邵元龍， 董 英*

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

醬油曲霉發(fā)酵芝麻餅粕的條件優(yōu)化

邵元龍， 董 英*

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

采用響應(yīng)面法對醬油曲霉固體發(fā)酵芝麻餅粕提高抗氧化能力的條件進行優(yōu)化。通過Plackett-Burman設(shè)計法，評價麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、麥麩、玉米漿、酵母膏和硫酸銨8個因素對清除DPPH自由基能力的影響。篩選出麥麩、葡萄糖和硫酸銨為影響芝麻餅粕發(fā)酵提取物抗氧化活性的3個顯著因素，然后采用中心組合試驗設(shè)計和響應(yīng)面分析法，對3個關(guān)鍵因素進行優(yōu)化。優(yōu)化的發(fā)酵條件為：葡萄糖、硫酸銨和麥麩添加量分別為1.87%、1.54%和2.55%。在該實驗條件下，DPPH自由基清除活性為80.26%。

芝麻餅粕；發(fā)酵；優(yōu)化；抗氧化活性；醬油曲霉

在亞洲國家，芝麻廣泛應(yīng)用在各種傳統(tǒng)食品中，并且是世界上重要的油料作物之一，我國2007年的產(chǎn)量已達到59萬t。芝麻種子中除含有50%的油和25%的蛋白外，還含有豐富的具有生理活性的物質(zhì)[1]。提油后的芝麻餅粕中蛋白含量進一步提高，部分具有活性的木脂素類物質(zhì)也殘留在芝麻餅粕中。這部分木脂素包括芝麻素、芝麻酚、芝麻林素、芝麻林素酚等[2]。他們在體內(nèi)或體外具有不同的生理活性，如：抑制Δ 5去飽和酶[3]、保護肝臟[4]、降低膽固醇[5]、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[6]。

國內(nèi)外對芝麻餅粕中抗氧化物質(zhì)的研究日趨深入[7-8]，如對芝麻素的提取工藝[9-10]、檢測方法[11]的研究。單純的分離和鑒定木脂素已不能滿足未來對抗氧化劑的需求，應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)方法來尋找新的抗氧化劑來源是較有前景的途徑之一。2003年，日本的Ohtsuki等[12]用環(huán)狀芽孢桿菌YUS-2液體發(fā)酵芝麻餅粕，發(fā)現(xiàn)兩種新的具有更強抗氧化能力的物質(zhì)。2005年，日本的Miyake等[13]采用Aspergillus分別發(fā)酵芝麻素和三糖基芝麻素酚，轉(zhuǎn)化生成了更強抗氧化活性的木脂素類物質(zhì)。

2007年，董英等[14]用醬油曲霉發(fā)酵芝麻餅粕，發(fā)現(xiàn)可以提高其抗氧化活性，但并未對發(fā)酵條件進行優(yōu)化。因此，本實驗選用醬油曲霉(Aspergillus soja e)對芝麻餅粕進行發(fā)酵，以抗氧化活性(DPPH自由基清除活性)為指標(biāo)，對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，旨在為對發(fā)酵芝麻餅粕中抗氧化物質(zhì)的提取、分析和轉(zhuǎn)化機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

醬油曲霉(CICC2128) 中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；芝麻餅粕 江蘇鎮(zhèn)江京友調(diào)味品公司。

二苯代苦味肼基自由基(2,2-d i p h e n y l-2-picrylhydrazyl，DPPH) 美國Sigma公司。

HH-S恒溫水浴鍋、JJ-1 型電動攪拌器 江蘇金壇醫(yī)療儀器廠；LD5-10離心機 北京醫(yī)用離心機廠；WFJ-72000可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司；YM50A電熱蒸汽壓力滅菌器 上海三申醫(yī)療器械有限公司；PSX智能型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 寧波來?？萍加邢薰?。

1.2 方法

1.2.1 Plackett-Burman試驗設(shè)計

醬油曲霉接種于土豆汁(PDA)斜面培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)72h后，加入10mL無菌生理鹽水，用接種針刮下，調(diào)節(jié)菌液濃度為0.86×108CFU/mL。將粉碎的芝麻餅粕在烘箱中烘干，按料液比為1∶3(g/mL)的比例加入正己烷，45℃水浴攪拌3h，4000r/min離心10min，得脫脂芝麻餅粕。取10g烘干的脫脂芝麻餅粕加入9mL溶解有不同成分的溶液，于121℃滅菌20min，冷卻后，接種1mL制備好的種子懸液，搖勻，于28℃條件下發(fā)酵144h。

根據(jù)醬油曲霉生長所需營養(yǎng)要素的基本原則和發(fā)酵影響因素的一般規(guī)律，結(jié)合文獻[14]的報道和前期的實驗，選用試驗次數(shù)n=12的試驗設(shè)計，對麥芽糖(A)、葡萄糖(B)、蔗糖(D)、果糖(E)、麥麩(G)、玉米漿(H)、酵母膏(K)和硫酸銨(L)8個因素進行考察，每個因素取兩個水平，設(shè)計方案見表1，響應(yīng)值為發(fā)酵提取液對DPPH自由基清除活性(radical scanvening activity，RSA)。另設(shè) 3個虛擬列，以考察實驗誤差。對實驗結(jié)果進行分析，得出各因素的F值和可信度水平。一般選擇可信度大于90%以上的因素作為重要因素。

表1 Plackett-Burman試驗設(shè)計的因素水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experimental design

1.2.2 Box-Behnken試驗設(shè)計

根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果，選取醬油曲霉固體發(fā)酵芝麻餅粕提取液對DPPH自由基清除活性影響顯著的外界因子：葡萄糖、麥麩和硫酸銨作為試驗因素。試驗中響應(yīng)值為DPPH自由基清除活性，試驗因素隨機編碼為：葡萄糖(X1)、硫酸銨(X2)和麥麩(X3)，試驗因素及水平設(shè)計見表2，發(fā)酵條件與Plackett-Burman試驗一致。

表2 Box-Behnken試驗因素及水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3 發(fā)酵液的提取

發(fā)酵結(jié)束后，每瓶加入體積分?jǐn)?shù)8 0%乙醇溶液75mL，50℃水浴攪拌提取2h，轉(zhuǎn)速150r/min。上清液于5000r/min離心10min。沉淀按同樣條件重復(fù)提取一次，合并上清液，定容至150mL。

1.4 DPPH自由基清除活性測定

取發(fā)酵提取液1mL，用體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液稀釋10倍，作為樣品液。DPPH溶液濃度為7.5×10-6mol/L，波長517nm，50%乙醇溶液為對照。每個樣品重復(fù)測定兩次，求平均值。DPPH自由基清除活性(RSA)按下式計算：

式中： A0為5mL DPPH與1mL乙醇混合液的吸光度；Ai為5mL DPPH與1mL樣品反應(yīng)后的吸光度；Aj為5mL乙醇與1mL樣品混合液的吸光度[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman設(shè)計及結(jié)果

表3 Plackett-Burman試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

Plackett-Burman設(shè)計法是一種兩水平的試驗設(shè)計方法，它基于非完全平衡塊原理，可以用最少試驗次數(shù)估計出因素的主效應(yīng)，適用于從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個因素，供進一步研究用。對試驗結(jié)果進行分析，得出各因素的 F值和可信度水

平。一般選擇可信度大于 90%以上的因素作為重要因素[16]。Plackett-Burman試驗設(shè)計的試驗結(jié)果見表3。

表4 Plackett-Burman試驗設(shè)計結(jié)果相關(guān)系數(shù)和方差分析Table 4 Regression coefficients and variance analysis for the results of Plackett-Burman experiments

由表4各因素效應(yīng)分析結(jié)果可知，經(jīng)過醬油曲霉發(fā)酵后，葡萄糖、麥麩和硫酸銨3個因素對提取液清除DPPH自由基影響顯著，可信度在90%以上，對此三因素進一步做響應(yīng)面試驗。而其他因素的取值則根據(jù)各因素效應(yīng)的正負(fù)和大小，正效應(yīng)的因素均取較高值，負(fù)效應(yīng)的因素均取較低值。

2.2 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

表5 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Design and results of Box-Behnken experiments

Box-Behnken優(yōu)化試驗設(shè)計和結(jié)果見表5，利用Desig-Expert 7.0軟件，對表5中數(shù)據(jù)回歸擬合，獲得Aspergillus發(fā)酵芝麻餅粕的提取物抗氧化能力對自變量葡萄糖、硫酸銨和麥麩的二次多項回歸方程：

RSA/%=78.31＋2.22X1＋0.84X2＋2.27X3－0.39X1X2＋0.48X1X3＋0.32X2X3－1.77X12－2.76X22－2.06X32

模型方差分析見表6，試驗所選用的二次多項模型具有高度的顯著性(P=0.0229)，失擬項不顯著(P=0.0569)，其校正系數(shù)R2=0.926，表明有約92.6%的抗氧化能力可由此模型進行解釋。所以自由基清除率與預(yù)測值之間具有較好的擬合度，可用于Aspergillus固體發(fā)酵提高抗氧化能力的分析和預(yù)測。3個試驗因素中X1和X3對發(fā)酵提取物清除DPPH自由基能力的影響極顯著，而硫酸銨與各因素的交互作用皆不顯著。

表6 Box-Behnken試驗結(jié)果方差分析Table 6 Variance analysis of Box-Behnken experiments

2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果

圖1 葡萄糖和硫酸銨交互作用的響應(yīng)曲面及等高線圖Fig.1 Three-dimension respose surface plot for mutual interaction between glucose and ammonium sulfate

由圖1可知，當(dāng)葡萄糖和硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為1%時，RSA最低。硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時，隨葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，RSA也逐漸上升；硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%時，隨葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，RSA提高顯著。當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)再增高時，RSA隨葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大是先提高后下降趨勢。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時，隨著硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，RAS是先增大后減小。說明該氮源對RSA的變化范圍適當(dāng)。

圖2 葡萄糖和麥麩交互作用的響應(yīng)曲面及等高線圖Fig.2 Three-dimension respose surface plot for mutual interaction between ammonium sulfate and wheat bran

由圖2 可知，RSA隨著葡萄糖和麥麩質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高而提高。其原因可能是因為葡萄糖為較好的碳源，一方面促進了醬油曲霉的生長，間接地提高了生物作用的效果。麥麩富含營養(yǎng)物質(zhì)，在促進生物生長的同時，還提高了芝麻餅粕的通氣狀況。

圖3 硫酸銨和麥麩交互作用的響應(yīng)曲面及等高線圖Fig.3 Three-dimension respose surface plot for mutual influence between ammonium sulfate and wheat bran

由圖3可知，硫酸銨和麥麩交互作用可知，麥麩含量一定時，隨著硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，RSA是先上升后下降，并且高于1.5%時，變化更趨于明顯。當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%～1.75%時，RSA隨麥麩質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高變化較明顯，在2.5%左右達到最大值，總趨勢為隨著麥麩質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，RSA為先增加后降低，此點說明了麥麩對RSA的影響并不重要，由此也排除了發(fā)酵麥麩提高RSA占主導(dǎo)作用的可能。

2.4 模型驗證

表7 模型驗證Table 7 Verification of the model

為驗證醬油曲霉固體發(fā)酵提高抗氧化能力模型方程的合適性和有效性，在葡萄糖、硫酸銨和麥麩試驗水平范圍內(nèi)，選擇性地進行了5組不同組合的實際驗證實驗(表7)，同時以未發(fā)酵的芝麻餅粕做對照。利用 SPSS (version14.0)軟件對表7中數(shù)據(jù)進行距離相關(guān)分析得知，自由基清除活性實測值與預(yù)測值的相關(guān)系數(shù)為0.865，證明此模型是合適有效的，并具有一定的實踐指導(dǎo)意義。選擇1號驗證實驗的因素組合作為優(yōu)化的結(jié)果，即葡萄糖1.87%、硫酸銨1.54%、麥麩2.55%，該條件下，芝麻餅粕發(fā)酵提取物實際DPPH自由基清除活性為80.26%，明顯優(yōu)于未發(fā)酵的對照組。

3 結(jié) 論

3.1 用Box-Behnken試驗優(yōu)化醬油曲霉固體發(fā)酵芝麻餅粕提高抗氧化能力的二次多項數(shù)學(xué)模型方程為：RSA/%=78.31＋2.22X1＋0.84X2＋2.27X3－0.39X1X2＋0.48X1X3＋0.32X2X3－1.77X12－2.76X22－2.06X32，且該方程的預(yù)測值與實際值相關(guān)系為0.865，符合程度高，具有一定的指導(dǎo)意義。根據(jù)方程優(yōu)化的參數(shù)，獲得較優(yōu)的發(fā)酵條件為：葡萄糖、硫酸銨和麥麩質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為：1.87%、1.54%和2.55%，在該條件下發(fā)酵，DPPH自由基清除率為80.26%，未發(fā)酵的對照為42.78%。

3.2 通過對響應(yīng)面試驗結(jié)果的等高線圖和曲面圖分析，認(rèn)為添加的麥麩主要是提高了通氣效果，排除了抗氧化活性提高受其較大影響的可能。單獨發(fā)酵麥麩，是否

具有效提高抗氧化的作用，還有待進一步探索。

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Optimization of Nutritional Supplements for Fermentation Medium based on Sesame Cake for the Production of Antioxidant Substances by Aspergillus sojae

SHAO Yuan-long，DONG Ying*
(School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

Response surface methodology was used to optimize fermentation condition to improve antioxidant activity in solidstate sesame cake by Aspergillus sojae. The effects of maltose, glucose, sucrose, fructose, wheat bran, corn steep, yeast extract and ammonium sulfate on scavenging capability of sesame cake to DPPH free radicals were evaluated by using Plackett-Burman design. Results showed that wheat bran and glucose as well as ammonium sulfate were the major factors and had significant effect on antioxidant activity. Meanwhile, the central composite experimental design and response surface analysis were used to optimize the levels of major factors. The optimal condition was 1.87% glucose, 1.54% ammonium sulfate and 2.55% wheat bran, respectively. Under this optimal fermentation condition, the scavenging capability of sesame cake to DPPH free radicals was 80.26%.

sesame cake；fermentation；optimization；antioxidant activity；Aspergillus sojae

TQ92

A

1002-6630(2010)09-0192-05

2009-01-09

江蘇省科技攻關(guān)項目(BE2005335)

邵元龍(1977— )，男，博士，主要從事生物資源的深度開發(fā)與利用研究。E-mail：long9702@126.com

*通信作者：董英(1954 —)，女，教授，本科，主要從事食品功能因子和食品生物技術(shù)研究。E-mail：ydong@ujs.edu.cn