蔡 丹，張娜娜，劉景圣*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

膽固醇氧化酶高產(chǎn)菌株的篩選及鑒定

蔡 丹，張娜娜，劉景圣*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

將從不同地點(diǎn)采集到的9個(gè)樣品進(jìn)行分離篩選，從中分離到23株以膽固醇為唯一碳源的菌株，確定其中1株胞外膽固醇氧化酶高產(chǎn)菌株A3，其膽固醇氧化酶的活力為525U/L。經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)和生理生化實(shí)驗(yàn)初步鑒定，該菌株屬于短桿菌屬(Brevibacterium sp.)。

膽固醇氧化酶；菌株；篩選

膽固醇(cholesterol)又叫膽甾醇，是機(jī)體內(nèi)重要的固醇類物質(zhì)，具有多種多樣的生理功能，它是細(xì)胞膜的組成部分，與膜的通透性及神經(jīng)傳導(dǎo)密切相關(guān)，它也是類固醇激素、VD、膽汁酸等的前體物質(zhì)，同時(shí)參與機(jī)體免疫系統(tǒng)。所以，膽固醇是人類維持正常生理活動(dòng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有重要的生理功能[1-2]。但是血清中膽固醇含量過(guò)高也會(huì)影響人類的健康，目前因膽固醇過(guò)高而引起的動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、腦中風(fēng)等心腦血管疾病已嚴(yán)重威脅人體健康。為了避免人體從飲食中攝取過(guò)多的膽固醇，采用合適的加工技術(shù)降低食品中的膽固醇含量是解決這一問(wèn)題的有效途徑。采用生物學(xué)方法尤其是利用微生物產(chǎn)生的膽固醇氧化酶分解食品中的膽固醇成為一種比較經(jīng)濟(jì)而有效的降低食品中膽固醇的方法[3-5]。膽固醇氧化酶(cholesterol ox idase，EC1.1.3.6，COD)作為膽固醇代謝途徑第一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶，能專一性地催化膽固醇生成膽甾-4-烯-3-酮和H2O2，在食品加工領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用價(jià)值[6-9]。

本實(shí)驗(yàn)主要研究膽固醇氧化酶高產(chǎn)菌株的篩選及鑒定，以期豐富膽固醇氧化酶的菌種資源，為膽固醇氧化酶的工業(yè)化應(yīng)用提供可靠的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

樣品：分別從雙陽(yáng)油田、吉林金翼蛋品有限公司、吉林省阿滿食品有限公司等處采集土樣樣品，記錄好采集地點(diǎn)、時(shí)間及天氣條件等。

膽固醇標(biāo)品、辣根過(guò)氧化物酶、Triton X-100 北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；4-氨基-安替比林 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；疊氮鈉、苯酚、過(guò)氧化氫、異丙醇、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、蒸餾水1L，pH 7.5，121℃滅菌20min；選擇培養(yǎng)基：膽固醇2g、NH4NO30.2g、NaCl 1g、KH2PO41.6g、Triton X-100 3 mL、瓊脂 20 g、蒸餾水 1L，pH7.5，121℃滅菌20min；發(fā)酵培養(yǎng)基：膽固醇1g、葡萄糖 5g、

酵母粉 6g、CH3COONH42g、K2HPO40.2g、MgSO4· 7H2O 0.05g、NaCl 1g、FeSO4·7H2O 0.01g、 Triton X-100 3mL、蒸餾水1L， pH7.5，121℃滅菌20min；菌種鑒定培養(yǎng)基：1)葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5g、牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl 3g、Na2HPO4·12H2O 2g、加入0.2%溴麝香草酚藍(lán)溶液使其體積分?jǐn)?shù)為1.2%、蒸餾水1L，pH7.0，121℃滅菌20min；2)甲基紅實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：蛋白胨5g、葡萄糖5g、K2HPO45g、蒸餾水1L，pH 7.0，121℃滅菌20min；3)檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：檸檬酸鈉5g、NaCl 5g、MgSO4·7H2O 0.2g、(NH4)H2PO41g、K2HPO41g、瓊脂20g、蒸餾水1L，0.2%溴麝香草酚藍(lán)溶液40mL，pH 7.0，121℃滅菌20min；4)明膠液化實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：明膠120g、蛋白胨5g、牛肉膏3g、蒸餾水1L，pH6.8～7.0，121℃滅菌10min；5)淀粉水解實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：蛋白胨10g、NaCl 5 g、牛肉膏3g、可溶性淀粉2g，pH7.2，121℃滅菌20min；6)硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：KNO30.2g、蛋白胨5g、牛肉膏3g、蒸餾水1L，pH7.4，121℃滅菌20min；7)硫化氫產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：牛肉膏3g、酵母浸粉3g、蛋白胨10g、FeSO4· 7H2O 0.2g、Na2S2O30.3g、NaCl 5g、瓊脂12g、蒸餾水1L，pH7.4，121℃滅菌20min；8)纖維素水解實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：K2HPO42.0g、NH4NO32.0g、MgSO4·7H2O 0.2g、酵母膏5.0g、纖維素20.0g、pH7.2，121℃滅菌20min；9)V-P實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：蛋白胨5g、葡萄糖5g、K2HPO45g、蒸餾水1L，pH7.0，121℃滅菌20min。

1.2 儀器與設(shè)備

JNOEC-XS-402型實(shí)驗(yàn)室生物顯微鏡 江南光電(集團(tuán))股份有限公司；HD-1630超凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；YXQ-SG41-280壓力蒸汽滅菌器 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；PHS-3C精密pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；TDA-8002水浴鍋 余姚市東方電工儀器廠；HPX-9162MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；AUY220EXP電子天平 北京塞多利斯有限公司；UT-1810紫外分光光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；LG10-2.4A離心機(jī) 湖南星科科學(xué)儀器公司；HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠。

1.3 產(chǎn)膽固醇氧化酶菌株的分離篩選

1.3.1 初篩

稱取樣品各1g，分別加入盛有玻璃珠和100mL無(wú)菌生理鹽水的三角瓶中，振蕩20min后，以10%的接種量接入100mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，37℃、200r/min搖床培養(yǎng)24h。然后將培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，選取合適的3個(gè)梯度，分別為10-4、10-5、10-6涂篩選平板，于37℃倒置培養(yǎng)24h后，挑取不同菌落形態(tài)的菌株進(jìn)行平板劃線分離，得到單菌落，轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基，4℃保藏。

1.3.2 復(fù)篩

將斜面種子挑取一環(huán)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、200r/min搖床培養(yǎng)48h。吸取5mL發(fā)酵液進(jìn)行離心(4000r/min，20min)，分別測(cè)上清液的酶活力。

1.3.3 膽固醇氧化酶酶活力的測(cè)定

采用過(guò)氧化氫比色法[10]。在酶的催化過(guò)程中，氧化1mol膽固醇可產(chǎn)生1mol過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫在過(guò)氧化物酶的作用下，可使4-氨基-安替比林與苯酚形成亞醌類紅色的化合物，在波長(zhǎng)500nm處有最大吸收峰，通過(guò)測(cè)量膽固醇被氧化的量，從而計(jì)算出膽固醇氧化酶酶活力。

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取溶液B(每升溶液B中含4-氨基-安替比林1mmol，苯酚6mmol，pH7.5磷酸鉀緩沖液25mmol，疊氮鈉0.2g，辣根過(guò)氧化物酶6000U)3mL于6支試管中，37℃保溫3min；每份分別加入2.584mmol/L的過(guò)氧化氫0、50、100、150、200、250μL，反應(yīng)5min，于波長(zhǎng)500nm處測(cè)定其吸光度。以過(guò)氧化氫濃度為縱坐標(biāo)，吸光度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.2 膽固醇氧化酶酶活力的測(cè)定

取溶液B(每升溶液B中含4-氨基-安替比林1mmol，苯酚6mmol，pH7.5磷酸鉀緩沖液25mmol，疊氮鈉0.2g，辣根過(guò)氧化物酶6000U)3mL，溶液D[溶液D為膽固醇-異丙醇溶液(含Triton X-100，4.26%)0.826%]150μL于試管中，37℃保溫3min，加入50μL發(fā)酵上清液，準(zhǔn)確反應(yīng)5min，于沸水中加熱3min，冷卻后，在波長(zhǎng)500nm處測(cè)吸光度。用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算膽固醇氧化酶酶活力。

1.4 高產(chǎn)菌株的確定及菌種鑒定

1.4.1 高產(chǎn)菌株的確定

用過(guò)氧化氫比色法測(cè)定樣品中膽固醇氧化酶酶活力后，選取高產(chǎn)菌株為目標(biāo)菌株。

1.4.2 高產(chǎn)菌株的鑒定

1.4.2.1 形態(tài)鑒定

采用革蘭氏染色法，用顯微鏡觀察培養(yǎng)24h菌體細(xì)胞的形態(tài)。

1.4.2.2 生理生化實(shí)驗(yàn)法鑒定

按照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[11]、《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[12]及《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[13]的方法，對(duì)待測(cè)菌株分別進(jìn)行葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)、接觸酶實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)和硫化氫產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表1 菌株生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical experimental results

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)膽固醇氧化酶菌株的分離篩選

2.1.1 初篩

用以膽固醇為單一碳源的篩選平板進(jìn)行分離，得到不同形態(tài)的菌株23株，選擇培養(yǎng)基平板生長(zhǎng)狀態(tài)見(jiàn)圖1。

圖1 選擇培養(yǎng)基平板Fig.1 Selection of culture medium

2.1.2 復(fù)篩

將23株初篩菌株接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，200r/min搖床培養(yǎng)48h，離心，分別測(cè)上清液酶活力。得到8株上清液酶活力相對(duì)較高的菌株，確定這8株菌株可產(chǎn)胞外膽固醇氧化酶，其中菌株A3酶活力可達(dá)525U/L。所以確定菌株A3為本實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)菌株。

2.2 膽固醇氧化酶酶活力的測(cè)定

以過(guò)氧化氫濃度為縱坐標(biāo)，A500nm為橫坐標(biāo)，繪制過(guò)氧化氫標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2。

圖2 過(guò)氧化氫濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of hydrogen peroxide

膽固醇氧化酶酶活力定義為：在37℃，pH7.5，1min內(nèi)，催化1μmol膽固醇氧化為膽甾-4-烯-3-酮所需的酶。根據(jù)酶活力定義和過(guò)氧化氫濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，可以得出酶活力的計(jì)算公式為：

式中：A500nm為反應(yīng)液吸光度；V為反應(yīng)液體積/ mL；n為酶液稀釋倍數(shù)；t為反應(yīng)時(shí)間/min。

2.3 高產(chǎn)菌株的確定及菌種鑒定

2.3.1 形態(tài)鑒定

將菌株A3在固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，菌落呈乳白色，表面有光澤，扁平，圓形邊緣整齊。用顯微鏡觀察培養(yǎng)24h菌體細(xì)胞的形態(tài)，菌體細(xì)胞呈桿狀，形狀規(guī)則，無(wú)分枝，經(jīng)革蘭氏染色檢驗(yàn)，菌體呈藍(lán)紫色，確定為革蘭氏陽(yáng)性菌，見(jiàn)圖3。

圖3 菌株A3菌落形態(tài)及革蘭氏染色圖片F(xiàn)ig.3 Strain A3 colonies and Gram staining

2.3.2 生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定

對(duì)待測(cè)菌株分別進(jìn)行葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)等生理生化鑒定實(shí)驗(yàn)后，其各項(xiàng)生理生化特征見(jiàn)表1。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[13]，初步確定該菌株屬于短桿菌屬(Brevibacterium sp.)。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)從被油脂污染的自然環(huán)境中采集到9個(gè)樣品，從中分離得到23株以膽固醇為唯一碳源的菌株，并通過(guò)復(fù)篩得到1株胞外高產(chǎn)膽固醇氧化酶菌株A3，其膽固醇氧化酶的活力可達(dá)到525U/L。經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)和生理生化實(shí)驗(yàn)的初步鑒定，該菌株屬于短桿菌屬(Brevibacterium sp.)。

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Screening and Identification of Cholesterol Oxidase-producing Strains with High Activity

CAI Dan，ZHANG Na-na，LIU Jing-sheng*
(College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Twenty-three strains using cholesterol as the sole carbon source were isolated from nine samples collected from different locations. One strain with high yield of extracellular cholesterol oxidase was screened and named as strain A3. The highest activity of cholesterol oxidase was 525 U/L. The strain A3 was identified as Brevibacterium sp. through analyzing its morphology, physiological and biochemical characteristics.

cholesterol oxidase；strain；screening

Q93.331

A

1002-6630(2010)09-0202-04

2009-12-30

吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)青年啟動(dòng)基金項(xiàng)目(2007027)

蔡丹(1980—)，女，講師，博士研究生，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)與功能性食品開(kāi)發(fā)。E-mail：infinite_cd@yahoo.cn

*通信作者：劉景圣(1964—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)與功能性食品開(kāi)發(fā)。E-mail：liujs1007@vip.sina.com.cn