王 珺,邢培清,方建華,溫 濤,劉玉振

(河南省紅十字血液中心 河南鄭州 450012)

血站檢測標本量大,手工加樣客觀上存在人為誤差,因此,血液檢測工作的標準化、規(guī)范化、自動化始終是血站追求的目標。為此,我中心先后購進STAR全自動加樣器及FAME全自動酶免分析儀器各2臺,針對STAR全自動加樣儀器和FAME全自動酶免分析儀器采用正交試驗設(shè)計的方法,優(yōu)化最佳試驗參數(shù),建立了具有我國特點的HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP四項免疫自動化檢測系統(tǒng),不僅實現(xiàn)了試劑國產(chǎn)化,而且提高了血站檢驗的整體檢測水平。報告如下。

1 材料與方法

1.1 檢測對象 鄭州市無償獻血者所捐獻的血液。

1.2 儀器試劑 STAR全自動加樣器和FAME全自動酶免分析系統(tǒng)(瑞士Hamilton公司);HBsAg和抗-HCV EIA試劑盒(北京萬泰和上?？迫A公司);抗-HIV EIA試劑盒(荷蘭梅里埃和北京萬泰公司);抗-TP EIA診斷試劑盒(北京吉比愛);340RT和HTⅢ酶標儀(奧地利Anthos公司);一次性針頭(北京奧斯邦公司)。

1.3 方法 初檢:STAR加樣器采用一次性加樣針頭加樣,加抗-HIV(伯樂)、HBsAg和抗-HCV(萬泰),在340RT酶標儀上讀板。復(fù)檢:STAR加樣器采用鋼針加樣針頭加樣,加抗-TP(吉比愛)、抗-HIV(萬泰)、抗-HCV和HBsAg(科華),在HT3酶標儀上讀板。STAR鋼針有3組針循環(huán)沖洗使用(每組8個針),加抗-HCV稀釋液和HBsAg酶是第1組針,加抗-TP工作液是第2組針,加樣按 2、3、1組進行輪換提針,加完 4項陰陽對照需1、2、3組提針,加樣順序為:TP→HIV→HCV→HBV。如果有拖帶污染:重新取小瓣進行復(fù)查確認。

2 結(jié)果

2.1 STAR加樣分配液體參數(shù)的選擇

2.1.1 確定STAR吸粘稠的液體參數(shù):當用STAR全自動加樣器采用常規(guī)的液體模式加高粘稠度的稀釋液時,加樣鋼針在分配液體過程中往下掉液體,為此,對常規(guī)的液體模式進行研究,優(yōu)選出新的吸液分配液體模式,該模式可克服上述不足。見表 1。

2.1.2 STAR在血樣品分配過程中出現(xiàn)針尖掛液體的解決結(jié)果:將“分配”圖標拖到吸液命令下面的位置中,彈出對話框(見圖1)。選擇“ML_STAR”作為分配到目標板的序列。為通道選擇及序列方式選擇與吸液的設(shè)置。輸入體積的量(Volume),選擇分配模式“噴射排空”。將圖1中的“Fix height from bottom”數(shù)字6按抗-TP、抗-HIV、抗-HCV、HBsAg依次改為2、4、4、2 mm。然后單擊圖2中“Advanced”,出現(xiàn)圖2的對話框。將圖2中的“Liquid following during dispense”中的“on”改為“off”。

表1 STAR加梅里?？?HIV稀釋液的液體參數(shù)選擇

2.2 STAR再檢雙孔標本的實驗編程

2.2.1 樣本的排布:STAR的樣本架是條形架,每架可排布 32個樣本,按照順序先排布日常樣本,再排布再檢樣本。

2.2.2 Excel工作表的編輯:對于再檢樣本,需要編輯Excel工作表,通過Excel工作表對再檢樣本進行編號,并編輯再檢樣本的再檢項目及所需的體積,見圖3。A列為再檢樣本的序號,B列、C列、D列和 E列下為再檢項目,其中“1”表示需要再檢,“0”表示不需要再檢,F列和 G列表示樣本的體積,其中F2輸入公式“=B2*50+C2*50+D2*10+E2*50”,采用相對引用的方式復(fù)制該公式至 F列其他單元格。G2輸入公式“=F2*2”,采用相對引用的方式復(fù)制該公式至G列其他單元格。如第 1個樣本需要再檢的項目是抗-HIV,需要樣本的體積單孔為50μl,雙孔為100μl;第2個樣本需要再檢的項目是抗-TP,需要樣本的體積單孔為50μl,雙孔為 100μl;第 7個樣本需要再檢的項目是抗-HIV和抗-HCV,需要樣本的體積單孔為60 μl,雙孔為120μl。

2.2.3 各項再檢樣品數(shù)量的讀取:儀器操作軟件自動打開再檢Excel工作表,讀取各個項目,組成字符串。依次讀取抗-HIV、HBsAg、抗-TP、抗-HCV的再檢樣本數(shù),并計算各個項目要做樣本的總數(shù)(包括正常樣品數(shù)和再檢樣品數(shù)),依此決定稀釋液和酶的分配孔數(shù)。2.2.4 再檢樣本的起始終止位及在酶標板上位置定位:“number”為正常樣品的個數(shù),“number_all”為正常樣品和再檢樣品的總數(shù)。樣品的起始位為 132,終止位為 133。正常樣本數(shù)有單數(shù)和雙數(shù) 2種情況,那么再檢樣本的在酶標板定位就不同,1個mediate1,1個mediate2。

2.2.5 再檢樣品的雙孔分配:首先通過Excel工作表讀取再檢樣本的體積,將液體分配到兩個序列中。以抗-HIV為例,8個通道依次讀取再檢樣本,確定分配體積,然后從再檢樣本序列ML_STAR samples_zj中吸取樣品,并將樣品分配到酶標板ML_STAR Target_HIV _sample_zj_S和MLSTAR TargetHIV samplezj_D再檢序列中。見圖 4。

2.3 STAR不等距離分配陰陽對照品的實驗編程

2.3.1 陰性、陽性對照及質(zhì)控品在試管架上的分布:在工作臺面上添加器件car32_cup12×100.rck,按照微板設(shè)定的陰性、陽性對照及質(zhì)控品的順序在試管架上排布各陰性、陽性對照及質(zhì)控品。

2.3.2 編輯序列:在序列編輯器中,對照品條架上建立序列Nc_Pc_strip(包含對照品條架HBsAg、抗-HCV、抗-TP的陰性及陽性對照)、序列Qc_Pc1_Pc2_strip(包含對照品條架HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP的質(zhì)控對照及的抗-HIV陽性對照1和陽性對照2),同樣在微孔板載架建立序列Nc_Pc_plate_1(包含HBsAg、抗-HCV、抗-TP的微孔板上的陰性及陽性對照的 1個孔)、Nc_Pc_plate_2(包含HBsAg、抗-HCV、抗-TP的微孔板上的陰性及陽性對照的另1個孔)、Qc_Pc1_Pc2_ plate(包含HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP微孔板上的質(zhì)控對照及抗-HIV的陽性對照1和陽性對照2)。

2.3.3 編輯方法:在方法編輯器中,吸取序列Nc_Pc_ strip的樣品對序列Nc_Pc_plate_1和Nc_Pc_plate_2進行分配。吸取序列Qc_Pc1_Pc2_strip的樣品對序列Qc_Pc1_Pc2_p late進行分配。

2.4 STAR液體校正曲線數(shù)據(jù)的設(shè)置 校正量通常由重量分析來決定的。因此,105μl的校正量并不意味著會分配 105μl的液體。當加樣尖被排空時,分配量為 100μl。校正主要是通過調(diào)整液體上方的 1段空氣柱。優(yōu)化后Sample校正曲線的數(shù)值10μl修改為16μl,20～750μl上調(diào)30%;1 000μl不變。

2.5 FAME洗板模式的選擇 洗滌效果不好或出現(xiàn)花板,應(yīng)重新測量微板的尺寸(表 2)后進行修改,如果洗板效果還不好,將“底部掃洗”、“底部洗板”和“連續(xù)洗滌”部分或全部選上。同時將“洗液動力”、“注液動力”、“注液時的洗液動力”均選中或選高。吸液高度調(diào)整為0.1mm。

表2 國產(chǎn)與進口微孔板的尺寸(mm)

2.6 縮短FAME24/20若干操作時間表的方法探討

2.6.1 進板順序和板間隔時間對操作時間的影響: HBV、HCV、HIV有6種進板排列組合模式,例如: HCV、HIV、HBV組合表示依次進入FAME的順序,然后按此順序交替進 12板,以下類同。進板時間間隔指的是:在編程序時,每板之間的時間間隔,本試驗僅對第 4板時間間隔進行選擇,其余每板之間時間間隔設(shè)置均為0min。每種進板組合,不同的進板順序和板與板的間隔時間對總的操作時間的影響。結(jié)果顯示,12板按HIV、HCV、HBV交替進板,進板時間間隔為5 min下的“新時間”以及10 min下的“原時間”,總的處理時間最短,同時兩者時間相差 7(155～148)min。最后1架按HBV、HIV、HCV順序進板,總的處理時間最短,時間又提前10(148～138)min。

2.6.2 洗板及所加的試劑指定位置的選擇:試劑位置的指定原則是:洗板后在同一位置接著加酶或顯色劑,因此,洗板單元和酶以及顯色劑應(yīng)在同一單元中,當顯色劑是A和 B液時,由于 A和B顯色劑是連續(xù)分配, FAME軟件不允許在同一單元連續(xù)進行,因此,顯色劑A和 B不能放在同一單元中,遵照這種規(guī)律,本試驗的試劑存放有以下幾種組合。見表 3。

表3 洗板及所加的試劑指定的最佳位置選擇結(jié)果

2.6.3 洗板次數(shù)與洗板浸泡時間對結(jié)果的影響:3項免疫試驗同時改變洗板次數(shù)為 4、5、6遍,總的處理時間依次為162、138、166min,因此,選擇洗滌5遍,總的處理時間最短。20 s的浸泡時間各種情況下總的處理時間最短。

2.6.4 優(yōu)化前后FAME處理時間表對比:見圖5、圖6。由兩個圖可知,圖 6進板排列比圖 5比較緊湊,12板完成的時間圖 6比圖 5處理速度快。

圖5 優(yōu)化前FAME處理時間表

2.7 STAR加樣器拖帶污染 解決加抗-HCV稀釋液以及加HBsAg酶引起整排污染措施見表4。

圖6 優(yōu)化后FAME處理時間表

2.8 檢驗標本交接及檢驗結(jié)果讀取路徑

師德是教師的靈魂，是教師的生命。高等藝術(shù)院校培養(yǎng)的是未來的文藝工作者，是社會精神產(chǎn)品的生產(chǎn)者和精神文明的傳播者，教師的師德直接影響大學(xué)生世界觀、人生觀、價值觀和藝術(shù)觀的塑造和形成，加強藝術(shù)院校師德師風(fēng)建設(shè)有著特殊的重要意義和深遠影響。而作為教師中的佼佼者，名師比普通教師的示范性、榜樣性更強，對學(xué)生品德養(yǎng)成影響也更大。因此，名師的評選與培育必須堅持“德才兼?zhèn)?，以德為先”?/p>

2.8.1 標本接受:所有加樣儀器形成條碼均存在barcodes中,然后將其共享,當儀器讀取加樣條碼時從其讀取,比如樣本交接和讀板時讀取條碼(barcodes眏射盤W、S、T、K)。

表4 解決加抗-HCV稀釋液以及加HBsAg酶整排污染措施

2.8.2 結(jié)果存放:澳斯邦讀板軟件讀板結(jié)果存放在Sam_results中,然后將其共享;UNC酶標讀板軟件結(jié)果存放在Sunrise中,然后將其共享;TECAN(BEP)讀板軟件結(jié)果存放在temp中,然后將其共享;伽利略軟件讀板結(jié)果存放在galileo中.檢驗管理接受結(jié)果時從中讀取(眏射盤G、I、H、K、X),見表5。

表5 樣本交接和檢驗結(jié)果的讀取路徑映射盤總結(jié)

2.8.3 FAME結(jié)果輸出路徑:在維護欄打開設(shè)備預(yù)置,在設(shè)備設(shè)置欄打開設(shè)備,新建,加樣設(shè)備,然后在加樣設(shè)備名稱中輸入Test sameple,在條碼路徑中輸入J:BARCODES保存。定義FAME結(jié)果發(fā)送。進入OS/2全屏幕系統(tǒng),輸入[c:]e c:famehostcmdsavefile.Cmd,按回車鍵,輸入如下:COPY∪%1%2∪J: FAMERESULTS*.TXT;FAM_RTC%2∪0;EXIT (∪為空格)。

2.9 自制血液篩查的標本轉(zhuǎn)移架 96孔試管架圖紙見圖 7。架子形狀為長方體,長、寬、高分別為 300 mm、200mm、50mm,上下共3層板,均由亞克力板制作,其中上層和中層開等距離 96孔,每孔直徑為 15 mm,孔與孔之間的距離為6mm,橫排開 12孔并刻上1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的編號,豎排開 8孔并刻上A、B、C、D、E、F、G、H的字母,底層不開孔。通過磨邊、拋光等多道工序進行加工,亞克力板連接部分用進口無影膠粘合,使用 9條不銹鋼限位螺栓穿過上中下 3個平面進行固定。96孔試管架實物圖見圖 8。

2.10 應(yīng)用效果

2.1 0.1 準確度試驗:采用本研究的方法對 2006、2007、2008年衛(wèi)生部臨檢中心發(fā)放的HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP系列質(zhì)控物進行檢驗,本室測定的結(jié)果與臨檢中心的靶值符合率為 100%,這說明使用全自動檢驗既沒漏檢,也沒出現(xiàn)假陽性,特異性和靈敏度均達到了要求。

3 討論

粘稠的液體分配問題。當用STAR全自動加樣器采用常規(guī)的液體模式加高粘稠度的稀釋液時,加樣鋼針在分配液體過程中往下掉液體。解決此問題,首先將粘稠的液體從冰箱拿出后室溫平衡 2 h,以降低液體的粘稠度,然后對液體的參數(shù)進行修改,修改的關(guān)鍵參數(shù)是分配液體的速度、分配傳輸空氣體積、吹吸空氣體積。若分配液體的速度小于200μl/s,可造成分配的液體呈滴不成線,導(dǎo)致針頭易掛液滴,若分配速度大于400μl/s,雖分配的液體成線,但由于慣性的作用導(dǎo)致往下掉液滴,因此,需選合適的分配的速度(300μl/ s),當分配速度選擇后,針頭仍掛少許液滴,此時可設(shè)置適量的分配傳輸空氣體積,在分配步驟每次結(jié)束后,再吸取1段空氣(15μl)、基本將針頭的液滴收回。吹吸空氣體積可設(shè)置為0μl,因STAR加樣針在活塞和液體表面之間有 1段固定的空氣間隔,避免了活塞接觸液體可能造成的標本污染,若吹吸空氣體積再增加,活塞和液體之間的空氣間隔過大,針內(nèi)的液體由于重力的作用易導(dǎo)致部分液體逸出。在液體編輯器中設(shè)置了前舍后棄的功能,舍去前部液體體積為 50μl,棄掉后部液體體積為 30μl,因此,吸液時的傳輸空氣體積和預(yù)濕體積再設(shè)置已沒什么意義[1]。

針尖掛液體問題。解決STAR分配血樣品針尖掛液體的關(guān)鍵點是,分配血樣品時針尖在離開微板的一瞬間,血樣品既要接觸微孔底部(或微板內(nèi)的稀釋液)又要接觸針頭,血樣品與底部接觸面積大于針尖,有利于增加其黏附力,將血樣品留在微孔內(nèi),針尖不會掛液體,因此,需要定位加樣尖位置,使其距微孔的底部適當位置,當針尖距微孔底部小于 1 mm或大于6 mm,均出現(xiàn)掛液體。50、100μl液體在微孔底部形成的高度依次為2、4 mm,因此,當向空微板孔內(nèi)加血樣品量依次為 50、100μl時,針尖距微孔底部的高度調(diào)整為2、4mm,而抗-HCV由于預(yù)先加有100μl的稀釋液,雖然加樣量為 10μl,針尖距微孔底部的高度也調(diào)整為 4 mm。將分配過程中液面跟隨設(shè)置由開(on)改為關(guān)(off),更有利于血樣品同時與針頭和微孔底部接觸的要求。為使分配后的血樣品無氣泡產(chǎn)生,在液體編輯時,傳輸空氣體積均設(shè)為0μl,吹吸空氣體積設(shè)置為20μl。調(diào)整高度以STAR微板載架上平面為參考位置,不同的微板孔底的厚度以及孔直徑大小不同,針尖離孔底的距離需根據(jù)實際進行調(diào)整[2]。

雙孔分配再檢標本問題。在Excel工作表中對再檢樣本信息進行編輯,并通過儀器軟件的自動讀取,解決了手工操作存在的問題。編輯此程序需要計算機C++語言,主要用到的語句有文件的打開、設(shè)置、讀取、關(guān)閉語句,循環(huán)、條件、序列語句,追蹤語句等。難點在于再檢樣本位置的確定及序列編輯[3]。

不等距離陰陽對照加樣問題。通過改進,實現(xiàn)了加樣針不等距離吸入和分配不同量的液體,可使儀器各加樣針得到充分利用,解決了加樣針單針分配及多針分配必須吸入和分配相同量的液體的缺點,提高工作效率。該法的關(guān)鍵是序列的編輯,序列定義了工作平臺上容器架中容器的加樣順序[4]。

STAR鋼針拖帶污染問題。由于目前全自動加樣器采用的是可反復(fù)使用的鋼針,作為加樣針頭,雖然針頭內(nèi)外涂有鈦氟隆可減少殘存樣品量,同時加完樣品后進行沖洗針頭,但殘留的樣品量不是零,殘留的樣品量STAR小于10-6,一般情況下大多數(shù)樣品還是能避免上下孔之間的污染,但若遇到含高濃度抗原、抗體的標本,這種污染是存在的。減少拖帶污染的一般方法。對STAR鋼針沖洗模式進行調(diào)整,適當增加沖洗速度以及沖洗、浸泡和排干時間,但增加的太多會延長整個加樣時間;調(diào)整STAR前舍后棄參數(shù),加樣標本的后棄量由原來的20μl改為5μl,這樣可使殘留在加樣鋼針中的標本量在洗滌前降到最低水平;對加樣鋼針針頭進行周維護用 50℃的熱水沖洗[5]。

加酶引起HBsAg拖帶污染問題。STAR連續(xù)分配液體采用聰明步驟,表面部分分配。向酶標板中進行表面分配時,需定義加樣尖的高度,默認的高度是 2 mm,通過液面感應(yīng),加樣過程中加樣尖隨液面的上升而上升。但分配HBsAg酶結(jié)合物時,連續(xù)加酶過程中針外壁接觸到強陽性標本導(dǎo)致后邊整排污染,解決辦法,改變分配參數(shù),將STAR加酶加樣針尖距板底的高度由原來的2 mm改為13 mm,同時取消液面感應(yīng)。

加稀釋液引起抗-HCV整排污染問題?？?HCV出現(xiàn)整排污染的原因是,前 1次加樣鋼針被污染后,繼續(xù)加下1板抗-HCV的稀釋液,該鋼針內(nèi)殘留的陽性標本污染了稀釋液導(dǎo)致整排污染。解決辦法,改變加樣順序,加抗-HCV的稀釋液是第1組針,因此,在加稀釋液前至少將 1組針有意安排多沖洗幾次。編程:整板加完的樣品后沖洗(1次),1、2、3組加所有的陰陽對照后沖洗(2次),1組針安排加HBsAg的酶后沖洗(3次),然后1組加下1板抗-HCV(科華)質(zhì)控提取1根針加稀釋液后沖洗(4次),2組加抗-TP工作液,1組加抗-HCV樣品稀釋液,然后按 2、3、1組提針開始加樣,通過 4次的沖洗,鋼針內(nèi)污染的強陽性標本基本沖洗干凈,大大降低了上 1板針內(nèi)樣品污染下 1板的整排問題。

縮短FAME總處理時間的問題。影響FAME總的處理時間的因素有:進板的順序;板與板之間的時間間隔的設(shè)置;試劑及洗滌液的指定位置;洗板次數(shù)及洗板浸泡時間;不同廠家試劑不同項目的孵育時間;前處理的加樣順序和速度以及后處理開始進板的時間等。FAME具有2個洗板單元和3個試劑分配單元,采用2.2的版本,在單板進板模式下,如果給予適當?shù)倪M板順序,4架進板順序為,前3架按HIV、HCV、HBV順序交替進板,最后1架進板順序按HBV、HIV、HCV進板,板與板之間的時間間隔,除第 4塊板的時間設(shè)定為5 min,其余均設(shè)定為0 m in,FAME總的處理時間最短,可見,合理安排板架裝載順序及時間間隔至關(guān)重要。由于FAME儀器洗板浸泡時間最低設(shè)定標準為20 s,所以如果試劑洗板浸泡時間低于20 s,FAME儀器無法設(shè)定,如果試劑洗板浸泡時間過長,儀器總的處理時間又太長,因此,建議國內(nèi)試劑廠家和國外的儀器使用功能上要相匹配,使儀器的使用性能得到最大的發(fā)揮。加顯色劑時先加 A液,接著再加 B液,由于連續(xù)的兩個試劑步驟在FAME編程時通不過,因此,在加A液和 B液這兩個試劑分配步驟之間必須增加 1個最低的5 s振蕩步驟,同時顯色劑A和B不能放在同 1單元中,顯色劑及試劑放置位置一般是將酶、顯色劑 A液指定到與其洗液所在洗板單元相對應(yīng)的分配單元,將顯色劑 B液和終止液指定到終止分配單元,這樣,洗板后儀器可以在同一位置加液,節(jié)省時間。由于萬泰的抗-HIV和科華的抗-HCV,反應(yīng)步驟類似,因此,兩者各占據(jù)1個洗站,由于抗-HIV顯色步驟比抗-HCV反應(yīng)時間多5min,因此HBsAg的洗板放在洗站1。經(jīng)過調(diào)整,使FAME能夠同時處理 2種或 3種過程,1板接 1板不停地工作,總的處理時間縮短了 53 min,大大提高了FAME的工作效率,同時又保證了結(jié)果的準確性[7]。

自制 96孔試管架。由于 96孔試管架比常見的試管架大,易變形,因此,在架子上增加了 9條不銹鋼限位螺栓使試管架更加穩(wěn)定牢固。96孔試管架不僅提高了陰陽性標本的挑出時間,而且便于板架之間的標本轉(zhuǎn)移。

[1] 李偉華,劉玉振,方建華,等.優(yōu)化全自動儀器加樣效果參數(shù)設(shè)置探討[J].《中國輸血雜志》,2005,18(6):482-483.

[2] 袁舉,劉玉振,溫濤.對STAR在血樣本分配過程中針尖掛液現(xiàn)象的解決辦法[J].《中國輸血雜志》,2006,19(4):298-299.

[3] 方建華,溫濤,楊丙辛.STAR全自動加樣器雙孔分配再檢標本的探討[J].《中國誤診學(xué)雜志》,2006,6(12):2277-2278.

[4] 溫濤,方建華,劉玉振.全自動加樣器STAR加樣編程的優(yōu)化[J].《中國輸血雜志》,2007,20(2):135-136.

[5] 楊丙辛,劉玉振,方建華.STAR全自動加樣儀引起抗-HIV血樣污染的分析[J].《中國誤診學(xué)雜志》,2005,5(8):1449.

[6] 馬宏偉,溫濤,謝輝.STAR全自動加樣器加酶引起HBsAg拖帶陽性分析[J].《中國誤診學(xué)雜志》,2007,7(8):1719-1720.

[7] 邢培清,劉玉振,方建華.縮短FAME 24/20操作時間的方法探討.《中國輸血雜志》[J].2006年,19(增刊):65-66.