程道博,何巧玉,汲振余,趙立群*

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 河南 鄭州 450052;2.鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院 河南 鄭州450052)

食管癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,其病死率占我國(guó)惡性腫瘤的第4位[1]。目前手術(shù)是治療食管癌的首選方法,而分化狀態(tài)對(duì)食管癌的發(fā)生發(fā)展及術(shù)后效果等有重大影響。Survivin是新近發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制蛋白,在眾多惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)[2,3],它選擇性的表達(dá)在多種腫瘤組織中,但在成人分化組織中并無(wú)表達(dá)。Survivin在國(guó)外研究較早,近幾年國(guó)內(nèi)也逐漸開始了其在各種腫瘤細(xì)胞中的研究,但同時(shí)在腫瘤組織細(xì)胞和體外細(xì)胞中檢測(cè)survivin蛋白的研究尚未見報(bào)道。本研究擬檢測(cè)survivin在食管鱗癌中的表達(dá)、分化程度在組織和細(xì)胞中的表達(dá)是否一致,以提供生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和可能的生物學(xué)理論為研究分化狀態(tài)對(duì)光動(dòng)力學(xué)療法(Photo dynamic therapy,PDT)治療食管癌的影響提供一定的實(shí)驗(yàn)支持。

1 資料與方法

1.1 免疫組織化學(xué)

1.1.1 臨床資料:收集河南省腫瘤醫(yī)院2008年 5～7月手術(shù)切除的 40例食管癌患者標(biāo)本,均經(jīng)病理檢查證實(shí)為鱗狀細(xì)胞癌?；颊吣?26例,女 14例,年齡 48～80(62.18+8.77)歲。分化程度為高分化 14例,中分化 10例,低分化 16例;浸潤(rùn)深度為粘膜下層或淺肌層(淺層)12例,深肌層或外膜(深層)28例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 11例,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 29例?；颊咝g(shù)前均未經(jīng)過化療。

1.1.2 方法:免疫組化SP法染色,免疫組化試劑盒、濃縮型DAB工作液、兔抗人survivin多克隆抗體均購(gòu)自北京中杉金橋生物公司,工作液濃度分別為 1∶150。按試劑盒說明書嚴(yán)格操作,用已知陽(yáng)性切片做陽(yáng)性對(duì)照,用PBS液代替一抗做陰性對(duì)照。

1.2 免疫細(xì)胞化學(xué)

1.2.1 主要材料與設(shè)備:KYSE-450細(xì)胞,KYSE-70細(xì)胞,Het-1A細(xì)胞(美國(guó)ATCC).RPMI1640培養(yǎng)液,胎牛血清(杭州四季青公司),胰蛋白酶-EDTA液(美國(guó)sc公司)免疫組化試劑盒、濃縮型DAB工作液、兔抗人survivin多克隆抗體(北京中杉金橋生物公司),37度CO2溫箱(上海一實(shí)),倒置顯微鏡(Olympus IM型,Japan)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng):3種細(xì)胞培養(yǎng)于含 10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)液中,每周細(xì)胞達(dá)約80%匯合時(shí)傳代培養(yǎng) 2～3代,使其保持對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)各細(xì)胞系貼壁生長(zhǎng)正常形態(tài)。

1.2.3 細(xì)胞處理:將培養(yǎng)瓶中80%融合的KYSE-450細(xì)胞KYSE-70細(xì)胞,Het-1A細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后,接種于 6孔培養(yǎng)板中,以下按試劑盒說明書嚴(yán)格操作。

1.3 結(jié)果判定 survivin基因的表達(dá)產(chǎn)物定位于細(xì)胞漿,胞漿呈棕黃色者則認(rèn)為是陽(yáng)性細(xì)胞。每張組織切片(每組細(xì)胞)隨機(jī)選擇 5個(gè)高倍視野,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%為陰性“-”,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞5%為陽(yáng)性“+”。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,根據(jù)資料類型統(tǒng)計(jì)方法采用 χ2檢驗(yàn)和直線相關(guān)回歸分析。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 不同分化組織中survivin陽(yáng)性表達(dá)情況

表2 各細(xì)胞系中survivin陽(yáng)性表達(dá)情況

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌組織及癌周正常組織survivin蛋白的表達(dá) 食管鱗癌及癌周正常組織survivin蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)的患者分別為29(72.5%)、1例(5.0%)。兩者survivin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。

2.2 各細(xì)胞系細(xì)胞中survivin蛋白的表達(dá) KRSE-70細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率為 85%,KYSE-450細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率為65%,Het-1A細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率為5%。3系不同分化狀態(tài)的細(xì)胞survivin陽(yáng)性表達(dá)率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。

2.3 免疫組化和免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定的survivin表達(dá)相關(guān)性 兩種方法測(cè)得的survivin陽(yáng)性表達(dá)率呈正相關(guān)(r=0.263,P＜0.05).

3 討論

Suvrvin蛋白是IAP家族中結(jié)構(gòu)獨(dú)特的新成員, 1995年,Atlier[4]利用效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體l(Effector cell Protease Receaptor-1,EPR-1)cDNA在人基因組庫(kù)中篩選克隆出suvrivin基因,基因全長(zhǎng)14.7 kb,位于17q25。研究表明[5],suvrivin與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)子cDK4結(jié)合,導(dǎo)致CDKZC/ychEn活化并使Rb磷酸化。Survivin在多種轉(zhuǎn)化細(xì)胞株和人體內(nèi)幾乎所有的惡性腫瘤中都有明顯表達(dá)[6].而在正常成人組織中,除了胎盤和胸腺微弱表達(dá)外,其他組織基本很難檢測(cè)到 survivin的表達(dá)[7].因此,survivin可能與腫瘤細(xì)胞的分化有關(guān)系,因此研究其相關(guān)性可能為食管癌的早期發(fā)現(xiàn)提供生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)論據(jù)。特別是在誘導(dǎo)分化治療中可能有較重要的應(yīng)用前景。

研究結(jié)果顯示,食管鱗癌分化程度越低,survivin抗原表達(dá)越高,分化程度越高,其抗原表達(dá)越低。提示了survivin的表達(dá)與食管鱗癌的分化與侵襲有關(guān),可能機(jī)制是凋亡抑制因子survivin抑制了食管癌細(xì)胞的凋亡過程,使其凋亡失控,從而使分化受阻。

目前多項(xiàng)研究表明了在多種腫瘤中survivin蛋白的高表達(dá)[8]。既往研究中對(duì)survivin與分化的關(guān)系結(jié)論尚不統(tǒng)一,本實(shí)驗(yàn)顯示了其高表達(dá)與低分化的相關(guān)性,從而為治療方案的選擇提供了依據(jù)。本課題組所進(jìn)行的分化狀態(tài)對(duì)PDT治療食管癌的影響中,檢測(cè)細(xì)胞中survivin蛋白表達(dá)的高低可以作為誘導(dǎo)分化成功與否的標(biāo)志。survivin蛋白與食管癌分化狀態(tài)的關(guān)聯(lián)性提示以其為腫瘤治療的靶點(diǎn),可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分化,提高臨床治療效果。

[1] 路平,李榮,梁秋冬,等.中藥對(duì)食管癌術(shù)后患者生活質(zhì)量和免疫功能的影響[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2006,23(2):1212.

[2] Li F,Brattain MG.Role of the survivin gene in pathophysiology[J]. Am JPathol,2OO6,169(1):1-11.

[3] 都昌胡,徐軍.凋亡蛋白抑制劑家族研究進(jìn)展[J].世界華人消化雜志,2O05,13:1581-1589.

[4] Ambosini G,Adida C,Altieti DC,et al.A novelanti-apoptosisgene, survivin,expressed in canser and lymphoma[J].Nat Med,1997,3 (8):917-921.

[5] Suzuki A,Ito T,Kawamo H,et al.Survivin initiates procaspase 3/ P21 complex formation as a result of interaction with CDK 4 to resist Fasmediated cell death[J].Oncogene,2000,19(10):1346-1353.

[6] Rohayem J,Diestekoetter P,Weigle B,et al.Antiboby response to the tumor associated inhabitor of apoptosis protein survivin in cancer patients[J].Cancer Res,2000,60(7):1815-1817.

[7] Ambrosini G,Adida C,Altieti DC,etal.AnovelantiaPoPtosisgene,survivin,expressedineaneerandlymphoma[J].Nat Med,1997,3(8): 917-921.

[8] 程道博,郭歡,汲振余,等.Survivin和ki-67在食管鱗癌組織中的表達(dá)及意義[J].山東醫(yī)藥,2009,39(3):11-13.