植物乳桿菌C21胞外多糖的分離純化及其結(jié)構(gòu)修飾

李盛鈺，曾憲鵬，趙玉娟，張 雪，張 健，楊貞耐*

(吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心，吉林 長春 130033)

植物乳桿菌C21胞外多糖的分離純化及其結(jié)構(gòu)修飾

李盛鈺，曾憲鵬，趙玉娟，張 雪，張 健，楊貞耐*

(吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心，吉林 長春 130033)

為研究乳酸菌胞外多糖的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，采用乙醇沉淀、DEAE-纖維素離子交換柱層析和 Sepharose CL-6B凝膠過濾層析方法從植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) C21 SDM液體培養(yǎng)基中分離純化得到一種均一組分的胞外多糖，命名為PCPc。采用離子色譜和紅外光譜法對其單糖組成和結(jié)構(gòu)進行初步分析，結(jié)果表明，PCPc主要由半乳糖和葡萄糖兩種單糖組成，其物質(zhì)的量比為1∶2。并對PCPc多糖進行化學(xué)修飾，獲得了其硫酸化和磷酸化衍生物。

乳酸菌；植物乳桿菌；胞外多糖

乳酸菌(lactic ac id ba cteria，LAB)胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)是乳酸菌在生長代謝過程中分泌到周圍培養(yǎng)基的黏液多糖(slime po lysaccharides，S P S)和連接在菌體表面的莢膜多糖(c a p s u l a r polysaccharides，CPS)的總稱[1]。乳酸菌胞外多糖可賦予發(fā)酵乳制品特殊的質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味，是一類公認(rèn)食用安全(GRAS)的食品添加劑，可以作為增稠劑、穩(wěn)定劑、乳化劑和膠凝劑等應(yīng)用于各種食品中[2-4]。另外，研究表明，乳酸菌胞外多糖對人體健康也有促進作用，具有增強人體免疫力[5]、降低膽固醇[6]、抗腫瘤[7-8]、抗?jié)僛9]和改善腸道微生態(tài)環(huán)境[10]等生物活性，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

乳酸菌胞外多糖是一種長鏈，高分子質(zhì)量聚合物，

由成百上千個相同的寡糖重復(fù)單元聚合而成，其化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣。乳酸菌胞外多糖的結(jié)構(gòu)與其生理功能和生物活性的關(guān)系十分密切，多糖的分子質(zhì)量、取代基的種類和數(shù)目、構(gòu)象和單糖組成等都直接影響多糖的生物功能。為了更好的理解胞外多糖結(jié)構(gòu)與其生物功能的關(guān)系，本研究從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)乳制品中分離出1株產(chǎn)胞外多糖乳酸菌，經(jīng)API 50 CHL和16S rRNA鑒定為植物乳桿菌，對其產(chǎn)胞外多糖進行分離純化和單糖組成分析。采用化學(xué)方法修飾其胞外多糖，獲得硫酸化和磷酸化衍生物。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

植物乳桿菌(L. plantarum)C21分離自內(nèi)蒙古奶豆腐。菌株經(jīng)API 50 CHL培養(yǎng)基(法國Bio-Merieux公司)和16S rRNA鑒定為植物乳桿菌[11]，本實驗室保存。菌株接種于SDM液體培養(yǎng)基中[12]，37℃培養(yǎng)20h，用于胞外多糖提取。

DEAE-纖維素 上海恒信化學(xué)試劑有限公司；Sepharose CL-6B(Phamacia公司)；標(biāo)準(zhǔn)單糖 加拿大Bio Basic Inc.公司；Dextran 標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖 法國Fluka公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ICS2500離子色譜儀 美國Dionex 公司；Thermo Nicolet 380紅外光譜儀 美國 Thermo公司；722可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.3 胞外多糖的分離純化

植物乳桿菌C21胞外多糖的提取按Cerning等[13]的方法進行，粗多糖經(jīng)DEAE-纖維素離子交換柱層析(2.6cm× 30cm)進一步純化。稱取多糖樣品100mg，加入5mL水使其溶解，上到平衡后的DEAE-纖維素柱上。依次以蒸餾水、0.2mol/L、0.5mol/L NaCl溶液洗脫。流速為1mL/min，部分收集器收集洗脫液，每管5mL，苯酚-硫酸法檢測多糖含量，按照吸收峰收集各部分樣品，透析，凍干。取水洗脫部分經(jīng)SepharoseCL-6B柱色譜進一步純化。以0.9g/100mL NaCl溶液洗脫，流速為0.4mL/min，每20min收集一管，BS-100A自動收集器，苯酚-硫酸法測糖分布。洗脫液經(jīng)透析后凍干。

1.4 單糖組成分析

取1mg PCPc多糖，加入2mol/L的三氟乙酸(TFA) 0.5mL，密封，于110℃水解4h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至pH值中性，凍干。等量的標(biāo)準(zhǔn)單糖(阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖和果糖)混合后配制成66nmol/L溶液。胞外多糖水解樣和標(biāo)準(zhǔn)單糖水溶液分別以陰離子交換色譜柱分離。色譜條件：電化學(xué)檢測器E D 4 0，ICS3000 GP 50四元梯度泵，AS40自動進樣器，Chromeleon 6.8工作站。采用CarboPac PA10(4mm× 250mm) 陰離子交換色譜柱分離，以18mmol/L NaOH溶液和電阻率18.2MΩ·cm的超純水為洗脫液作梯度洗脫，流速為1mL/min。進樣量：25μL，柱溫：30℃，檢測器：脈沖安培檢測器(PAD)。

1.5 胞外多糖的結(jié)構(gòu)修飾[14]

將附有冷凝裝置的三頸瓶中加入10mL吡啶，冰浴10min后，緩慢滴加氯磺酸1mL，三頸瓶內(nèi)出現(xiàn)淡黃色固體，60℃水浴加熱使其溶解。取出1mL加入到20mg PCPc多糖樣品中，充分溶解樣品后，60℃水浴反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后，加入30g/100mL NaOH溶液中和，加10mL無水乙醇沉淀多糖，10000r/min離心10min，沉淀透析，凍干。取2mg KBr壓片，紅外光譜檢測。

POCl3(1mL)加入到9mL吡啶中，冰浴下磁力攪拌15min。PCPc多糖樣品20mg加1mL吡啶溶解后，加入POCl3的吡啶溶液0.5mL，室溫下磁力攪拌反應(yīng)1h。反應(yīng)結(jié)束后，加入0.2mL 30g/100mL NaOH溶液中和。加5mL丙酮沉淀多糖，10000r/min離心10min，沉淀透析，凍干。取2mg KBr壓片，紅外光譜檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 胞外多糖的分離純化

植物乳桿菌(L.plantarum)C21按體積分?jǐn)?shù)3%接種量接種于1000mL SDM液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)20h后，經(jīng)離心、TCA脫蛋白、乙醇沉淀、透析和凍干等步驟分離得到粗胞外多糖110mg，命名為PCPa[13]。苯酚-硫酸法檢測PCPa多糖含量達51.2%。PCPa經(jīng)DEAE-纖維素離子交換柱層析，以蒸餾水洗脫，洗脫液透析、凍干后得多糖66mg，命名為PCPb(圖1)。上述結(jié)果說明C21胞外多糖為中性多糖。PCPb上Sepharose CL-6B分子篩層析柱進一步純化，洗脫峰為單一對稱峰(圖2)，說明該多糖為分子量均一的組分。洗脫液透析、凍干得純化多糖PCPc 47mg。PCPc為白色纖維狀疏松固體，溶于水，易形成無色透明的膠體，不溶于丙酮、乙醇等有機溶劑。

圖1 PCPa DEAE-纖維素離子交換柱層析Fig.1 DEAE-cellulose ion exchange column chromatography of PCPa

圖2 PCPb Sepharose CL-6B分子篩層析柱層析Fig.2 Gel filtration chromatography of PCPb on Sepharose CL-6B column

2.2 胞外多糖的結(jié)構(gòu)分析

通過多糖水解產(chǎn)物離子色譜分析結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)單糖樣品保留時間的對比，確定PCPc單糖種類為半乳糖和葡萄糖(圖3)。根據(jù)峰面積比計算物質(zhì)的量比，結(jié)果測得PCPc的單糖組分中半乳糖和葡萄糖的物質(zhì)的量比為1∶2。

圖4 PCPc(A)及其硫酸化(B)和磷酸化(C)衍生物的紅外光譜圖Fig.4 FTIR spectra of PCPc, its sulfated and phosphorylated derivatives

圖3 標(biāo)準(zhǔn)單糖(A)及PCPc水解樣品(B)的高效陰離子色譜圖Fig.3 Ion exchange chromatography analysis of standard monosaccharides and hydrolyzed products of PCPc

PCPc的紅外譜圖見圖4A。3600～3200cm-1出現(xiàn)的寬峰為糖類物質(zhì)中分子內(nèi)和分子間氫鍵的O－H伸縮振動；2925cm-1附近一小尖峰為C－H伸縮振動；在1644cm-1左右有多糖的水合振動峰；以及1041cm-1處有多糖的特征吸收峰；證明PCPc的主要成分是多糖。1250～950cm-1間比較大的吸收峰是由兩種C－O的伸縮振動引起的，一種是屬于C－O－H的，另一種是吡喃糖環(huán)的C－O－C；而在890cm-1附近無吸收峰，提示PCPc多糖分子結(jié)構(gòu)中存在α型糖苷鍵。

2.3 胞外多糖的結(jié)構(gòu)修飾

圖4B是PCPc硫酸化衍生物的紅外光譜圖，與圖4A比較，圖譜中都出現(xiàn)了1228cm-1左右的S==O伸縮振動和836cm-1左右的C－O－S伸縮振動的特征吸收峰，說明硫酸根已經(jīng)與PCPc分子結(jié)合成酯。硫酸化PCPc圖譜中多糖的特征峰依然存在，說明本方法不會對多糖的結(jié)構(gòu)造成破壞，是一種較為溫和的硫酸化方法。但由于受到硫酸根的影響，其他基團的特征峰都稍微偏離了原來的位置。

磷酸酯化后的PCPc多糖(圖4C)在吸收峰波形、波數(shù)、吸收峰強度、峰寬等指標(biāo)上十分接近PCPc，說明兩者的成分非常相似，磷酸酯化反應(yīng)后并沒有雜質(zhì)生成。磷酸酯化PCPc多糖的紅外光譜顯示了兩個特征吸收帶，一個是在1270cm-1的是由于不對稱P＝O伸縮振動引起的，另外在882cm-1和703cm-1附近的特征吸收帶是由對稱的C－O－P 拉伸振動引起的。證明了磷酸基已被酯化到PCPc多糖上去。

3 討 論

乳酸菌作為一類食品級微生物，所產(chǎn)胞外多糖是安全無毒的，且胞外多糖具有獨特的生理功能和良好的流變學(xué)特性，對發(fā)酵乳品生產(chǎn)至關(guān)重要，廣泛應(yīng)用于酸奶、干酪和乳酸飲料等的生產(chǎn)。而對胞外多糖分離純化和結(jié)構(gòu)研究，了解化學(xué)結(jié)構(gòu)與生物功能的關(guān)系是其應(yīng)用的基礎(chǔ)。因此，本研究對1株自主分離和鑒定的植物乳桿菌所產(chǎn)胞外多糖進行了分離和純化，獲得高純度胞外多糖，初步分析了其結(jié)構(gòu)，為對其進一步的功能特性研究和構(gòu)效關(guān)系研究提供了參考。后續(xù)研究將采用化學(xué)分析(如甲基化分析)和波譜分析(如NMR)等方法進一步分析和確定C21胞外多糖重復(fù)單元的結(jié)構(gòu)。

乳酸菌胞外多糖在食品、醫(yī)藥和化工領(lǐng)域的應(yīng)用潛力日益受到關(guān)注。作為一種天然高分子聚合物，乳酸菌胞外多糖在應(yīng)用中往往受到限制。通過對胞外多糖進行分子結(jié)構(gòu)修飾，可以改善其理化特性，獲得新的功能特性和生物活性，并擴展其應(yīng)用領(lǐng)域。本研究采用化學(xué)方法對植物乳桿菌C21胞外多糖進行了結(jié)構(gòu)修飾，

獲得了硫酸化和磷酸化衍生物。后續(xù)研究將通過比較修飾前后胞外多糖在流變學(xué)性質(zhì)和生物功能等方面的變化，進一步探討胞外多糖的構(gòu)效關(guān)系。

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Isolation, Purification and Structural Modification of Exopolysaccharide from Lactobacillus plantarum C21

LI Sheng-yu，ZENG Xian-peng，ZHAO Yu-juan，ZHANG Xue，ZHANG Jian，YANG Zhen-nai*
(Center of Agro-Food Technology, Jilin Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130033, China)

In order to investigate the structure and properties of exopolysaccharide produced by Lactobacillus plantarum C21, a neutral exopolysaccharide was isolated from culture supernatant and purified by ethanol precipitation, DEAE-cellulose ion exchange column chromatography and gel filtration chromatography on Sepharose CL-6B column. The structure of this exopolysaccharide was determined by ion chromatography and FTIR spectroscopy and this exopolysaccharide was designated as PCPc. Results indicated that the PCPc was composed of D-galactose and D-glucose in a molar ratio of 1∶2. Sulfated and phosphorylated derivatives of PCPc were also prepared.

lactic acid bacteria；Lactobacillus plantarum；exopolysaccharide

Q939.9

A

1002-6630(2010)09-0131-04

2009-08-10

國家自然科學(xué)基金項目(30670057)

李盛鈺(1977—)，男，副研究員，博士，主要從事食品生物技術(shù)研究。E-mail：lisy720@126.com

*通信作者：楊貞耐(1965—)，男，研究員，博士，主要從事乳品工藝與生物技術(shù)研究。E-mail：zyang@cjaas.com