林春蘭, 陳少華, 楊力建, 鄭海濤, 沈 琦, 周羽竝, 李揚(yáng)秋,3

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院1生物化學(xué)教研室,2血液病研究所,3再生醫(yī)學(xué)教育部門重點實驗室,廣東廣州 510632)

臍帶血 (umbilical cord blood,UCB)作為異基因造血干細(xì)胞移植物,由于其具有容易獲取、來源豐富、方便快捷、移植物抗宿主病 (graft versus host disease,GVHD)的發(fā)生率和嚴(yán)重程度低、潛伏性病毒傳播的機(jī)率低等優(yōu)點,使UCB作為一種新的重要的造血干細(xì)胞,尤其是無血緣關(guān)系造血干細(xì)胞的供體顯示出廣闊的應(yīng)用前景。目前,UCB移植不僅僅被應(yīng)用于血液病、自身免疫性疾病、免疫缺陷和代謝性疾病以及遺傳性疾病等多種疾病的治療,還開始應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心臟疾病、缺血性下肢血管病、實體瘤的治療以及組織再生醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用研究,盡管有些還處于實驗階段,但充分說明了 UCB的重要作用得到了普遍的肯定[1,2]。有關(guān) UCB T細(xì)胞的免疫學(xué)特性目前研究不多,本課題組前期研究了 UCB T細(xì)胞的 T細(xì)胞受體(T cell receptor,TCR)Vα和Vβ基因譜系分布特點[3,4]及 TCRζ鏈基因的表達(dá)特點[5],本研究擬在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步了解 TCRζ基因特異性轉(zhuǎn)錄因子 Elf-1(E74-like factor 1)在 UCB單核細(xì)胞細(xì)胞及其 CD4+和 CD8+T細(xì)胞亞群中的表達(dá)特點,以期為更有效、更合理地應(yīng)用 UCB提供一些實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 標(biāo)本收集

收集健康婦女妊娠 38-40周之間正常分娩時臍帶血 12例(標(biāo)本來源于廣州暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院),產(chǎn)婦無惡性腫瘤和各種遺傳性疾病,無急慢性傳染病。按常規(guī)方法分離單個核細(xì)胞,再利用 CD4和 CD8磁珠單抗(MiltenYibiotec)和免疫磁珠分選法(MCAS)分選 CD4+和 CD8+T細(xì)胞,10例健康成人外周血樣本作為對照。

2 RNA提取及 cDNA合成

按常規(guī)方法用 Trizol試劑盒 (Invitrogen)提取RNA,隨機(jī)引物和反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒 (PowerScriptTMReverse,BD)反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA第 1鏈;用 RT-PCR檢測β2微球蛋白 (β2-microglobulin,β2M)基因的表達(dá)情況以檢驗所合成 cDNA的質(zhì)量。

3 引物設(shè)計

Elf-1:上游引物 5′-ACAAAGATGGAAAGGGAAACA-3′,下游引物 5′-CCACAACCTGGACACTGCT-3′(基因序列號為 001145353),擴(kuò)增目的片段長度 152 bp,引物由上海英駿合成。β2M:上游引物 5′-TACACTGAATTCACCCCCAC-3′,下游引物5′-CATCCAATCCAAATGCGGCA-3′,產(chǎn)物片段大小為 144 bp,引物由德國柏林 T IB Molbiol公司合成。

4 擴(kuò)增效率一致性檢測

檢測樣本 Elf-1基因表達(dá)情況之前,根據(jù)相對定量法分析的原則,首先必須保證 Elf-1和β2M mRNA的擴(kuò)增效率的一致。故將Molt-3細(xì)胞株的cDNA以 5倍倍比稀釋,以 50-5-4作為模板,進(jìn)行SYBR GreenⅠ實時定量 PCR來檢測其擴(kuò)增效率是否一致。

5 SYBR GreenⅠ實時定量 PCR

利用 SYBR GreenⅠ熒光定量 PCR檢測各樣本Elf-1 mRNA表達(dá)情況,并將β2M mRNA作為內(nèi)參照。每一標(biāo)本分別進(jìn)行 Elf-1和β2M檢測?？偡磻?yīng)體積為 20μL,應(yīng)用 RealMasterMix試劑盒 (Tiangen),包括 2.5×RealMasterMix 9μL、0.5 mmol/L上、下游引物以及 1μL cDNA。在 95℃、2 min變性后,共進(jìn)行45個循環(huán)擴(kuò)增,每一循環(huán)包括 95℃20 s, 62℃40 s。并在 79℃和 81℃2次讀板 (1 s)。隨后,以 0.17℃/s變化速度從 55℃到 95℃每隔 2 s記錄 1次熒光值,獲得熔解曲線。反應(yīng)在 Chromo 4熒光定量 PCR儀 (Bio-Rad)中進(jìn)行。每樣本均重復(fù)2次檢測。

6 Elf-1 mRNA相對表達(dá)水平的計算

采用相對定量法分別分析臍帶血和健康成人外周血 Elf-1 mRNA的表達(dá)水平,以β2M為內(nèi)參照,利用△Ct值,計算臍帶血和健康成人外周血 Elf-1 mRNA相對表達(dá)量,計算公式為[6]:mRNA相對表達(dá)量 =2-△Ct×100%,其中,△Ct=Ct(Elf-1)-Ct(β2M)。

7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用 SPSS 11.5軟件分析。計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差 (±s)表示。2樣本資料之間的均數(shù)比較采用獨立樣本 t檢驗。

結(jié) 果

1 擴(kuò)增效率一致性分析

為了利用相對定量的比較 Ct法對 Elf-1 mRNA表達(dá)進(jìn)行定量,將倍比稀釋的 cDNA的 log值作為橫坐標(biāo),ΔCt=[Ct(Elf-1)-Ct(β2M)]作為縱坐標(biāo)繪制關(guān)系曲線,得出 Elf-1與內(nèi)參照之間的直線斜率的絕對值為 0.066,直線斜率的絕對值接近于 0[7],表明目的基因 Elf-1和參照基因β2M的擴(kuò)增效率一致,實驗結(jié)果可以應(yīng)用公式 2-△Ct×100%進(jìn)行相對定量。

2 Elf-1擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定

β2M產(chǎn)物的熔解曲線峰值均在 83℃,Elf-1產(chǎn)物的熔解曲線峰值在 82℃,2%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示 Elf-1實時定量 RT-PCR產(chǎn)物片段大小正確,為 152 bp。PCR產(chǎn)物直接序列分析結(jié)果與 Elf-1基因序列 (No.001145353)完全一致。

3 Elf-1在CBMCs和 PBMC中的表達(dá)

所有檢測樣本均表達(dá) Elf-1。根據(jù)實時定量PCR的相對定量公式:2-△Ct×100%計算 Elf-1的mRNA表達(dá)量,結(jié)果顯示,12例臍帶血 Elf-1 mRNA相對表達(dá)量為 18.55% ±2.48%,其中最高為36.22%,最低為 6.45%,10例健康成人 Elf-1的mRNA相對表達(dá)量為 9.16%±1.92%,均存在個體表達(dá)差異性,這種差異尤其以 CBMCs為明顯,見圖1,CBMCs中 Elf-1 mRNA表達(dá)量明顯高于 PBMC (P＜0.01)。

Figure 1. Expression of Elf-1 mRNA in UCB and peripheral blood from healthy adults.圖 1 Elf-1在臍帶血及健康成人外周血中的表達(dá)水平

4 Elf-1在CD4+及CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)特點

Elf-1在臍帶血及健康成人外周血 CD4+及CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)水平見圖 2。12例臍帶血CD4+T細(xì)胞中 Elf-1 mRNA相對表達(dá)量為 3.83% ±0.61%,雖然高于健康成人外周血 CD4+T細(xì)胞(2.73%±0.52%),但無顯著差異 (P＞0.05)。而臍帶血 CD8+T細(xì)胞中 Elf-1 mRNA相對表達(dá)量相對較高(3.52%±0.45%),其中最高為 6.75%,最低為 1.71%,明顯高于健康成人外周血 CD8+T細(xì)胞(2.02%±0.27%,P＜0.05)。臍帶血中 CD4+T細(xì)胞和 CD8+T細(xì)胞 Elf-1 mRNA表達(dá)水平差別無顯著(P＞0.05);成人外周血中 CD4+T細(xì)胞和 CD8+T細(xì)胞 Elf-1 mRNA表達(dá)水平差別無顯著(P＞0.05)。

Figure 2. Expression level of Elf-l mRNA in CD4+,CD8+T cells from UCB and peripheralblood of healthy adults.圖 2 Elf-1在臍帶血及健康成人外周血中 CD4+、CD8+T細(xì)胞的表達(dá)水平

討 論

Elf-1是 Ets轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,Elf-1基因定位于 13號染色體 13q13,主要表達(dá)于造血細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等,調(diào)節(jié)誘導(dǎo)多種基因的表達(dá),包括CD4、G M-CSF和 TCRζ等。Elf-1蛋白為一種與細(xì)胞增殖相關(guān)的核蛋白,在 T細(xì)胞核中結(jié)合于 TCRζ基因的啟動子并激活啟動轉(zhuǎn)錄,是 T淋巴細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子[8]。TCRζ是 TCR-CD3復(fù)合物中最重要的成員,在細(xì)胞內(nèi)外信號傳遞以及 T細(xì)胞的活化增殖中扮演著舉足輕重的地位。研究表明,TCRζ鏈表達(dá)缺失或下調(diào)不僅影響 TCR在細(xì)胞表面的表達(dá),還導(dǎo)致 T細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常及免疫細(xì)胞功能障礙[9]。而 TCRζ鏈的正常表達(dá)非常依賴于 Elf-1的調(diào)節(jié),在TCRζ基因啟動子上有兩個特異性的 Elf-1結(jié)合位點 zEBS1和 zEBS2,其中 zEBS1是所有 Elf-1結(jié)合位點中親和力最高的,Elf-1與之結(jié)合后激活啟動TCRζ基因的轉(zhuǎn)錄[8]。由于 Elf-1異常而導(dǎo)致 TCRζ基因表達(dá)下調(diào)在 SLE及口腔癌中均有報道[10,11]。

我們前期研究比較系統(tǒng)地分析了臍帶血 T細(xì)胞的標(biāo)型、TCR基因家族分布和相關(guān)基因表達(dá)情況,并發(fā)現(xiàn) CB CD4+和 CD8+T細(xì)胞的 TCRζ基因表達(dá)量均明顯高于健康成人等特點[3-5]。本研究進(jìn)一步分析了這些臍帶血 T細(xì)胞樣本中 Elf-1基因的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn):在臍帶血單個核細(xì)胞水平上檢測顯示Elf-1 mRNA表達(dá)水平明顯高于健康成人對照組,進(jìn)一步分析分選的 CD4+和 CD8+T細(xì)胞中 Elf-1 mRNA表達(dá)水平則顯示,在 CB CD8+T細(xì)胞中,Elf-1基因的表達(dá)水平同樣高于健康成人對照組,但 CB CD4+T細(xì)胞 Elf-1 mRNA的表達(dá)水平雖然略高于健康成人對照組,但無顯著差異。本研究初步的結(jié)果提示 Elf-1基因在臍帶血 T細(xì)胞表達(dá)水平與成人外周血 T細(xì)胞中的一些差異和特點,整體結(jié)果顯示 Elf -1基因在 CB中高表達(dá)特點,而在 CD4+T細(xì)胞中表達(dá)水平比較接近正常人,可能是其一個特點,提示CD8+T細(xì)胞和 CD4+T細(xì)胞中在 TCR信號通路分子表達(dá)上可能存在一些差異,由于不同亞群 T細(xì)胞在移植免疫中所發(fā)揮作用有明顯的不同,與移植排斥和移植物抗宿主病等密切相關(guān),因此,對于 CB中 T細(xì)胞相關(guān)信號通路基因等系統(tǒng)的分析對于深入了解CB T細(xì)胞特點是十分必要的。

總之,本實驗率先對臍帶血中 Elf-1 mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行初步研究,結(jié)果提示臍帶血中 Elf-1 mRNA的高表達(dá)也許是 TCRζ基因高表達(dá)的重要因素。但由于 Elf-1 mRNA的表達(dá)產(chǎn)物要經(jīng)過 PKC-θ進(jìn)行翻譯后磷酸化及糖基化修飾才能成為有活性的TCRζ轉(zhuǎn)錄因子,因此后續(xù)有必要對 Elf-1及 PKC-θ作進(jìn)一步研究,才能提供更詳盡的實驗數(shù)據(jù)。

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