徐國前，張振文,2,*，郭安鵲,2，房玉林,2，欒麗英

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100)

微量、快速測定葡萄與葡萄酒總酚

徐國前1，張振文1,2,*，郭安鵲1,2，房玉林1,2，欒麗英1

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100)

基于Folin-Ciocalteu分光光度法的原理，借助微量移液器和微波處理，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立一種新的微量、快速測定葡萄與葡萄酒總酚含量的方法。實(shí)驗(yàn)得到體系的最佳反應(yīng)條件為0.1mL測試樣品，0.1mL 1mol/L Folin-Ciocalteu試劑和0.8mL 60g/L Na2CO3溶液，在微波爐的中檔下處理20s后測定765nm波長處的吸光度。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在質(zhì)量濃度1～50mg/L范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系(R2=0.9996)。對葡萄皮與葡萄酒進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)的平均回收率分別為98.1%和97.2%，精密度(n=9)測定相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.40%和1.01%。該方法不但量微、快速，而且操作簡便，重復(fù)性好，結(jié)果精準(zhǔn)可靠。

葡萄；葡萄酒；總酚；測定；Folin-Ciocalteu法

多酚是植物中一類重要的次生代謝物，它們除賦予植物葉片、花瓣和果實(shí)不同顏色外，在植物生理生化上，具有吸收紫外線和自由基而起到保護(hù)細(xì)胞的生理作用，也作為植物抗毒素抵抗微生物和真菌的浸染[1-2]，阻止食草動(dòng)物取食等。多酚也是葡萄酒的重要成分，構(gòu)成了葡萄酒特有的感官特征；因其可以消除人體內(nèi)的自由基而起到抗氧化、抗腫瘤、抗癌、降血脂、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病等保健作用[3-5]。因此在控制葡萄酒質(zhì)量時(shí)，必須檢測總酚含量。

目前，定量分析葡萄與葡萄酒總酚的方法主要有氧化滴定法、色譜分析法和分光光度法3類[6]，每類中又有不同的具體方法，也有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。相比較而言，F(xiàn)olin-Ciocalteu分光光度法價(jià)格低、操作方便，且測定不同生物原料中的總酚準(zhǔn)確，所以是定量分析總酚的普遍方法，這也是美國官方分析化學(xué)師協(xié)會(huì)(AOAC)定量分析葡萄酒或蒸餾酒精內(nèi)丹寧的方法[7]。但是，F(xiàn)olin-Ciocalteu法受當(dāng)時(shí)條件所限[8]，測定過程冗長費(fèi)時(shí)，所耗試劑和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量大，標(biāo)準(zhǔn)曲線制作和測試過程也非常繁雜。后來Bajaj等[9]和Ainsworth等[10]進(jìn)行減少反應(yīng)體積改良實(shí)驗(yàn)，van Alstyne[11]和田文禮等[12]則是通過升

高溫度加速反應(yīng)來縮短時(shí)間；但如果通過加熱樣品來加速反應(yīng)，又易使顏色分解較快，結(jié)果相當(dāng)不穩(wěn)定[13]，且試劑和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用量仍然相對較多，仍較耗時(shí)。隨著微量移液器的廣泛使用，使得精確量取微量液體成為現(xiàn)實(shí)；同時(shí)微波已作為輔助手段在化學(xué)和生物樣品的準(zhǔn)備等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[14]。

本實(shí)驗(yàn)基于Folin-Ciocalteu分光光度法原理，借助微量移液器和微波輻射處理，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立一種新的微量、快速測定葡萄與葡萄酒總酚含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄(戶太8號(hào)) 西安市葡萄研究所；干紅葡萄酒(2008) 王朝葡萄釀酒有限公司。

鎢酸鈉、鉬酸鈉和硫酸鋰(均為分析純) 國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；濃磷酸、濃鹽酸和無水Na2CO3(均為分析純) 西安化學(xué)試劑廠；沒食子酸(分析純) 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1700型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；KQ-300DE型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；WP700(21)型微波爐 格蘭仕電器有限公司；移液器 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 試劑的配制

Folin-Ciocalteu試劑：按文獻(xiàn)[15]方法配制，得到2mol/L的試劑，用時(shí)稀釋1倍。

Na2CO3溶液：稱取200.00g無水Na2CO3，溶于950mL沸水中，冷卻至室溫后定容至1000mL，24h后過濾得到200g/L溶液，用時(shí)分別稀釋至不同質(zhì)量濃度。

50.0mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取沒食子酸5.0mg溶解于8.0mL的甲醇中，并用水定容至100mL(現(xiàn)用現(xiàn)配，冷藏時(shí)間不能超過2周)。

1.3.2 總酚的提取

稱取40℃烘干的葡萄皮0.050g，用5.0mL 體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇溶液(含0.012mol/L鹽酸)在40℃，40kHz超聲波提取40min后，在8500r/min 4℃離心15min，提取2次，合并提取液，定容到10.0mL，然后取1.0mL用雙蒸水稀釋至10.0mL測定。

葡萄酒直接吸取1.0mL于100mL容量瓶中加8.0mL甲醇后定容測定。

1.3.3 微波處理的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在聚苯乙烯離心管內(nèi)加入0.1mL 30.0mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.1mL 1mol/L Folin-Ciocalteu試劑，混合均勻后，在1～8min內(nèi)加入0.8mL不同質(zhì)量濃度的Na2CO3溶液(20、30、40、50、60g/L)。然后放入盛有100mL室溫水的塑料杯內(nèi)，且置于微波爐中心，在微波爐的中低檔和中檔下分別微波輻射處理10、20、30、40s后測765nm波長處的吸光度，以確定最佳的Na2CO3質(zhì)量濃度、微波輻射功率和時(shí)間；另外把放入35℃水中作對照(100.0mL水在中低檔處理30s時(shí)，水溫達(dá)35℃)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

各數(shù)據(jù)重復(fù)4次，采用數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件DPS(Data Processing System) v7.05版對試驗(yàn)所得結(jié)果進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化

圖1 不同質(zhì)量濃度Na2CO3在不同輻射功率和時(shí)間的吸光度變化Fig.1 Absorbance of Na2CO3 with various concentrations at different irradiation power and time

從圖1可以看出，當(dāng)功率和處理時(shí)間相同時(shí)，Na2CO3溶液質(zhì)量濃度高的吸光度大；當(dāng)Na2CO3溶液質(zhì)量濃度相同，除60g/L的Na2CO3溶液在中檔輻射20s，吸光度達(dá)到最大值后開始下降外，其他在同檔情況下，都是隨著輻射處理時(shí)間延長，吸光度在逐漸增大；在Na2CO3溶液質(zhì)量濃度和處理時(shí)間相同時(shí)，中檔處理的吸光度均比中低檔的大。統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析表明：50g/L和60g/L Na2CO3溶液的處理中，除對照和中低檔輻射10s處理和其他的差異極顯著外，同質(zhì)量濃度之間差異不顯著(P＜0.01)；20、30、40g/L Na2CO3溶液處理之間變化則較大。這和Akins等[14]測試蛋白質(zhì)時(shí)得到的結(jié)果相似。因此，下面采用60g/L的Na2CO3溶液中檔輻射20s作為反應(yīng)條件。

Folin-Ciocalteu法測定總酚的原理是：Folin-Ciocalteu試劑在弱堿性條件下被酚還原產(chǎn)生復(fù)雜的藍(lán)色混合物，該藍(lán)色物質(zhì)在765nm處有最大吸收峰[8]。且吸光度與總酚的含量在一定濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。但該反應(yīng)的Folin-Ciocalteu試劑和形成的藍(lán)色產(chǎn)物在堿性或高溫下都易分解，而酚又要求在堿性條件下才能反應(yīng)。所以升高溫度雖可以加速反應(yīng)，達(dá)到最大吸光度的時(shí)間也變短，但表現(xiàn)不穩(wěn)定；堿性過強(qiáng)也促進(jìn)分解。所以在

常規(guī)Folin-Ciocalteu法測總酚時(shí)溫度不宜超過30℃，Na2CO3的質(zhì)量濃度一般不超過50g/L[16-18]。在微波輻射處理下，因反應(yīng)極快，時(shí)間特短，F(xiàn)olin-Ciocalteu試劑和藍(lán)色素雖在高堿性條件下，但分解較少。

微波加速反應(yīng)是種非熱效應(yīng)，與微波的高頻電磁波特征相關(guān)。微波爐輻射也可以提高水溫，但這種急劇的加速變化與溫度變化是獨(dú)立的，同時(shí)觀察到在同樣溫度下對照處理和微波爐輻射處理之間差異極顯著。所以微波爐加熱這種基本方式不是反應(yīng)加速的主要原因。因此推測，當(dāng)微波通過測試液時(shí)，加速了測試液內(nèi)分子間的碰撞和摩擦，促進(jìn)試劑的化學(xué)擴(kuò)散，并增強(qiáng)了結(jié)合，這樣微波輻射極大加速了測定總酚時(shí)反應(yīng)速度。另外，系統(tǒng)中水分子在連續(xù)高速變化的電磁場下高速旋轉(zhuǎn)，分子間作用力可能發(fā)生一些特殊變化，例如溶劑自身分子之間、溶質(zhì)與溶劑分子之間、酚分子之間不能形成氫鍵，這樣離子化分子增多，便于快速反應(yīng)。

2.2 方法評價(jià)

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作和精密度測定

準(zhǔn)確吸取50.0mg/L的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.10mL分別于6支(1～6號(hào))5mL離心管中，然后以體積分?jǐn)?shù)為8%的甲醇溶液補(bǔ)到0.1mL；如測試樣品時(shí)，取0.1mL樣品。加入0.1mL Folin-Ciocalteu試劑后充分振蕩，在1～8min內(nèi)分別加入0.8mL 60g/L Na2CO3溶液，搖勻放入內(nèi)有100mL室溫水的塑料杯內(nèi)，且置于微波爐中心，在中檔下處理20s。1號(hào)試管溶液為空白調(diào)零，測765nm波長處的吸光度，以吸光度對質(zhì)量濃度進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=0.0108X－0.0021(R2= 0.9996)，線性范圍1～50mg/L。

對稀釋后的葡萄皮提取液和葡萄酒樣各進(jìn)行9次平行測定，結(jié)果葡萄皮和葡萄酒總酚含量分別為18.53mg/g和2500mg/L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.40%和1.01%，說明該方法具有較好的精密度。

2.2.2 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

表1 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)Table 1 Recovery experiments for spiked samples

依據(jù)2.2.1節(jié)的結(jié)果，準(zhǔn)確吸取稀釋后葡萄皮提取液和葡萄酒樣，分別按其總酚含量的80%、100%和120%添加沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(n=3)，測定各樣品的總酚含量，并計(jì)算回收率。加樣的結(jié)果見表1。

由表1可見，此方法測定葡萄皮和葡萄酒總酚的加樣回收率分別是98.1%和97.2%，具有較好的回收效果。

3 結(jié) 論

本研究在傳統(tǒng)的Folin-Ciocalteu分光光度法的原理基礎(chǔ)上，首次用微波處理，極大的縮短了反應(yīng)時(shí)間。通過優(yōu)化反應(yīng)條件，簡化測試程序，得到體系的最佳反應(yīng)條件為0.1mL樣品，0.1mL 1mol/L Folin-Ciocalteu試劑和0.8mL 60g/L Na2CO3溶液，在微波爐的中檔條件下處理20s后，測定765nm波長處的吸光度。以低質(zhì)量濃度沒食子酸(50mg/L)為標(biāo)準(zhǔn)樣品直接作標(biāo)準(zhǔn)曲線，質(zhì)量濃度在1～50mg/L范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系(R2=0.9996)。利用該法測定添加沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)樣的葡萄與葡萄酒樣，平均回收率分別為98.1%和97.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.40%和1.01%。本法是一種簡單、微量、快速測定葡萄與葡萄酒總酚含量的新方法。微波爐加速反應(yīng)的機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。

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Rapid and Micro-Determination of Total Polyphenol in Grape and Grape Wine

XU Guo-qian1，ZHANG Zhen-wen1,2,*，GUO An-que1,2，F(xiàn)ANG Yu-lin1,2，LUAN Li-ying1
(1. College of Enology, Northwest A & F University, Yangling 712100, China；2. Research Center for Viti-viniculture of Shaanxi Province, Yangling 712100, China)

Based on the principle of Folin-Ciocalteu (F-C) assay for determining total polyphenol in grape and grape wine, a new method was developed by optimizing reactive conditions with the aid of micropipette and microwave irradiation. The optimal conditions were 0.1 mL of sample, 0.1 mL of 1 mol/L F-C reagent and 0.8 mL of 60 g/L Na2CO3, microwave treatment for 20 s at the middle power level, determination wavelength of 765 nm. The standard curve exhibited a good linear relationship between absorbance and gallic acid concentration from 1 to 50 mg/L (R2= 0.9996). When several gallic acid solutions were added to grape and grape wine samples, the average recovery rates of spiked gallic acid in grape and grape wine samples were 98.1% and 97.2%, respectively, with a relative standard deviation (RSD) ranging from 1.40% to 1.01%. This new method is characteristic of simple operation, fast determination, excellent precision, prefect reproducibility and significant reduction in the consumption of samples, reagents as well as time. Therefore, this new method is a promising method for determining total polyphenol in grape and grape wine.

grape；grape wine；total polyphenol；determination；Folin-Ciocalteu assay

TS262.6；Q657.3

A

1002-6630(2010)18-0268-03

2009-12-14

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(nycytx-30-zp-04)

徐國前(1968—)，男，博士研究生，研究方向?yàn)槠咸言耘嗯c釀酒。E-mail：xugql@163.com

*通信作者：張振文(1960—)，男，教授，碩士，研究方向?yàn)槠咸言耘嗯c釀酒。E-mail：Zhangzhw60@nwsuaf.edu.cn