沙棘籽粕生物堿的提取分離及對乳鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

胡長鷹，徐德平

(1.暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

沙棘籽粕生物堿的提取分離及對乳鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

胡長鷹1，徐德平2

(1.暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

目的：研究沙棘籽粕中生物堿的提取分離及其對乳鼠心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用。方法：用乙醇提取、利用多種柱層析分離手段從沙棘籽粕中分離單體化合物，采用質(zhì)譜、核磁共振法鑒定其結(jié)構(gòu)；采用乳鼠心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷模型，利用MTT法測定心肌細(xì)胞存活率，檢測乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)含量以反映心肌細(xì)胞受損的程度。結(jié)果：從沙棘籽粕分離得到SJ-A-Ⅰ組分，經(jīng)鑒定為生物堿5,11-二羥基色胺；該物質(zhì)能有效維持心肌細(xì)胞活力，減少培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷所致心肌酶(LDH、CK)的釋放。結(jié)論：沙棘籽粕中的生物堿5,11-二羥基色胺對乳鼠心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷具有明顯的保護(hù)作用，其最佳質(zhì)量濃度為150mg/L。

沙棘籽粕；生物堿；5,11-二羥基色胺；心肌細(xì)胞；缺血/再灌注

沙棘(Hippophae rhamnoides L.)是胡頹子科沙棘屬植物，我國沙棘資源蘊藏量豐富，主要分布在西北、西南、華北和東北等地[1]。沙棘籽含有豐富的脂肪酸、蛋白質(zhì)和生物活性物質(zhì)，具有極高的營養(yǎng)價值。目前沙棘籽主要用來提取沙棘油，脫油后的籽粕大多作為飼料[2-3]。據(jù)報道沙棘籽粕中含有大量的具有多種生理活性的原花青素，因此對沙棘籽粕中原花青素的研究已成熱點[4-7]。

本課題組在對沙棘籽粕中原花青素組成的研究時發(fā)現(xiàn)，沙棘籽粕中除原花青素外還含有大量的生物堿。對生物堿的主要組分進(jìn)一步分離，得到一個生物堿單體并確定該生物堿的結(jié)構(gòu)。以體外培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞為基礎(chǔ)，通過缺氧/復(fù)氧復(fù)制心肌缺血/再灌注模型，探討沙棘籽粕中生物堿對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘(Hippophae rhamnoides L. subsp. Sinensis Rousi)籽粕為沙棘籽經(jīng)超臨界CO2萃取后的籽粕，購自青海省康普生物公司。

無水乙醇、丙酮、硫酸、茴香醛、冰醋酸、甲醇、石油醚(沸程30～60℃)、正丁醇(均為AR級) 上海化學(xué)試劑采購供應(yīng)站；GF254硅膠板 山東煙臺芝罘化工廠；大孔吸附樹脂AB-8 南開大學(xué)化工廠；MCI gelCHP20柱填料 日本三菱化學(xué)公司；HW-40柱填料日本Tosoh公司；95%工業(yè)乙醇 市購。

SD乳鼠：1～3d，南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供(許可證號：SCXK粵2006-0015)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS) 美國Gibco公司；胰蛋白酶 美國Hyclone公司；噻唑蘭(MTT) 美國Amresco 公司；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒 東甌津瑪生物科技有限公司；肌酸激酶(CK)試劑盒 奧斯邦生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

WFJ8-20中藥粉碎機 江陰市靈杏藥化設(shè)備有限公司；SS800離心機 江蘇華大離心機制造有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申生科技有限公司；循環(huán)水真空泵、低溫冷卻液循環(huán)泵 鞏義市英峪予華儀器廠；質(zhì)譜儀ESI/MS 英國Micromass公司； 500MHz核磁共振儀Buker Avance公司；CO2培養(yǎng)箱 Thermo Forma公司；CKX41倒置顯微鏡 Olympus公司；96孔板 廣東光華化學(xué)廠；低溫恒溫離心機 Eppendorf公司；酶標(biāo)儀Tecan公司；7600全自動生化分析儀 Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 沙棘籽生物堿的提取與分離

將50kg沙棘籽粕置于500L提取罐中，以體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇為溶劑，料液比1∶5(m/V)，50℃攪拌提取2h，1200r/min離心15min分離出乙醇液，渣再重復(fù)提取2次。合并清液，濃縮到約1/10體積。濃縮液邊攪拌邊加入2～3倍體積乙酸乙酯進(jìn)行萃取，反復(fù)多次萃取，直至乙酸乙酯相無色時止。合并乙酸乙酯相，在低于55℃條件下減壓濃縮至無乙酸乙酯味，得沙棘籽乙酸乙酯萃取物。

將乙酸乙酯萃取物上大孔吸附樹脂(型號AB-8)層析柱(20cm×180cm)，先用1倍柱體積去離子水洗脫，再用20%乙醇洗脫，收集20%乙醇洗脫液，濃縮到無乙醇止。置于真空干燥箱內(nèi)，控制溫度50～60℃，干燥3 h，得沙棘籽總生物堿。

將總生物堿溶解，上HW-40柱(50mm×1500mm)，先用2000mL去離子水洗脫，再用5%、10%、15%、2 0%不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇梯度洗脫，每梯度洗脫1000mL，20mL收集一試管，經(jīng)TLC鑒定和硫酸茴香醛顯色，將Rf值和顯色情況相同的洗脫液合并，選擇其中包含含量最高成分的洗脫部分合并濃縮。將該部分濃縮液反復(fù)上MCI柱(35mm×1000mm)，分別用去離子水、5%、10%乙醇洗脫，每梯度洗脫500mL，洗脫流速5.0mL/min，20mL收集1管，經(jīng)TLC鑒定純度，得到單體化合物SJ-A-Ⅰ。

1.3.2 結(jié)構(gòu)鑒定

將SJ-A-Ⅰ用重水(D2O)溶解后進(jìn)行1H-NMR、13CNMR、135DEPT測定。

1.3.3 SJ-A-Ⅰ對乳鼠心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷的影響

1.3.3.1 心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)

參照文獻(xiàn)[8-10]的方法：將出生1～3d的SD乳鼠20只于75%酒精中浸泡10s后取出心臟，用冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗去血液，取出心尖1/3左右，反復(fù)洗3次，剪碎，加入0.125%胰蛋白酶8mL消化，于37℃水浴中磁力攪拌5min，自然沉淀后去除上清液，再加入8mL胰蛋白酶反復(fù)消化，取上清液移入10mL離心管中，加等量含血清培養(yǎng)基(DMEM+10% FBS)，800r/min離心7min。將離心所得的沉淀用含血清培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，200目過濾，移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置二氧化碳培養(yǎng)箱(體積分?jǐn)?shù)為95% O2，5% CO2)中差速貼壁2.5h，純化心肌細(xì)胞。當(dāng)臺盼藍(lán)染色計活細(xì)胞數(shù)達(dá)95%以上時，調(diào)整細(xì)胞密度4×104個/孔接種于96孔板。置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后換1次液，48h后再換液。待細(xì)胞融合，狀態(tài)良好，出現(xiàn)同簇細(xì)胞同步搏動時開始實驗。

1.3.3.2 實驗分組

取培養(yǎng)3～4d的心肌細(xì)胞，分5組：正常對照組；缺血/再灌注模型組；SJ-A-Ⅰ50、100、150、200mg/L劑量給藥組。

1.3.3.3 心肌缺血/再灌注損傷模型建立

按文獻(xiàn)[11]配制模擬缺血液，缺血液充入氮氣(純度99%)飽和15min，置換正常培養(yǎng)基后，放入自制密封盒內(nèi)，充氮10min后密封，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，造成心肌細(xì)胞缺血缺氧。再灌注時以復(fù)氧液置換缺血液，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h。

1.3.3.4 檢測指標(biāo)

采用MTT法檢測心肌細(xì)胞存活率[8]；采用LDH(乳酸脫氫酶)、CK(肌酸激酶)含量的高低反映心肌細(xì)胞受損的程度(采用試劑盒進(jìn)行檢測)。

1.3.3.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0版統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，實驗重復(fù)6次，所有數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，

用單因素方差分析比較各組均數(shù)之間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 SJ-A-Ⅰ結(jié)構(gòu)的鑒定

SJ-A-Ⅰ為白色無定形粉末，溶于甲醇、乙醇，易溶于水。ESI-MS給出m/z：178.3[M+H]+，SJ-A-Ⅰ相對分子質(zhì)量應(yīng)為177.3，從相對分子質(zhì)量為奇數(shù)來看，SJ-A-Ⅰ應(yīng)含奇數(shù)個氮原子。

1H-NMR譜：芳香區(qū)有4個氫，其中δ7.23(1H，d，J=8.7)，6.99(1H，d，J=2.3)，6.76(1H，dd，J=2.3，8.7)，這3個氫形成一個AMX系統(tǒng)，表明存在苯環(huán)鄰間位三取代；δ7.05為單峰氫。δ3.72(2H，d, J=6.9)，2.80(2H，d, J=6.9)，從偶合常數(shù)來看應(yīng)為相連的兩個C H2。

13C-NMR譜和135DEPT譜：共有10個C，其中δ 134.5、130.7、113.9為3個季碳，δ127.4、115.4、114.4、105.8為4個－CH上的碳，δ64.8、30.4為2個－C H2上的碳。從化學(xué)位移看δ64.8為一個連氧的－CH2，推斷有－CH2CH2OH結(jié)構(gòu)片斷。綜合分析并參照文獻(xiàn)[12-13]得SJ-A-Ⅰ為5,11-二羥基色胺，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 5,11-二羥基色胺結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of 5,11-dihydroxyltryptamine

2.2 SJ-A-Ⅰ對乳鼠心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷的影響

2.2.1 SJ-A-Ⅰ對缺血/再灌注損傷乳鼠心肌細(xì)胞存活率的影響

表1 SJ-A-Ⅰ對缺血/再灌注損傷乳鼠心肌細(xì)胞存活率的影響(x±s)Table 1 Effect of SJ-A-Ⅰ on viability of neonatal rat cardiomyocytes injured by I/R (x±s)

由表1可見，在模型組中其細(xì)胞存活率僅為27.55%，可見缺血/再灌注明顯損傷心肌細(xì)胞活力，SJ-A-Ⅰ能有效提高細(xì)胞存活率，并呈明顯的量效關(guān)系。SJ-A-Ⅰ劑量為50mg/L時，細(xì)胞存活率為58.26%(P＜0.05)，SJ-A-Ⅰ劑量為150mg/L時，心肌細(xì)胞存活率高達(dá)85.67% (P＜0.01)，但在200mg/L時心肌細(xì)胞存活率反而有所下降。實驗表明SJ-A-Ⅰ具有很強的保護(hù)心肌細(xì)胞作用，最佳質(zhì)量濃度在150mg/L。這一實驗結(jié)果提示高質(zhì)量濃度生物堿SJ-A-Ⅰ對心肌細(xì)胞是否有一定負(fù)面作用，課題組正在進(jìn)一步研究中。

2.2.2 SJ-A-Ⅰ對缺血/再灌注損傷心肌細(xì)胞液中LDH、CK含量的影響

LDH、CK是細(xì)胞能量代謝過程中重要的催化酶，當(dāng)心肌細(xì)胞受到損傷，細(xì)胞膜破裂后可從細(xì)胞內(nèi)釋放。培養(yǎng)液中LDH、CK的含量越高反映心肌細(xì)胞受損的程度越重。S J-A-Ⅰ對缺血/再灌注損傷心肌細(xì)胞液中LDH、CK含量的影響如表2所示。

表2 SJ-A-Ⅰ對缺血/再灌注損傷心肌細(xì)胞中LDH和CK含量的影響(x±s)Table 2 Effect of SJ-A-Ⅰon LDH and CK activities of neonatal rat cardiomyocytes injured by I/R (x±s)

由表2可見，在模型組中可見缺血/再灌注損傷導(dǎo)致心肌細(xì)胞液中LDH、CK含量顯著升高，達(dá)到23.71%，表明心肌細(xì)胞受損嚴(yán)重。沙棘籽粕提取物SJ-A-Ⅰ能有效降低細(xì)胞液中LDH和CK含量，劑量為50mg/L時就能顯著降低LDH和CK含量(P＜0.05)，在150mg/L時LDH、CK含量最低(P＜0.01)，并且呈劑量依賴關(guān)系。表明SJ-A-Ⅰ對缺血/再灌注造成的心肌細(xì)胞損傷具有有效保護(hù)作用，150mg/L效果最好。

3 結(jié) 論

沙棘是我國古代藏醫(yī)、蒙醫(yī)的常用藥物。1977年，沙棘作為中藥被列入《中華人民共和國藥典》。目前沙棘活性成分研究多集中在沙棘油、黃酮、原花青素等，有關(guān)沙棘籽粕中生物堿的成分和活性的研究，國內(nèi)外少見報道。本實驗從沙棘籽粕中分離得到生物堿類物質(zhì)5,11-二羥基色胺，具有類似血清素(5-羥基色胺)的

結(jié)構(gòu)，而這類化學(xué)物質(zhì)具有很好的保護(hù)心血管疾病作用[14]，乳鼠心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷的保護(hù)研究表明，沙棘抗心肌缺血活性除黃酮、原花青素外生物堿也起著重要作用。同時，高質(zhì)量濃度生物堿5,11-二羥基色胺對心肌細(xì)胞是否有一定負(fù)面作用，課題組正在進(jìn)一步研究中。

[1]顧關(guān)云. 沙棘的化學(xué)成分、生物活性與臨床研究[J]. 國外醫(yī)藥∶ 植物藥分冊, 2007, 22(4)∶ 139-149.

[2]李永海, 忻耀年. 沙棘產(chǎn)品的研究與開發(fā)[J]. 國際沙棘研究與開發(fā), 2008, 6(3)∶ 4-9.

[3]黃銓, 史玲芳, 王士坤. 沙棘種植技術(shù)與開發(fā)利用[M]. 北京∶ 金盾出版社, 1998∶ 113-123.

[4]徐曉云, 潘思軼, 謝筆鈞, 等. 沙棘籽原花青素體外抗氧化活性研究[J]. 食品科學(xué), 2005, 26(2)∶ 216-218.

[5]樊金玲, 丁霄霖, 徐德平. 沙棘籽中的原花色素化合物[J]. 中草藥, 2006, 37(4)∶ 514-517.

[6]VICTOR A P. Characterization of oligomer and polymeric procyanidins from grape seed by liquid secondary ion mass spectrometry[J]. Phytochemistry, 1998, 49(5)∶ 1435-1441.

[7]AMITABYE L, THEESHAN B, ALAN C, et al. Characterization of the antioxidant functions of functions of flavonoids and proanthocyanidins in Mauritian black teas[J]. Food Research International, 2005, 38(3)∶ 357-367.

[8]司徒鎮(zhèn)強, 吳軍正. 細(xì)胞培養(yǎng)[M]. 西安∶ 世界圖書出版公司, 2006∶250-252.

[9]斯佩克特, 戈德曼, 萊因萬. 細(xì)胞實驗指南[M]. 黃培堂, 譯. 北京∶ 科學(xué)出版社, 2001∶ 79-89.

[10]HARARY L, FARIEY B. In vitro studies of single isolated beating heart cells[J]. Science, 1960, 131∶ 1674-1675.

[11]BRAR B K, STEPHANOU A, LIAO Z, et al. Cardiotrophin-1 can protect cardiac myocytes from injury when added both prior to simulated ischemia and reoxygenation[J]. Cardiovascular Reseacher, 2005, 51∶265-274.

[12]HUILI Z, NAGATSU A, WATANABE T, et al. Antioxidative compounds isolated from safflower (Carthamus tinctorius L.) oil cake[J]. Chem Pharm Bull, 1997, 45∶ 874-876.

[13]KUMARASAMY Y, MIDDLETON M, REID R G, et a1. Biological activity of serotonin conjugates from the seeds of Centaurea nigra[J]. Fitoterapia, 2003, 74∶ 609-612.

[14]金青哲, 易曉霆, 單良, 等. 苯丙烯酰5-羥色胺衍生物的分布、提取及其生物活性的研究進(jìn)展[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2008, 20(5)∶926-933.

Extraction, Isolation and Protective Effect of Alkaloid from Seabuckthorn Seeds on Injured Cardiomyocytes in Rats

HU Chang-ying1，XU De-ping2
(1. Department of Food Science and Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China；2. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Objective∶ To investigate the protective effect of alkaloid from seabuckthorn seeds on injured cardiomyocytes in rats. Methods∶ EtOH extract from seabuckthorn seeds was purified by column chromatography and its structure was elucidated by MS and NMR spectroscopic analyses. A model of cardiac ischemic/reperfusion (I/R) in vitro was established using the primary cultured rat cardiomyocytes. The viability of cardiomyocytes was evaluated by MTT assay and the contents of lactate dehydrogenase (LDH) and creatine kinase (CK) were measured to verify the protective effect on injured rat cardiomyocytes by I/R. Results∶ The structure of water-soluble alkaloid was identified as 5,11-dihydroxyltryptamine, which could promote the survival rate of cardiomyocytes subjected to I/R injury and reduced the release of myocardial enzymes induced by I/R injury. Conclusion∶ The identified 5,11-dihydroxyltryptamine from seabuckthorn seeds exhibited an excellent protective effect on cultured neonatal rat cardiomyocytes injured by ischemia/reperfusion at the optimal concentration of 150 mg/L.

seabuckthorn seed；alkaloid；5,11-dihydroxyltryptamine；cardiomyocyte；ischemia/reperfusion

R282.7

A

1002-6630(2010)09-0234-04

2009-09-19

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2007BAD83B02)

胡長鷹(1968—)，女，副教授，博士，主要從事食品功能因子和農(nóng)副產(chǎn)品深加工研究。E-mail：hucy0000@sina.com