC定期輸給逐漸老年的小鼠體內(nèi),不僅其自身可以進行成骨分化,提供 HSC龕位;還分泌許多細胞因子,如:神經(jīng)生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、干細胞生長因子、Flt-3 ligand、TPO、L IF、 IL-6和 IL-11等[6,7]。這些細胞因子可以積極作用于老年小鼠 HSC,促進其增殖分化,而后者可能又反過來支持促進自身的骨髓MSC,形成互相促進的良性循環(huán);也可能作用于小鼠自身的骨髓MSC,上調(diào)其成骨分化的相關基因,下調(diào)成脂分化基因的表達,抑制骨髓脂肪化。

綜上所述,本研究證實了 hUC-MSC可以抑制小鼠自然衰老進程中骨髓的脂肪化,為老年股骨頭壞死、骨質(zhì)疏松癥等骨髓過度脂肪化疾病提供了新的思路。但是調(diào)節(jié)MSC分化的分子機制很復雜,其抑制骨髓脂肪化的具體機制還不清楚,仍需進一步的實驗證明。

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