李 丹，王 貝，林奕婷，靳 冉，劉志文，劉選明

（湖南大學(xué)生物學(xué)院，生物能源與材料研究中心，湖南長沙 410082）

脫氧核酶（DNAzyme，DRz）是一種能特異性結(jié)合并切割靶RNA分子的酶性DNA，具有高效的催化降解能力和反義靶向識(shí)別能力［1］，被廣泛用于腫瘤、遺傳病等疾病的研究.脫氧核酶作為一種新型的靶基因沉默手段，其最主要的問題之一是如何有效地進(jìn)入靶細(xì)胞.因此，尋找一種相容性好、在生物體內(nèi)能夠穩(wěn)定遞送基因的材料在基因治療中具有廣泛應(yīng)用的價(jià)值和意義.

作為殼聚糖的降解產(chǎn)物，殼寡糖（oligochitosan，COS）無毒、無副作用，具有生物粘附性、生物相容性和可降解性［2］.研究顯示，COS能保護(hù)DNA免于被DNase I降解，證明了COS應(yīng)用于基因載體的可行性與安全性［3］.同殼聚糖這種生物大分子相比，COS還具有許多獨(dú)特的功能性質(zhì)，如水溶性、抗菌性、抗腫瘤和免疫促進(jìn)性等［4］.基于殼寡糖的納米藥物／基因遞送系統(tǒng)已成為藥物／基因治療研究的熱點(diǎn)之一.

EGFR是表皮生長因子受體（HER）家族成員之一，在多種腫瘤組織中有高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和生物學(xué)行為密切相關(guān)，被認(rèn)為是腫瘤基因治療的潛在理想靶點(diǎn)［5］.基于此，本文以COS為遞送載體，以靶向EGFR的脫氧核酶為研究對(duì)象，建立了一種有效的納米基因細(xì)胞內(nèi)傳遞體系，并探討其介導(dǎo)的脫氧核酶在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)效應(yīng).

1 材料與方法

1.1 材料

Hela細(xì)胞（ATCC－CCL－2）在10%小牛血清（Gibco BRL公司）的RPMI 1640培養(yǎng)基（賽莫飛世爾公司）中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng).總RNA提取試劑TRIZOL和Taq酶等購自Invitrogen；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自安比奧.

1.2 EGFR脫氧核酶的設(shè)計(jì)與合成

由NCBI的GenBank獲取EGFR cDNA保守序列，按照文獻(xiàn)［6］方法進(jìn)行靶向EGFR的脫氧核酶的設(shè)計(jì)和篩選，獲得序列EGFR－DRz：

上述序列由Invitrogen公司合成.其中，對(duì)序列的前后各三個(gè)堿基進(jìn)行硫代磷酸化以增強(qiáng)其穩(wěn)定性.

1.3 COS－EGFR DRz復(fù)合物的制備與表征

COS（金殼生化）用1%的醋酸洗滌，0.22μm的濾網(wǎng)過濾，凍干，用PBS（pH6.5）配制成20mg／mL的溶液，過濾滅菌［7］.在水溶液中，COS分子表面帶正電荷，EGFR DRz分子表面帶有負(fù)電荷，利用靜電吸附加以震蕩可形成COS－EGFR DRz復(fù)合物.無菌條件下在1mL 1640培養(yǎng)基中分別加入不同比例的COS溶液和EGFR DRz，置于搖床震蕩10min即可.利用Zeta電位－粒度分析儀對(duì)COSEGFR DRz復(fù)合物的大小進(jìn)行表征分析.

1.4 COS－EGFR DRz復(fù)合物的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率分析

選對(duì)數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，用含抗生素的無血清培養(yǎng)基以105個(gè)細(xì)胞／孔接種于6孔板內(nèi)培養(yǎng)過夜，分別以COS和脂質(zhì)體oligofectmineTM（Invitrogen）為遞送載體，將FITC標(biāo)記的EGFR DRz轉(zhuǎn)染細(xì)胞，24h后收集細(xì)胞，70%冷乙醇固定過夜.PBS洗2次，用流式細(xì)胞儀檢測帶熒光的細(xì)胞比例.

1.5 COS－EGFR DRz復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的分布

選對(duì)數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，按照步驟1.4進(jìn)行轉(zhuǎn)染，經(jīng)過24h培養(yǎng)，D－Hanks清洗2次，DAPI染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的分布情況.

1.6 COS－EGFR DRz復(fù)合物對(duì)EGFR mRNA的切割活性檢測

選對(duì)數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，按照步驟1.4進(jìn)行轉(zhuǎn)染.24h后提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，用半定量PCR的方法檢測轉(zhuǎn)染前后EGFR mRNA水平的變化.其中，EGFR上游引物序列為：5’－ctt gca gcg ata cag ctc aga－3’；下游引物序列為：5’－tcc tgg tag tgt ggg tct ctg c－3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為189bp.β－actin上游引物序列為：5’–tta gct gtg ctc gcg cta ctc tct c－3’，下游引物序列為：5’–gtc gga ttg atg aaa ccc aga cac a－3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為168bp.10μL反應(yīng)體系加入dNTPs，上、下游引物（20 μmol／L）各0.2μL和Taq酶（4U／μL）0.2μL.反應(yīng)條件為94℃40s，60℃30s，72℃40s，35個(gè)循環(huán)，最后1個(gè)循環(huán)72℃10min.RT－PCR產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色觀察.

1.7 COS－EGFR DRz復(fù)合物對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響

選對(duì)數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，按照步驟1.4進(jìn)行轉(zhuǎn)染.24h后70%乙醇固定過夜，PBS洗2次，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的周期分布和細(xì)胞凋亡.其中空白對(duì)照為不加任何轉(zhuǎn)染試劑的正常培養(yǎng)條件下的Hela細(xì)胞.

2 結(jié)果與討論

2.1 COS－EGFR DRz復(fù)合物表征分析

采用Zeta電位－粒度分析儀對(duì)COS－EGFR DRz復(fù)合物的穩(wěn)定性和粒徑進(jìn)行分析.如圖1所示，固定EGFR DRz的濃度為2μmol／L，當(dāng)復(fù)合物中COS的質(zhì)量濃度為0.4mg／mL時(shí)，放置24h后，其粒徑?jīng)]有發(fā)生顯著變化，相對(duì)其他配比組要穩(wěn)定，在本實(shí)驗(yàn)中我們選用此配比為最適配比.圖2顯示，脂質(zhì)體包裹的EGFR DRz復(fù)合物粒徑在240nm左右，盡管COS－EGFR DRz復(fù)合物的粒徑略大，在500nm左右，但文獻(xiàn)顯示，當(dāng)轉(zhuǎn)染復(fù)合物的粒徑在230～1 290nm范圍內(nèi)時(shí)對(duì)其轉(zhuǎn)染效率沒有影響［8］.并且，目前也并沒有證據(jù)能直接證明粒徑與轉(zhuǎn)染率之間有相關(guān)性［9］.

圖1 COS質(zhì)量濃度梯度對(duì)粒徑的影響Fig.1 The effect of COS concentration on nanoparticle size

圖2 不同載體復(fù)合物的粒徑分布圖Fig.2 The size analysis of different DRz／carrier complexes

2.2 COS－EGFR DRz復(fù)合物的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率分析

采用流式分析COS攜帶EGFR DRz進(jìn)入細(xì)胞的遞送效率.如圖3所示，空白對(duì)照只有微弱的本底熒光，COS的轉(zhuǎn)染效率為88.7%，與脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率（89.7%）非常接近.此外，當(dāng)脂質(zhì)體和COS共同轉(zhuǎn)染EGFR DRz時(shí)，其轉(zhuǎn)染效率在90%左右.結(jié)果表明COS是脫氧核酶的有效細(xì)胞內(nèi)遞送載體.

圖3 流式細(xì)胞術(shù)對(duì)不同載體轉(zhuǎn)染效率的分析Fig.3 The transfection efficiency analysis of different carriers by Flow Cytometry

2.3 COS－EGFR DRz復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的分布

采用DAPI染色實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析COS能否有效地遞送EGFR DRZ到細(xì)胞內(nèi).圖4是COS－EG－FR DRz復(fù)合物轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后的激光共聚焦結(jié)果，綠色熒光是FITC標(biāo)記的EGFR DRZ，可以看出經(jīng)殼寡糖遞送的EGFR DRz成功地進(jìn)入了細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)均有分布.并且，還可觀察到部分細(xì)胞染色質(zhì)濃縮，呈現(xiàn)濃聚的藍(lán)色熒光，提示經(jīng)EGFR DRz靶向識(shí)別的細(xì)胞發(fā)生了凋亡.

圖4 EGFR DRz在Hela細(xì)胞內(nèi)的分布（500×）Fig.4 The distribution of EGFR DRz in Hela cell（500×）

2.4 COS－EGFR DRz復(fù)合物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的切割活性分析

采用半定量RT－PCR進(jìn)一步分析COS－EGFR DRz復(fù)合物能否有效地切割靶分子.從圖5可以看出，與無EGFR mRNA切割活性的control DRz相比，經(jīng)脂質(zhì)體或COS轉(zhuǎn)染的EGFR DRz能明顯導(dǎo)致EGFR mRNA表達(dá)水平降低，再次證實(shí)經(jīng)COS遞送的EGFR DRz能夠有效地進(jìn)入Hela細(xì)胞，并實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的靶向切割活性.

圖5 COS－EGFR DRz復(fù)合物在Hela細(xì)胞內(nèi)的切割活性分析Fig.5 The cleavage activity analysis of COS－EGFR DRz complexes in Hela cell

2.5 COS－EGFR DRz復(fù)合物對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響

許多腫瘤都有EGFR的過量表達(dá)，并使其下游信號(hào)途徑異常激活，最終導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)轉(zhuǎn)化、增殖等現(xiàn)象［10］.研究顯示，采用靶向EGFR基因的藥物，能有效抑制EGFR的表達(dá)，降低腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［11－12］.如圖6所示，轉(zhuǎn)染EGFR DRz之后，G1期細(xì)胞比例均有所上升，細(xì)胞被阻滯在G0～G1期，這與EGFR基因沉默后細(xì)胞周期的表現(xiàn)一致［13］，證明細(xì)胞凋亡確實(shí)由EGFR DRz所致.結(jié)合圖7，在轉(zhuǎn)染效率相似的條件下，COS組轉(zhuǎn)染EGFR DRz的細(xì)胞凋亡率達(dá)到19.3%，高于脂質(zhì)體組的13%，進(jìn)一步證實(shí)了COS作為基因載體的有效性，也表明COS本身對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長也有一定的抑制作用.此外，當(dāng)遞送control DRz時(shí)，COS組的凋亡率2.49%，僅為脂質(zhì)體組5.97%的一半，說明COS對(duì)細(xì)胞的毒性比脂質(zhì)體更低.

圖6 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期Fig.6 Cell cycle analysis by Flow Cytometry

圖7 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡Fig.7 Cell apoptosis analysis by Flow Cytometry

3 結(jié) 論

近年來，基于可生物降解的大分子多聚體的藥物／基因遞送系統(tǒng)的研究已成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一.殼寡糖作為一種天然的可生物降解的聚合物，來源豐富，理化性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，具有多種生物學(xué)活性，已成為被廣泛關(guān)注的生物醫(yī)學(xué)材料.本文設(shè)計(jì)合成了靶向EGFR的脫氧核酶，以殼寡糖為遞送載體，轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，有效地實(shí)現(xiàn)了EGFR DRz的細(xì)胞內(nèi)遞送和對(duì)目的基因的靶向切割.與經(jīng)典轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體相比，殼寡糖不但具有與脂質(zhì)體相同的轉(zhuǎn)染效率，并由于其本身具有抗腫瘤作用，因而對(duì)細(xì)胞的毒性更低.因此，殼寡糖作為一種潛在的、有效的脫氧核酶遞送載體，不僅為基因治療提供了一種新的手段，同時(shí)其本身所具有的多種生物學(xué)特性也豐富了藥物／基因載體所發(fā)揮的作用.

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