響應(yīng)面法優(yōu)化Aspergillus niger X-6發(fā)酵生產(chǎn)菊粉酶工藝的研究

羅登林，袁海麗，曾小宇，劉建學(xué)

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003)

響應(yīng)面法優(yōu)化Aspergillus niger X-6發(fā)酵生產(chǎn)菊粉酶工藝的研究

羅登林，袁海麗，曾小宇，劉建學(xué)

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003)

為提高Aspergillus niger X-6發(fā)酵生產(chǎn)菊粉酶的產(chǎn)率，運(yùn)用Plackett-Burmen方法對(duì)麩皮、菊粉、蛋白胨、酵母膏添加量和發(fā)酵時(shí)間、溫度、pH值、接種量8個(gè)影響因素進(jìn)行考察，篩選出麩皮添加量、發(fā)酵時(shí)間和pH值為3個(gè)顯著影響因素，然后采用Box-Behnken中心組合和響應(yīng)面法對(duì)上述3個(gè)因素進(jìn)行產(chǎn)酶條件的進(jìn)一步優(yōu)化，建立菊粉酶產(chǎn)率的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，并分析模型的有效性與因子間的交互作用。結(jié)果表明：黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)菊粉酶的優(yōu)化工藝參數(shù)為：麩皮添加量4.64%、發(fā)酵時(shí)間81.5h、pH6.0。在此條件下，產(chǎn)酶活力達(dá)20.42U/mL，與優(yōu)化前相比提高了30.81%。

菊粉酶；Aspergillus niger X-6；發(fā)酵；響應(yīng)面法

菊粉酶(inulinase)，學(xué)名β-2,1-D-果聚糖酶，是一類(lèi)能夠水解菊粉的酶的總稱(chēng)[1]。利用菊粉酶水解菊粉可生產(chǎn)功能性低聚果糖和超高果糖漿，它們具有低熱量、抗齲性、調(diào)控血糖等多種生理功能；同時(shí)該方法生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，產(chǎn)物得率高[2-6]。在上世紀(jì)70年代初，國(guó)外就開(kāi)始選育高產(chǎn)菊粉酶的微生物來(lái)水解菊粉生產(chǎn)超高果糖漿，目前相關(guān)核心技術(shù)被比利時(shí)RAFTI和WARCOING及荷蘭COSUN三家公司所壟斷[7-8]。我國(guó)對(duì)菊粉酶的研究起于上世紀(jì)90年代，由于重視程度不夠，相關(guān)研究進(jìn)展比較緩慢[9-10]。近年來(lái)隨著人們生活水平的提高和健康意識(shí)的增強(qiáng)，以及我國(guó)有著廣泛種植可用于生產(chǎn)菊粉的原料——菊芋(俗名洋姜)的優(yōu)勢(shì)，因此，關(guān)于如何提高菊粉酶產(chǎn)率的研究正日益受到人們的重視。

本實(shí)驗(yàn)以從菊芋生長(zhǎng)的根際土壤中經(jīng)過(guò)初篩、分離純化、復(fù)篩和微波誘變后得到的一株Aspergillus niger X-6為菌種，運(yùn)用Plackett-Burmen方法對(duì)影響產(chǎn)菊粉酶的因素進(jìn)行分析，然后采用Box-Behnken中心組合和響

應(yīng)面法對(duì)相關(guān)顯著因素進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化，以期獲得Aspergillus niger X-6發(fā)酵生產(chǎn)菊粉酶的優(yōu)化工藝，提高菊粉酶的產(chǎn)率。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Factors and levels in Plackett-Burman design

1 材料與方法

1.1 菌種

從菊芋生長(zhǎng)的根際土壤中經(jīng)過(guò)初篩、分離純化和復(fù)篩后，鑒定為Aspergillus niger，然后對(duì)復(fù)篩所得的菌株進(jìn)行微波誘變，得到一株高產(chǎn)菊粉酶的菌株，定義為Aspergillus niger X-6。

1.2 菊粉

粗制菊粉，用于培養(yǎng)基的配制；精制菊粉(菊粉含量＞92%，用于測(cè)酶活力的底物)由昆山拓豐貿(mào)易有限公司提供；其他試劑均為分析純。

1.3 粗制菊粉的制備

用超聲波輔助水溶液提取菊粉，具體工藝參數(shù)為：總提取時(shí)間10min、超聲輻照方式15s/6s、超聲功率750W、超聲頻率20kHz、料液比1:30.15、提取溫度40℃，然后對(duì)所得提取液依次進(jìn)行抽濾、真空濃縮、熱風(fēng)干燥(50℃)和粉碎，得到粗制菊粉(含水量5.63%)。

1.4 培養(yǎng)基

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、蛋白胨4%、粗制菊粉2%、酵母膏0.4%、NaCl 0.5%、K2HPO4· 3H2O 0.3%，初始pH6.5，接種量5%。

1.5 菊粉酶活力的測(cè)定

取0.5mL適當(dāng)稀釋的酶液，加入4mL、2%的精制菊粉溶液(0.1mol/L、pH4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液配制)中，54℃保溫10min，沸水浴10min滅活終止反應(yīng)(在完全相同的條件下滅活酶底物對(duì)照)，快速冷卻后，測(cè)定還原糖產(chǎn)量[11-12]。菊粉酶活力定義為在上述條件下每分鐘產(chǎn)生1μmol還原糖的酶量為1個(gè)菊粉酶活力單位(μmol/ (min·mL))。

1.6 Plackett-Burmen試驗(yàn)

選用N=12的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)麩皮添加量、粗制菊粉添加量、蛋白胨添加量、酵母膏添加量、發(fā)酵時(shí)間、溫度、p H值、接種量8個(gè)影響菊粉酶活力的相關(guān)因素進(jìn)行研究[13]。每個(gè)因素取兩個(gè)水平：低水平“-1”和高水平“1”，“1”為“-1”的1.5～2倍，另設(shè)兩個(gè)空白項(xiàng)對(duì)應(yīng)表中的X3和X9，以考察試驗(yàn)誤差。評(píng)價(jià)指標(biāo)為菌株發(fā)酵后的酶活力(U/mL)。 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼見(jiàn)表1。

1.7 顯著因素的中心點(diǎn)試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，確定麩皮添加量、發(fā)酵時(shí)間、起始pH值為影響評(píng)價(jià)指標(biāo)的顯著因素。分別對(duì)這3個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，獲得每個(gè)因素的最佳產(chǎn)酶水平。

1.8 響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取麩皮添加量(X1)、發(fā)酵時(shí)間(X2)和初始pH值(X3)3個(gè)因素與菌株發(fā)酵產(chǎn)菊粉酶活力進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。采用Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并運(yùn)用SAS9.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，預(yù)測(cè)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的最優(yōu)工藝參數(shù)并進(jìn)行驗(yàn)證。Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼見(jiàn)表2。

表2 Box-Benhnken試驗(yàn)因素水平及編碼Table 2 Factors and levels in Box-Benhnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Plackett-Burman design layout and experimental results

Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，表中1～12分別

代表12組實(shí)驗(yàn)，按照設(shè)計(jì)好的方案進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)并最終測(cè)得其菊粉酶活力，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。運(yùn)用SAS9.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表3進(jìn)行方差分析，其結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)方差分析Table 4 Variance analysis for Plackett-Burman experimental results

采用SAS軟件對(duì)表3的酶活力數(shù)據(jù)進(jìn)行逐步回歸分析，得到酶活力為響應(yīng)值的最優(yōu)多元次回歸方程：

Y=9.220833-1.165833X1-0.444167X2+0.495833X3+ 0.5975X4+1.080833X5+0.3625X6-0.559167X7+2.620833X8-0.1075X9-0.300833X10

由表4方差分析結(jié)果表明，所得的回歸方程達(dá)到顯著(P=0.038172)，決定系數(shù)R2=0.9998，說(shuō)明99.98%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性可以用此回歸模型來(lái)解釋。在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的水平范圍內(nèi)X1、X5和X8對(duì)菊粉酶活力均有顯著影響(P＜0.05)，它們對(duì)菊粉酶活力的影響水平可以達(dá)到98%左右，其他因素在所考察的水平范圍內(nèi)對(duì)酶活力的影響不顯著。因此，對(duì)黑曲霉X-6發(fā)酵生產(chǎn)菊粉酶最主要的影響因子為麩皮添加量(X1)、發(fā)酵時(shí)間(X5)和初始pH值(X8)，選取他們?yōu)檠芯繉?duì)象，作進(jìn)一步的優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

麩皮添加量、發(fā)酵時(shí)間、pH值的單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，選擇麩皮添加量4%、發(fā)酵時(shí)間84h、pH6.0作為試驗(yàn)的中心點(diǎn)。采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)3個(gè)顯著因素進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。根據(jù)表2的因素和水平，以X1、X2、X3為自變量，將影響不顯著的因素固定在上述試驗(yàn)中的低水平，以最終測(cè)得的酶活力為響應(yīng)值(Y)，試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表5。表5中1～15分別代表15組實(shí)驗(yàn)，其中13～15為中心點(diǎn)試驗(yàn)，重復(fù)3次，用以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。

表5 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Box-Benhnken design layout and experimental results

通過(guò)SAS9.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表5的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，獲得菊粉酶活力(Y)對(duì)自變量麩皮添加量X1、發(fā)酵時(shí)間X2、初始pH值X3的二次多項(xiàng)回歸模型方程如下：

Y=20.08333+0.4475X1-0.63875X2+1.63125X3-0.355417X12-0.195X1X2-0.295X1X3-2.137917X22-0.8775X2X3-6.957917X32

表6 方差分析表Table 6 Variance analysis for Box-Benhnken experimental results

由表6可知，方程失擬項(xiàng)不顯著(P=0.100318＞0.05)，說(shuō)明方程不失擬。方程模型極顯著(P=0.0001＜0.01)，說(shuō)明方程能夠很好的擬和試驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)，軟件分析得到模型的決定系數(shù)R2=0.9962，說(shuō)明菌種發(fā)酵產(chǎn)菊粉酶活力所考察的3個(gè)因素中，僅有0.38%試驗(yàn)數(shù)據(jù)

的變異性不能由該模型來(lái)解釋?zhuān)砻髟撃Ｐ湍軌蚝芎玫胤从吃囼?yàn)的真實(shí)情況。由二次多項(xiàng)回歸模型方程得知，方程應(yīng)變量與全體自變量之間線(xiàn)性關(guān)系明顯，回歸方程的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)的均方差和系數(shù)都較大，而交互項(xiàng)系數(shù)較小，說(shuō)明響應(yīng)面分析所選的3個(gè)因素之間的交互效應(yīng)較小。從方差分析表還可以看出，方程的一次項(xiàng)極顯著，其中X1項(xiàng)顯著，X2、X3項(xiàng)極顯著；方程的二次項(xiàng)X22、X32項(xiàng)極顯著；方程的交互項(xiàng)顯著，其中X2X3項(xiàng)極顯著，說(shuō)明發(fā)酵時(shí)間(X2)與初始pH值(X3)對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶有明顯的交互作用。

2.2.2 最優(yōu)響應(yīng)值分析

運(yùn)用SAS9.0軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行規(guī)范性分析，尋找最優(yōu)響應(yīng)區(qū)。回歸模型存在穩(wěn)定點(diǎn)，Y的最大估計(jì)值為20.38，穩(wěn)定點(diǎn)(X1，X2，X3)為(0.63671，-0.20233，0.011648)。這說(shuō)明：X1(麩皮添加量)的最佳范圍在4.64%左右，X2(發(fā)酵時(shí)間)的最佳范圍在81.57h左右，X3(pH值)的最佳范圍在6.01左右。

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面分析得到菌種發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳工藝參數(shù)為：麩皮添加量4.64%、發(fā)酵時(shí)間81.57h、起始pH6.01。在此條件下，菌種產(chǎn)菊粉酶活力達(dá)20.38U/mL。為了驗(yàn)證響應(yīng)面分析的可靠性，結(jié)合實(shí)際試驗(yàn)條件，選定麩皮添加量4.64%、發(fā)酵時(shí)間81.5h、初始pH6.0，其他不顯著因子條件不變，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過(guò)3次平行試驗(yàn)，測(cè)得菌種發(fā)酵產(chǎn)菊粉酶實(shí)際酶活力的平均值為20.42U/mL，與理論預(yù)測(cè)值20.38U/mL接近，相對(duì)誤差為0.196%，說(shuō)明該回歸模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性很高。

3 結(jié) 論

利用P la ck e tt-B u r man試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察影響Aspergillus niger X-6發(fā)酵生產(chǎn)菊粉酶的8個(gè)相關(guān)因素，包括：麩皮添加量、菊粉添加量、蛋白胨添加量、酵母膏添加量、發(fā)酵時(shí)間、溫度、初始pH值和接種量，從中篩選出麩皮添加量、發(fā)酵時(shí)間、pH值3個(gè)對(duì)菌種發(fā)酵產(chǎn)酶具有顯著影響的因素(P＜0.05)。

在Plackett-Burman試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)麩皮添加量、發(fā)酵時(shí)間、初始pH值3個(gè)顯著因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，建立了菊粉酶產(chǎn)率的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，分析了模型的有效性與因子間的交互作用，得到了Aspergillus niger X-6發(fā)酵生產(chǎn)菊粉酶的優(yōu)化工藝參數(shù)為：麩皮添加量4.64%、發(fā)酵時(shí)間81.5h、pH6.0。在此條件下，菌種產(chǎn)菊粉酶活力達(dá)20.42U/mL，與優(yōu)化前相比提高了30.81%。

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Optimization of Lnulinase Fermentation by Aspergillus niger X-6 Using Response Surface Methodology

LUO Deng-lin，YUAN Hai-li，ZENG Xiao-yu，LIU Jian-xue
(College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China)

The objective of this study was to obtain the optimum conditions for Aspergillus niger X-6 fermentation to improve inulinase yield. The effects of the amounts of wheat bran, inulin, peptone and yeast extract in the fermentation medium, fermentation time and temperature, pH, and inoculum size on inulinase yield were evaluated using Plackett-Burmen design. Inulinase yield was significantly influenced by the amount of wheat bran addition, fermentation time and pH. Subsequently, the optimization of the three factors was conducted using Box-Behnken experimental design and response surface methodology, in which, a quadratic polynomial model for inulinase yield was established. The optimal fermentation conditions for inulinase prodtion were determined to be: the amount of wheat bran addition, 4.64%; fermentation time, 81.5 h; and initial mdedim pH 6.0. Under these conditions, the yield of inulinase reached 20.42 U/mL, 30.81% higher than that before optimization.

inulinase；Aspergillus niger X-6；fermentation；response surface methodology

TS201.2

A

1002-6630(2010)23-0138-04

2010-03-30

河南省教育廳科技攻關(guān)項(xiàng)目(2008B550002)；河南科技大學(xué)SRTP項(xiàng)目(154)

羅登林(1976—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品深加工及生物化工技術(shù)。E-mail：luodenglin@sohu.com