高效液相色譜法對掛面中食用合成色素的測定

符 鋒，范會平*，秦學(xué)磊

(1.河南省糧油飼料產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗站，河南 鄭州 450008；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

高效液相色譜法對掛面中食用合成色素的測定

符 鋒1，范會平2,*，秦學(xué)磊1

(1.河南省糧油飼料產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗站，河南 鄭州 450008；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

通過添加木瓜蛋白酶和α-淀粉酶水解掛面中淀粉和蛋白質(zhì)，減少淀粉和蛋白質(zhì)在提取過程中對合成色素的吸附，以研究適合于掛面中食用合成色素的測定方法。結(jié)果表明：在加酶的情況下，色素回收率顯著提高，并隨著加酶種類和含量的不同，色素回收率也有所不同，α-淀粉酶和木瓜蛋白酶組成的復(fù)合酶制劑的添加效果優(yōu)于單一酶制劑。復(fù)合酶添加量α-淀粉酶為2%、木瓜蛋白酶為2.5%時，5種色素檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍(lán)加標(biāo)回收率均在80%以上，較對照組有顯著提高。

高效液相色譜；掛面；合成色素；木瓜蛋白酶；α-淀粉酶

世界各國對食用色素的品種、使用范圍和使用量都有嚴(yán)格限制[1]。我國到2004年5月共準(zhǔn)許使用11種合成色素，而面制品中則不允許添加合成色素[2-3]。近年來，隨著各種花色掛面產(chǎn)品的不斷開發(fā)，一些不法商販以食品合成色素替代花色掛面中的蔬菜汁原料，以牟取暴利。

色素的測定方法有紫外-可見分光光度法[4]、薄層層析法[5]、示波極譜法[6]、HPLC法[7-9]等。色素提取操作步驟是關(guān)鍵性操作，要求提取后得到的待測溶液，盡可能不含雜質(zhì)或含極微量不影響測定的雜質(zhì)，以減少雜質(zhì)對檢測結(jié)果的干擾，并且要求在提取過程中盡可能避免色素的損失[10]。目前只有冷飲、配制酒和硬糖等基質(zhì)簡單的食品色素的國標(biāo)[11]測定方法，目前尚沒有專門針對面制品中食用合成色素的測定方法。

木瓜蛋白酶具有耐高溫、活性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、蛋白質(zhì)水解能力強(qiáng)等特征，是能作用于各類蛋白質(zhì)的純天然產(chǎn)物[12]，廣泛應(yīng)用于食品、飲料、啤酒、化學(xué)、紡織等行業(yè)，如用木瓜蛋白酶處理中藥材，可促進(jìn)中藥成分的煎出[13]。淀粉酶屬于水解酶的一種，其中α-淀粉酶將淀粉長鏈分子水解成短鏈分子時，以無規(guī)則的方式切斷淀粉大分子內(nèi)部的α-1,4甙鍵而使淀粉生成糊精、低聚糖等，在我國產(chǎn)量較大，廣泛應(yīng)用于食品、釀造、制藥和紡織等領(lǐng)域[14]。蛋白酶和淀粉酶的混合酶制劑也廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)中，以改善工藝、降低成本，諶國蓮等[15]采用混合酶制劑用于荔枝汁的澄清。

由于面粉中蛋白質(zhì)、淀粉含量較高，在提取色素過程中，色素容易被蛋白質(zhì)、淀粉吸附，使得在檢測過程中很難準(zhǔn)確計算其中色素的實際含量。因此，開發(fā)適宜于面制品中食品合成色素的檢測方法顯得尤為重要。本研究采用加酶法水解面制品中蛋白質(zhì)、淀粉以減少其對色素的吸附，再采用高效液相色譜方法進(jìn)行色

素含量的測定，以期找出適合于面制品中食用合成色素的測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

掛面 市售。

色素標(biāo)準(zhǔn)溶液 國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；木瓜蛋白酶(≥50萬IU) 北京索萊寶科技有限公司；α-淀粉酶(≥4000IU) 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；甲醇(色譜純)；聚酰胺粉(200目)；二級水(電導(dǎo)率≤0.10mS/m，25℃)；甲醇-甲酸混合溶液(6:4，V/V)；無水乙醇-氨水-水混合溶液(7:2:1，V/V)；檸檬酸溶液木瓜蛋白酶溶液(0.01g/mL，最適溫度為70℃，最適pH值為5～7)；α-淀粉酶溶液(0.01g/mL，最適溫度為65℃，最適pH值為5～7)；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的檸檬酸溶液；體積分?jǐn)?shù)為36%的乙酸溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

1100高效液相色譜儀 安捷倫公司；BS224S電子天平 北京賽多利斯有限公司；DZKW-4型電熱恒溫水浴鍋、FW-100高速萬能粉碎機(jī) 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；TDC-40B離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

取適量的掛面經(jīng)磨粉機(jī)磨后待用。取100g掛面粉加入1mL色素標(biāo)液(0.5mg/mL)溶液，充分混合后晾干，將晾干后的掛面粉放入磨粉機(jī)磨碎，得到含色素為5μg/g的加標(biāo)掛面粉，裝入樣品瓶中待測。

1.3.2 樣品提取

稱取5g(精確到0.01g)加標(biāo)樣品，放入100mL的錐形瓶中加一定體積的酶溶液，用20%檸檬酸調(diào)pH6，補(bǔ)加水至50mL，將錐形瓶放入65℃水浴鍋中加熱15min，然后將試液放入離心機(jī)，于2000r/min離心5min取上清液移入150mL錐形瓶中，將離心后的殘渣用少量水洗2～3次，所得水洗液合并入150mL錐形瓶中。將依法制成的樣品溶液調(diào)pH6，放入水浴鍋中加熱到60℃，將1g聚酰胺粉加少量水調(diào)成糊狀，倒入樣品溶液中，攪拌片刻，以G3垂融漏斗抽濾，用60℃ pH4的水洗滌3～5次，然后用甲醇-甲酸溶液洗滌3～5次，再用水洗至中性。用乙醇-氨水-水混合溶液解吸3～5次，每次3mL，收集解吸液，用36%乙酸溶液調(diào)節(jié)至中性，水浴加熱至近干。加水定容至5mL。經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，取10μL在高效液相色譜儀上進(jìn)行測定[11]。

1.3.3 樣品測定

樣品測定參照GB/T 5009.35—2003《食品衛(wèi)生檢驗方法理化部分(一)》[11]食品中合成色素的檢驗方法。

色譜柱：YWG-C1810μm不銹鋼柱：4.6mm(i.d)× 250mm，柱溫為40℃；流動相：甲醇、乙酸銨溶液(0.02mol/L)；梯度洗脫：甲醇體積分?jǐn)?shù)在0～5min為20%～35%(3%/min)，5～12min為35%～98%(9%/min)，12～18min為98%，18.01～30min為20%。流速：1mL/min；紫外線檢測器，254nm波長測定。

取相同體積樣液和合成色素標(biāo)準(zhǔn)液分別在高效液相色譜儀上測定，根據(jù)保留時間定性，外標(biāo)峰面積法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的分離效果、線性關(guān)系

圖1 5種食用合成色素混標(biāo)高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of mixed five synthetic food pigments standards

圖1 為在1.3.3節(jié)色譜條件下，5種食用合成色素混合標(biāo)準(zhǔn)品的分離效果，可以看出，5種色素在設(shè)定的色譜條件下，分離效果良好。以5種色素的峰面積(Y)對質(zhì)量濃度(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍、檢出限和相關(guān)系數(shù)見表1。結(jié)果表明，5種常用食用合成色素標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。

表1 5種食用合成色素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(n=5)Table 1 Standard curve equations and their figures of merit of 5 synthetic food pigments (n=5)

2.2 色素提取條件

在測定掛面中食用合成色素時，由于色素容易被蛋白質(zhì)、淀粉所吸附，從而不能夠準(zhǔn)確檢測合成色素的實際含量。本實驗采用酶法分解蛋白質(zhì)、淀粉以減少其對色素的吸附作用，較好地解決了面制品中色素提取回收率較低的問題，以加入胭脂紅為例進(jìn)行討論。

2.2.1 α-淀粉酶對色素提取的影響

圖2 α-淀粉酶添加量對胭脂紅回收率的影響Fig. 2 Effect ofα-amylase amount on the recovery of carmine

由圖2可知，當(dāng)單獨加入α-淀粉酶時，該酶可分解掛面中的淀粉，從而減少了淀粉對色素的吸收；當(dāng)α-淀粉酶的添加量(均以試樣為100%計)由0增加到3.0%時測得的胭脂紅含量隨著酶添加量的增多而變化，當(dāng)酶添加量為2%時，胭脂紅回收率為43.30%，當(dāng)酶添加量大于2%時，隨酶添加量的增加胭脂紅的回收率無顯著變化。根據(jù)添加量最少，提取效果最佳的原則綜合分析，可知當(dāng)酶添加量2%時較為適宜。

2.2.2 木瓜蛋白酶對色素提取的影響

圖3 木瓜蛋白酶添加量對胭脂紅回收率的影響Fig.3 Effect of papain amount on the recovery of carmine

由圖3可知，當(dāng)單獨加入木瓜蛋白酶時，該酶可分解掛面中的蛋白質(zhì)，使得蛋白質(zhì)對色素的吸附明顯減少；當(dāng)木瓜蛋白酶的添加量(均以試樣為100%計)由0增加到3.0%時，胭脂紅的提取回收率隨著酶添加量的增加而增大，當(dāng)酶添加量2.5%時，胭脂紅回收率達(dá)到68.98%，隨酶添加量的進(jìn)一步增大，胭脂紅的回收率略有上升，但變化不大。綜合考慮酶添加量和提取效果兩種因素，可知酶添加量為2.5%時效果較好。

2.2.3 復(fù)合酶對色素提取的影響

在考慮單獨加入一種酶對實驗的影響后，再考慮加入α-淀粉酶和木瓜蛋白酶共同作用對面制品中色素測定效果的影響，由于已確定加入2%淀粉酶和2.5%蛋白酶可達(dá)到較理想效果，因此在考慮添加復(fù)合酶時，選擇在添加2%淀粉酶和2.5%蛋白酶附近幾個點進(jìn)行實驗。

表2 復(fù)合酶添加量對胭脂紅回收率的影響Table 2 Effect of combined use of papain and α-amylase on the recovery of carmine

由表2可知，添加α-淀粉酶和木瓜蛋白酶復(fù)合酶比單獨添加其中一種酶的效果更好，兩種酶共同添加更好地減少了蛋白質(zhì)和淀粉對色素的吸附，故胭脂紅的回收率明顯提高；當(dāng)添加α-淀粉酶2%、木瓜蛋白酶2.5%時，測得的胭脂紅含量最多，而酶空白處理對照中胭脂紅的回收率僅為14.76%。由此可知，用酶分解法對掛面粉前處理，對掛面中食用合成色素的檢測有良好效果，其中復(fù)合酶的作用效果優(yōu)于單一酶，且由2.2.1節(jié)和2.2.2節(jié)可以看出，蛋白酶在減少樣品中色素吸附中起著更為主要的作用。酶的添加量為α-淀粉酶2%、木瓜蛋白酶2.5%時，復(fù)合酶的作用效果最好，胭脂紅的回收率達(dá)到80%以上。

2.35 種色素的回收率測定

將添加有5種色素標(biāo)樣的掛面粉采用復(fù)合酶添加量為α-淀粉酶2%、木瓜蛋白酶2.5%(進(jìn)行前處理，再按照1.3.2節(jié)方法對酶解后的樣品提取液進(jìn)行吸附，解吸處理。取樣液5μL注入高效液相色譜儀中檢測，加標(biāo)回收率如表3所示。

表3 5種色素加標(biāo)回收率測定結(jié)果Table 3 Spike recoveries of five synthetic food pigments

由表3可知，對檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍(lán)5種色素做加標(biāo)回收率實驗時，測得5種色素的檢測結(jié)果有所不同，但是這5種色素的回收率均在80%以上，基本滿足面制品中食用合成色素測定要求。

3 結(jié) 論

本實驗采用酶法水解掛面粉中的蛋白質(zhì)和淀粉，以減少它們在提取過程中對合成色素的吸附。結(jié)果表明，復(fù)合酶添加量α-淀粉酶為2%、木瓜蛋白酶為2.5%時，5種色素檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍(lán)加

標(biāo)回收率均在80%以上。本研究較好的解決了掛面中色素提取效率過低的問題，為掛面中食品合成色素的檢測方法的建立提供了較好的理論依據(jù)和實踐指導(dǎo)。

[1]鄭毅, 張宜友, 劉淳. 食品中合成色素檢驗技術(shù)[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2000, 10(6): 663-667.

[2]GB 2760—1996食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[S].

[3]中華人民共和國衛(wèi)生部公告. 2004年第6號[B]. 2004-04-12.

[4]李必斌, 張海霞, 潘連富. 紫外-可見吸收光譜法定性定量測定食用合成色素[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2001, 11(1): 58-60.

[5]丁來欣, 陳里. 薄層色譜法分離測定辣椒紅色素中的辣椒紅[J]. 色譜, 1995, 13(4): 295-296.

[6]文君, 繆紅, 范柯. 示波極譜法測定食品中人工合成色素赤蘚紅[J].食品研究與開發(fā), 2001, 22(3): 63-64.

[7]劉麗珍, 徐曉楓, 楊劍業(yè), 等. 高效液相色譜等梯度測定食品中檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃[J]. 醫(yī)學(xué)動物防制, 2007, 23(2): 101-102.

[8]劉奮, 林奕芝, 戴京晶, 等. 高效液相色譜多波長測定人工合成著色劑[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)2001, 28(1): 81-82.

[9]陳曉紅, 李小平, 姚潯平. 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定飲料中人工合成色素的研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2005, 15(8): 941-942.

[10]鄭毅, 王克利, 李明元. 食品中合成色素的檢驗技術(shù)新編(連載一) [J].口岸衛(wèi)生控制, 2005, 10(4): 45-45.

[11]GB/T 5009.35—2003食品衛(wèi)生檢驗方法理化部分(一)[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2003.

[12]乙引, 張顯強(qiáng), 唐金剛, 等. 木瓜蛋白酶的純化和性質(zhì)[J]. 貴州師范大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版, 2002, 20(1): 11-14.

[13]曾惠芳, 蘇子仁, 肖省娥, 等. 木瓜蛋白酶對補(bǔ)骨脂有效成分煎出的影響[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 1998, 40(9): 312-313.

[14]趙其明. α-淀粉酶在漿料助劑和淀粉預(yù)處理中的應(yīng)用[J]. 印染助劑, 2003, 20(5): 34-36.

[15]諶國蓮, 陳穗, 孫遠(yuǎn)明, 等. 混合酶在澄清荔枝汁中的應(yīng)用研究[J].食品工業(yè)科技, 2001, 22(2): 32-34.

HPLC Determination of Synthetic Food Pigments in Dried Noodles

FU Feng1，F(xiàn)AN Hui-ping2,*，QIN Xue-lei1
(1. Henan Station for Supervision and Inspection of Grain, Oil and Feed Product Quality, Zhengzhou 450008, China；2. College of Food Science and Technology, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

A HPLC method was established to determine synthetic food pigments in dried noodles. Papain hydrolysis for protein removal and α-amylase for starch removal from dried noodles were done in case of their adsorption to pigments during extraction. Pigment recovery was significantly improved due to the use of enzymatic hydrolysis. Both enzyme kind and amount made a difference to pigment recovery. Combined treatment with papain and α-amylase was more efficient than single treatment with either of them. When 2% α-amylase and 2.5% papain were used together, the recoveries of five pigments, i.e., lemon yellow, amaranth red, carmine, sunset yellow and bright blue, were all above 80%, which were significantly higher than that of control.

HPLC；dried noodle products；synthetic food pigment；papain；α-amylase

TS202.3

A

1002-6630(2010)18-0325-04

2010-06-04

符鋒(1973—)，男，工程師，本科，主要從事糧油飼料產(chǎn)品的檢驗監(jiān)督研究。E-mail：690853526@qq.com

*通信作者：范會平(1972—)，女，講師，博士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工研究。E-mail：fanhuiping1972@hotmail.com