魚腥草中有效化學(xué)成分對(duì)N- 亞硝化反應(yīng)的阻斷作用

郭艷華，邱紅心，張遠(yuǎn)方，萬 昆，范劍虹

(江漢大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢 430056 )

魚腥草中有效化學(xué)成分對(duì)N- 亞硝化反應(yīng)的阻斷作用

郭艷華，邱紅心，張遠(yuǎn)方，萬 昆，范劍虹

(江漢大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢 430056 )

采用紫外-可見光譜法和氣質(zhì)聯(lián)用色譜法對(duì)魚腥草中有效化學(xué)成分(黃酮類化合物、抗壞血酸(VC)、多酚、多糖、甲基正壬酮)進(jìn)行測定，并研究有效化學(xué)成分對(duì)N-亞硝化反應(yīng)阻斷能力的關(guān)系。結(jié)果表明：不同產(chǎn)地魚腥草中各有效化學(xué)成分含量不存在顯著性差異；不同干燥時(shí)間魚腥草中，隨著干燥時(shí)間的增加，除總糖含量逐漸增大外，其他有效化學(xué)成分均呈下降趨勢。在干燥和新鮮魚腥草中，VC、黃酮和總酚含量均與阻斷率呈正相關(guān)的關(guān)系，甲基正壬酮和多糖含量與阻斷率不存在相關(guān)性。結(jié)論：魚腥草能阻斷N-亞基化合物的內(nèi)源性合成，且影響N-亞硝化反應(yīng)的有效化學(xué)成分為黃酮、VC和多酚。

魚腥草；N-亞硝化反應(yīng)；黃酮；多酚；抗壞血酸；阻斷作用

近些年國內(nèi)外對(duì)天然植物中有效化學(xué)成分的提取、分離、測定和應(yīng)用的研究已成為熱門課題[1-4]，天然有效化學(xué)成分有各種重要的生物活性，如抗氧化活性、抗癌活性等。N-二甲基亞硝胺化合物可能與人類某些癌癥有關(guān)，目前癌癥已成為威脅人類生命的最大殺手，其中N-二甲基亞硝胺化合物是當(dāng)前最令人關(guān)注的化學(xué)致癌物之一。從防癌角度出發(fā)，采用阻斷N-二甲基亞硝胺合成或清除合成的N-二甲基亞硝胺前體是防癌的有效途徑。近些年對(duì)天然植物阻斷N-二甲基亞硝胺的合成已有研究[5-6]，而對(duì)魚腥草中有效化學(xué)成分影響N-亞硝化反應(yīng)的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。魚腥草為三白草科蕺菜屬植物蕺菜的全草，具有清熱解毒、消腫排膿、利尿涌淋的功效。其主要有效化學(xué)成分含有豐富的黃酮類化合物、抗壞血酸、多酚、多糖，揮發(fā)油(主要成分為甲基正壬酮)等，其生物活性有許多應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)將對(duì)魚腥草中影響N-亞硝化反應(yīng)的有效化學(xué)成分進(jìn)行初步探討，旨在為藥食兩用植物魚腥草的進(jìn)一步綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮魚腥草購于武漢市石牌嶺菜市場；干燥魚腥草(產(chǎn)于湖北、江蘇、江西、廣東、廣西等，為剛上市

產(chǎn)品)購于武漢市各中藥店。

蕓香苷(蘆丁)為生化試劑、2-十一烷酮(甲基正壬酮)、正十一烷 Sigma公司；其他試劑均為分析純。

UV-2401紫外可見分光光度計(jì) 日本島津公司；721可見分光光度計(jì)、PHS-2c型精密酸度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠； QP2010氣質(zhì)聯(lián)用儀 美國惠普公司。

1.2 方法

1.2.1 魚腥草中有效化學(xué)成分的提取

魚腥草中抗壞血酸和多糖含量測定液的制備：稱取鮮魚腥草折合的干質(zhì)量和干燥魚腥草各10g加入500mL蒸餾水，70℃熱水浸提70min，離心過濾10min，去濾渣，得濾液為魚腥草提取液Ⅰ，保存待測定。

魚腥草中總黃酮和總酚含量測定液的制備：用60%的乙醇加熱回流法提取，提取時(shí)間70min、溫度70℃、固液比1:50，稱取鮮魚腥草折合的干質(zhì)量和干燥魚腥草各10g進(jìn)行提取，離心過濾10min，去濾渣。將濾液用聚酰胺新樹脂吸附法分離提純，得魚腥草提取液Ⅱ，保存待測定。

魚腥草中甲基正壬酮含量測定液的制備：稱取鮮魚腥草折合的干質(zhì)量和干燥魚腥草各10g，加入500mL蒸餾水，連接揮發(fā)油測定器，自測定器上部分加水充滿刻度部分，再加醋酸乙脂4mL，連接回流冷凝管，加熱回流3h，停止加熱，放置室溫分取醋酸乙脂層的溶液，得供試品溶液Ⅲ。

魚腥草對(duì)亞硝胺阻斷率測定液的制備：將魚腥草提取液Ⅰ、魚腥草提取液Ⅱ、供試品溶液Ⅲ各取等量混合，得魚腥草提取液Ⅳ，冰箱保存待測定。

1.2.2 亞硝胺阻斷率測定[7]

取魚腥草提取物Ⅳ5mL于50mL容量瓶中，加入pH 3.0的檸檬酸鈉鹽緩沖溶液25mL，1mmol/L NaNO2溶液2.5mL，1mmol/L二甲胺溶液2.5mL，再用蒸餾水定容至刻度，在37℃下恒溫1h。用移液管吸取1.0mL上述N-二甲基亞硝胺的測定液加到7cm2的培養(yǎng)皿中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%Na2CO3溶液0.5mL，于黑布遮蓋的紫外分析儀上照15min，紫外燈離液面15cm，取出后加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%對(duì)氨基苯磺酸溶液1.5mL，再加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的α-萘胺1.5mL，0.5mL蒸餾水，然后搖勻放置15min后，用分光光度計(jì)在525nm波長處測吸光光度。同時(shí)用60%的乙醇和乙酸乙脂等量混合的溶液作空白，并計(jì)算阻斷率。

式中：A0為加入對(duì)應(yīng)濃度浸提劑的空白吸光度；Ax為加入各組提取液時(shí)的吸光度。

1.2.3 魚腥草中有效化學(xué)成分的測定方法

1.2.3.1 魚腥草中抗壞血酸(VC)的測定

VC的測定方法采用紫外分光光度快速測定法[8]，得標(biāo)準(zhǔn)方程式為：

Y= 0.00547+0.04458X(R2= 0.9979)。

式中：X為抗壞血酸質(zhì)量濃度/(μg/mL)；Y為溶液與堿處理樣品兩者吸光度之差ΔA。取樣品溶液代替抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液實(shí)驗(yàn)，按標(biāo)準(zhǔn)方程式計(jì)算VC 的含量。

1.2.3.2 魚腥草中多糖含量的測定

用葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法測定魚腥草中多糖的含量[9]，回歸方程為：Y=-0.13250+1.2000X (R2=0.99695)。式中：Y為吸光度，X為多糖含量(mg/mL)。

1.2.3.3 魚腥草中總黃酮含量的測定

利用硝酸鋁-亞硝酸鈉光度法[10-12]，得蘆丁質(zhì)量濃度c (mg/mL)與吸光度A的關(guān)系曲線的回歸方程：A=10.31268c-0.003857，相關(guān)系數(shù)R2為0.999839。按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定提取物中黃酮含量，然后換算為樣品中的黃酮含量。

1.2.3.4 魚腥草中總酚含量的測定

利用沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和Folin試劑法測定沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線[13-14]，制作標(biāo)準(zhǔn)方程。以吸光度A為橫坐標(biāo)，總酚質(zhì)量濃度c(mg/mL)為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程c=7.9234A-0.0157(R2=0.9999)。按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測定提取物中總酚含量，然后換算為樣品中的總酚含量。

1.2.3.5 魚腥草中甲基正壬酮含量的測定

采用氣質(zhì)聯(lián)用色譜法測定[15]，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。回歸方程為Y=16.1563X-0.03465(R2= 0.9998)，甲基正壬酮在0.0361～0.0842mg/mL范圍呈良好線性關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種魚腥草中有效化學(xué)成分與阻斷率的關(guān)系

表1 不同產(chǎn)地魚腥草中有效化學(xué)成分與阻斷能力的關(guān)系Table 1 Relationship between chemical components inHouttuynia cordatafrom different areas and blocking capability toN-nitrosation reaction

由表1可知，產(chǎn)地不同的魚腥草所含的各有效化學(xué)成分的含量不同，對(duì)N-亞硝化反應(yīng)合成的阻斷率大小順序?yàn)椋汉保窘鳎窘K＞廣東＞廣西。經(jīng)方差分析表明，各樣品相同化學(xué)成分間不存在顯著性差異，對(duì)N-二甲基亞硝胺合成的阻斷率也不存在顯著性差異，其阻斷率均在80%～90%之間。

圖1 魚腥草中VC含量與阻斷能力的關(guān)系Fig.1 Relationship between the content of vitamin C inHouttuynia cordataand blocking capability toN-nitrosation reaction

圖2 阻斷率隨總糖含量的變化Fig.2 Relationship between the content of total sugars inHouttuynia cordataand blocking capability toN-nitrosation reaction

圖3 魚腥草中黃酮含量與阻斷能力的關(guān)系Fig.3 Relationship between the content of flavonoids inHouttuynia cordataand blocking capability toN-nitrosation reaction

圖4 魚腥草中總酚含量與阻斷能力的關(guān)系Fig.4 Relationship between the content of total polyphenols inHouttuynia cordataand blocking capability toN-nitrosation reaction

圖5 阻斷率隨甲基正壬酮含量的變化Fig.5 Relationship between the content of 2-undecenal inHouttuynia cordataand blocking capability toN-nitrosation reaction

由圖1～5可知，VC含量、黃酮含量、總酚含量與阻斷率呈正相關(guān)的關(guān)系，3種有效化學(xué)成分的含量相差不大，總酚含量略高，這說明魚腥草中復(fù)雜的有效化學(xué)成分產(chǎn)生阻斷作用是其特點(diǎn)，即本研究提示魚腥草中酚類物質(zhì)在阻斷N-二甲基亞硝胺上所起的作用較大。魚腥草中總糖含量、甲基正壬酮含量與阻斷率沒有明確的相關(guān)性關(guān)系。

2.2 不同干燥時(shí)間魚腥草中有效化學(xué)成分與阻斷率的關(guān)系

將新鮮魚腥草洗凈，在溫度25℃左右自然干燥，樣品以采樣當(dāng)天表面水分晾干開始為干燥0d試樣。此后在干燥2、4、8、18、32d中分別稱取與0d樣品等量(干物質(zhì))樣品，重復(fù)同樣實(shí)驗(yàn)操作，測定各有效化學(xué)成分和阻斷率，平行測定3次，取平均值。

表2 不同干燥時(shí)間魚腥草中有效化學(xué)成分與阻斷能力的關(guān)系Table 2 Relationship between chemical components inHouttuynia cordatawith various drying time and blocking capability toN-nitrosation reaction

由表2可知，魚腥草在干燥過程中，隨著干燥時(shí)間的增加，主要有效化學(xué)成分VC、黃酮、總酚、甲基正壬酮都表現(xiàn)出逐漸減少的趨勢，其中VC、黃酮、總酚下降程度較大，甲基正壬酮下降趨勢較小，可能由于部分魚腥草素在干燥過程中分解后氧化和脫羧轉(zhuǎn)化為甲基正壬酮。而總糖則相反，呈上升趨勢，是由于魚腥草中的纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶等酶將結(jié)構(gòu)性碳水化合物轉(zhuǎn)變成可溶性糖類。隨著干燥時(shí)間的延長，阻斷率與VC、黃酮、總酚一樣也逐漸降低，且降低程度都很明顯，阻斷率與這三種有效化學(xué)成分成正相關(guān)。甲基正壬酮隨不同干燥時(shí)間延長，含量緩慢減

少，而阻斷率則減少較快，說明無明顯相關(guān)性?？偺桥c阻斷率相反變化，說明不同干燥時(shí)間魚腥草中總糖對(duì)阻斷N-二甲基亞硝胺的合成沒有相關(guān)性。

3 結(jié) 論

魚腥草中含有的有效化學(xué)成分主要有黃酮類化合物、抗壞血酸、多酚、多糖，揮發(fā)油(主要成分為甲基正壬酮)，多糖含量最大，多酚含量與黃酮類化合物、抗壞血酸較高。甲基正壬酮含量相對(duì)以上有效化學(xué)成分低。不同產(chǎn)地新上市的干燥魚腥草及湖北產(chǎn)鮮魚腥草在干燥過程中的有效化學(xué)成分含量與阻斷N-二甲基亞硝胺合成的關(guān)系為：阻斷率與魚腥草中VC、黃酮、總酚含量成正相關(guān)關(guān)系；甲基正壬酮與阻斷率無明顯相關(guān)性，魚腥草中總糖對(duì)其阻斷N-二甲基亞硝胺的合成無相關(guān)性。結(jié)果顯示：魚腥草中阻斷N-二甲基亞硝胺合成的有效化學(xué)成分是VC、黃酮和多酚，說明了魚腥草能阻斷人體N-二甲基亞硝胺化合物的內(nèi)源性合成，提示魚腥草有助于人類癌癥的病因性預(yù)防，有待于進(jìn)一步開發(fā)利用其中防癌抗癌的有效化學(xué)成分。

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Effect of Chemical Components in Houttuynia cordata on the Blocking of N-Nitrosation Reaction

GUO Yan-hua，QIU Hong-xin，ZHANG yuan-fang，WAN Kun，F(xiàn)AN Jian-hong
(School of Chemistry and Enviornmental Engineering, Jianghan University, Wuhan 430056, China )

Objective: To explore the effect of chemical components in Houttuynia cordata on the blocking of N-nitrosation reaction. Methods: UV-visible spectrum and gas chromatography-mass spectrometry methods were used to determine the chemical components including flavonoids, vitamin C, polyphenols, polysaccharides and 2-undecenal in Houttuynia cordata for exploring their blocking capabilities to N-nitrosation reaction. Results: The contents of chemical components in Houttuynia cordata from different areas did not exhibit an obvious difference. Although the content of total sugar exhibited an increase trend, other chemical components exhibited a declined trend during the extension of drying time. The contents of vitamin C, flavonoids and total polyphenols were positively correlated with the blocking rate of N-nitrosation reaction. However, the contents of 2-undecenal and total sugar had no correlation with the blocking rate. Conclusion: Houttuynia cordata can prevent human endogenous nitro-compound synthesis. The major components for influencing N-nitrosation reaction were flavonoids, vitamin C and polyphenols.

Houttuynia cordata；N-nitrosation reaction；flavonoids；polyphenols；vitamin C；locking effect

Q946

A

1002-6630(2010)23-0072-04

2010-07-03

湖北省教育廳科技項(xiàng)目(B20083404)

郭艷華(1960—)，女，副教授，學(xué)士，主要從事天然產(chǎn)物的提取、分析應(yīng)用研究。E-mail：jdyhyh@163.com