王青，薛曹葉，羊小海，王柯敏

（化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，生物納米與分子工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410082）

0 引言

鋅離子是人體內(nèi)含量僅次于鐵的過渡金屬，在許多生理，生化過程中發(fā)揮極為重要的作用。鋅離子的濃度與多種疾病的發(fā)生緊密相關(guān)[1]。鋅離子活性降低會(huì)引起神經(jīng)元損傷，細(xì)胞凋亡也與鋅離子有關(guān)。但如果鋅的攝入過量，將會(huì)造成鋅中毒。長期過量攝取含鋅食物會(huì)影響銅代謝，造成低銅，鋅、銅比值過高，可影響膽固醇代謝，形成高膽固醇血癥，最終導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、冠心病等。因此檢測(cè)鋅離子具有重要的意義。

目前鋅離子的主要檢測(cè)方法有原子吸收光譜法[2]，分光光度法[3]，離子色譜法[4]等，其中原子吸收光譜法靈敏度最高，但是這些方法儀器昂貴、操作繁瑣，成本太高不利于普及。熒光法用于測(cè)定鋅離子具有選擇性好、靈敏度高、簡便、快捷等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)設(shè)計(jì)并合成出很多發(fā)光機(jī)理不同的熒光探針[5～6]。在溶液檢測(cè)中，Yang等[7]構(gòu)造了卟啉/β-環(huán)糊精超分子傳感器，隨著鋅離子濃度增加，卟啉的熒光強(qiáng)度比例（I606/I656）逐漸增加，該方法對(duì)鋅離子有良好的特異性。Hall等將鋅離子受體氮雜環(huán)修飾到CdSe/ZnS核/殼量子點(diǎn)上，通過鋅離子結(jié)合對(duì)量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的影響可以對(duì)鋅離子進(jìn)行定量檢測(cè)，檢測(cè)下限為2.4 μmol/L[8]。在細(xì)胞內(nèi)外游離鋅離子檢測(cè)中，N-(6-me-thoxy-8-quinolyl)-p-toluene-sulfonamide（TSQ）廣泛用于對(duì)細(xì)胞中的鋅離子熒光成像。Gee等[9]合成了一種新的可見光激發(fā)的鋅離子敏感型熒光探針FluoZin-3，成功用于胰腺β-細(xì)胞分泌鋅離子的檢測(cè)和成像。Tomat等[10]用Zinpyr標(biāo)記的AGT融合蛋白對(duì)活細(xì)胞中的鋅離子進(jìn)行了檢測(cè)。雖然已有的鋅離子熒光探針有很多優(yōu)勢(shì)，但是它們都涉及到復(fù)雜的有機(jī)分子合成過程，成本較高，不利于普及。

S1核酸酶是能夠特異性切割核酸單鏈的核酸酶，對(duì)鋅離子有很強(qiáng)的依賴性，基于此特性發(fā)展了一種基于分子信標(biāo)和S1核酸酶的鋅離子檢測(cè)新方法。該方法操作簡便，不需要昂貴儀器，不涉及復(fù)雜的離子載體合成，對(duì)鋅離子的檢測(cè)下限為120 μmol/L。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

F-4500熒光分光光度計(jì)(Hitachi，日本)；恒溫循環(huán)水浴(Amersham Biosciences公司，美國)；超純水裝置（Elix3，Millipore，U.S.A）。

分子信標(biāo)序列：5'-TAMRA-CAT CTT GGA TTG CAT CAA AAA GAT TAA GAG ACC AAT CCA AGA TG-DABCYL-3'為色譜純化，由大連寶生物（Takara）公司合成與純化；S1核酸酶購買于大連寶生物（Takara）公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鹽酸、硫酸鋅、氯化鈉均為國產(chǎn)分析純。所有溶液均用Milli-Q超純水（18.2 MΩ·cm）配制，實(shí)驗(yàn)中所有配制樣品溶液的水和緩沖溶液均經(jīng)過高溫滅菌處理。

1.2 可行性的考察

取95 μL緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，pH7.4，50 mmol/L NaCl），然后依次加入2 μL分子信標(biāo)（終濃度為100 nmol/L）、2 μL不同濃度ZnSO4鋅離子和1 μL S1核酸酶（終濃度為0.018 U/μL），并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)溶液熒光信號(hào)變化。激發(fā)波長為521 nm、發(fā)射波長為578 nm、激發(fā)狹縫為5 nm、發(fā)射狹縫為5 nm，所有檢測(cè)均在60℃下進(jìn)行。

1.3 Na+濃度的優(yōu)化

取98 μL不同NaCl濃度的緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，pH7.4），加入2 μL分子信標(biāo)，使其終濃度為100 nmol/L，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分子信標(biāo)的背景熒光信號(hào)。

1.4 S1核酸酶濃度的優(yōu)化

每個(gè)待測(cè)的S1核酸酶濃度下設(shè)置一個(gè)檢測(cè)樣品和一個(gè)對(duì)照樣品。

檢測(cè)樣品：取95 μL緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，pH7.4，300 mmol/L NaCl），依次加入2 μL分子信標(biāo)（終濃度為100 nmol/L）、2 μL ZnSO4（終濃度為1 mmol/L）和1 μL不同濃度的S1核酸酶，并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)溶液熒光信號(hào)變化。

對(duì)照樣品：取97 μL緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，pH7.4，300 mmol/L NaCl），依次加入2 μL分子信標(biāo)（終濃度為100 nmol/L）和1 μL不同濃度的S1核酸酶，并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)溶液熒光信號(hào)變化。

依照公式V0=（F1-F0）/t計(jì)算出檢測(cè)樣品和對(duì)照樣品的反應(yīng)初速度（V0）差，其中F0是加入S1核酸酶前分子信標(biāo)的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)1是加入S1核酸酶后反應(yīng)時(shí)間為t的熒光強(qiáng)度，這里t取200 s。

1.5 分子信標(biāo)濃度的優(yōu)化

每個(gè)待測(cè)的分子信標(biāo)濃度下設(shè)計(jì)一個(gè)檢測(cè)樣品和一個(gè)對(duì)照樣品。

檢測(cè)樣品：取95 μL緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，pH7.4，300 mmol/L NaCl），依次加入2 μL不同濃度的分子信標(biāo)、2 μL ZnSO4（終濃度為2 mmol/L）和1μLS1核酸酶（終濃度為0.018U/μL），并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)溶液熒光信號(hào)變化。

對(duì)照樣品：取97 μL緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，pH7.4，300 mmol/L NaCl），依次加入2 μL不同濃度的分子信標(biāo)和1 μL S1核酸酶（終濃度為0.018 U/μL），并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)溶液熒光信號(hào)變化。

計(jì)算出檢測(cè)樣品和對(duì)照樣品的反應(yīng)初速度之差。

1.6 鋅離子的檢測(cè)

取88 μL緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，pH7.4，300 mmol/L NaCl），依次加入5 μL分子信標(biāo)（終濃度為500 nmol/L）、5 μL不同濃度ZnSO4、2 μL S1核酸酶（終濃度為0.045 U/μL），并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)S1核酸酶切割分子信標(biāo)的熒光信號(hào)。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)原理

原理如圖1所示。S1核酸酶特異性切割核酸單鏈，它的活性對(duì)鋅離子有很強(qiáng)的依賴性，溶液中的分子信標(biāo)維持莖環(huán)結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)與熄滅基團(tuán)靠近，熒光被熄滅，加入S1核酸酶可以切割分子信標(biāo)的環(huán)部，導(dǎo)致熒光基團(tuán)和熄滅基團(tuán)遠(yuǎn)離，溶液中鋅離子濃度越高，S1核酸酶切割分子信標(biāo)速率越快，熒光增強(qiáng)速度越快，通過建立熒光增強(qiáng)的速率和鋅離子濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以定量溶液中的鋅離子濃度。

圖1 基于分子信標(biāo)和S1核酸酶檢測(cè)鋅離子原理圖Fig.1 Schematic diagram of Detection of zinc Based on molecular beacon and S1 nuclease

2.2 可行性考察

在不同鋅離子條件下用S1核酸酶對(duì)分子信標(biāo)進(jìn)行了切割，如圖2所示，隨著鋅離子濃度增加，S1酶切割分子信標(biāo)的速率加快，說明該方法可以用來檢測(cè)鋅離子濃度。但是分子信標(biāo)的背景熒光較高，影響了檢測(cè)效果，因此，后面需要對(duì)檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化。

圖2 不同鋅離子條件下S1核酸酶切割分子信標(biāo)熒光圖(a)0 mmol/L鋅離子;(b)0.4 mmol/L鋅離子Fig.2 The real-time fluorescence scan curve of S1 nuclease cut molecular beacon with different zinc concentration(a)0 mmol/L zinc;(b)0.4 mmol/L zinc

2.3 Na+濃度的優(yōu)化

分子信標(biāo)需要在一定的離子強(qiáng)度條件下才能形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，一般緩沖體系中會(huì)加入Mg2+。由于鋅離子是一種二價(jià)陽離子，所以檢測(cè)體系中沒有引入Mg2+和其它二價(jià)陽離子，只用Na+調(diào)節(jié)緩沖體系的離子強(qiáng)度，因此對(duì)Na+濃度進(jìn)行了優(yōu)化，不同Na+濃度下分子信標(biāo)的熒光掃描結(jié)果如圖3所示，隨著Na+濃度的增加，分子信標(biāo)的背景熒光不斷降低，但為了減少陽離子對(duì)檢測(cè)的干擾，選擇可以穩(wěn)定分子信標(biāo)構(gòu)象的最低的離子強(qiáng)度，如圖3所示，當(dāng)Na+濃度達(dá)到300 mmol/L時(shí)，分子信標(biāo)的背景熒光非常低，并且迅速達(dá)到平衡，說明300 mmol/L的NaCl可以很好地穩(wěn)定分子信標(biāo)的構(gòu)象，因此選擇300 mmol/L為檢測(cè)時(shí)的Na+濃度。

圖3 Na+濃度對(duì)分子信標(biāo)背景熒光的影響圖中曲線1～4的NaCl濃度分別依次為300、200、150、50 mmol/LFig.3 The fluorescence of molecular beacon with different Na+concentration From 1 to 4,the concentration of NaCl is 300,200,150,50 mmol/L

2.4 S1核酸酶濃度的優(yōu)化

S1核酸酶濃度越大，切割分子信標(biāo)速度越快，但是產(chǎn)生的背景越高，因此需要對(duì)S1核酸酶濃度優(yōu)化其用量，如圖4所示，圖4A-D為不同S1核酸酶濃度下切割分子信標(biāo)的實(shí)時(shí)熒光圖，曲線1和2的鋅離子濃度分別為1和0 mmol/L，圖4E為計(jì)算出來的不同濃度S1核酸酶的反應(yīng)初速度增加值，可以看出S1核酸酶濃度為0.045 U/μL時(shí)，加入ZnSO4反應(yīng)初速率增加最大，因此選擇0.045 U/μL的S1核酸酶為檢測(cè)的S1核酸酶濃度。

圖4 S1核酸酶濃度的選擇（A-D）酶切實(shí)時(shí)熒光圖，S1核酸酶濃度從A到D分別為0.018、0.045、0.09、0.18 U/μL，曲線1和2的Zn2+濃度分別為1和0 mmol/L；（E）酶切反應(yīng)初速度增加值Fig.4 The selection of the concentration of S1 nuclease(A-D)The real-time fluorescence scan of hydrolize,from A to D,the concentration of S1 nuclease is 0.018,0.045,0.09,0.18 U/μL,respectively.Curve 1 and 2 indicate 1 and 0 mmol/L Zn2+;(E)The initial increased reaction velocity

2.5 分子信標(biāo)濃度的優(yōu)化

圖5 分子信標(biāo)濃度的選擇（A-D）酶切實(shí)時(shí)熒光曲線，MB濃度從A到D依次為50、100、150、500 nmol/L，曲線1和2的Zn2+濃度分別為2和0 mmol/L；(E)酶切反應(yīng)初速度增加值Fig.5 The selection of the concentration of molecular beacon（A-D）The real-time fluorescence scan of hydrolize,from A to D,the concentration of molecular beacon is 50,100,150,500 nmol/L,curve 1 and 2 indicate 2 and 0 mmol/L Zn2+;(E)The increased initial reaction velocity

分子信標(biāo)濃度太低，檢測(cè)信號(hào)就會(huì)不明顯，濃度過高，背景熒光也會(huì)上升，且提高了檢測(cè)成本，因此對(duì)分子信標(biāo)濃度進(jìn)行了優(yōu)化。圖5A-D為S1核酸酶切割不同濃度分子信標(biāo)的實(shí)時(shí)熒光掃描圖，曲線1和2的鋅離子濃度分別為1和0 mmol/L，隨著分子信標(biāo)濃度增加，信號(hào)和背景熒光均增加，兩者之差也增加，圖5E為計(jì)算出來的S1核酸酶切割不同濃度分子信標(biāo)的反應(yīng)初速率增加值，可以看出隨著分子信標(biāo)濃度不斷增加，S1核酸酶切割的反應(yīng)初速率增加值不斷增大，當(dāng)分子信標(biāo)濃度為500 nmol/L時(shí)，S1核酸酶切割的速率增加值達(dá)到0.803，此時(shí)絕對(duì)熒光值比較適中，并且考慮到檢測(cè)成本，不再選擇更高的分子信標(biāo)濃度。因此選擇500 nmol/L的分子信標(biāo)為檢測(cè)時(shí)的分子信標(biāo)濃度。

2.6 鋅離子的定量檢測(cè)

用分子信標(biāo)和S1核酸酶定量檢測(cè)鋅離子的結(jié)果如圖6所示。其中，圖6A為鋅離子檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光圖，隨著鋅離子濃度增加，熒光增強(qiáng)的速度加快，不加鋅離子時(shí)，S1核酸酶仍對(duì)分子信標(biāo)有一定的酶切作用，這限制了鋅離子的檢測(cè)下限進(jìn)一步降低。該背景可能是S1核酸酶的作用不是絕對(duì)依賴鋅離子造成的。圖6B為鋅離子濃度和酶切反應(yīng)初速度繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，顯示該方法對(duì)鋅離子檢測(cè)的檢測(cè)下限為120 μmol/L。

圖6 用分子信標(biāo)和S1核酸酶檢測(cè)鋅離子(A)用分子信標(biāo)和S1核酸酶檢測(cè)不同濃度鋅離子的熒光時(shí)間掃描曲線，從上到下，鋅離子濃度依次為2.0、1.5、1.0、0.50、0.25、0.12、0 mmol/L；(B)檢測(cè)不同濃度鋅離子的反應(yīng)初速度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Detection of zinc with molecular beacon and S1 nuclease(A)The real-time fluorescence scan of different concentration of zinc,from up to down,the concentration of zinc is 2.0,1.5,1.0,0.50,0.25,0.12,0 mmol/L;(B)The initial velocity of different concentration of zinc

3 結(jié)論

借助于S1核酸酶特異性切割單鏈DNA，其活性對(duì)鋅離子濃度有依賴性，發(fā)展了一種基于分子信標(biāo)和S1核酸酶的鋅離子檢測(cè)新方法，該方法操作簡便，無需昂貴儀器，也不涉及復(fù)雜的離子載體合成，對(duì)鋅離子的檢測(cè)下限為120 μmol/L。

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