響應(yīng)面法優(yōu)化微波提取野菊花抗氧化物質(zhì)

褚福紅，陸 寧，于 新*，蔣 雨

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014)

響應(yīng)面法優(yōu)化微波提取野菊花抗氧化物質(zhì)

褚福紅1,2，陸 寧1，于 新2,*，蔣 雨3

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014)

以野菊花花蕾為材料，研究其提取物的抗氧化活性。在乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、料液比等單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，應(yīng)用響應(yīng)面分析法研究各因素的顯著性和交互作用的強(qiáng)弱，對野菊花微波提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，微波提取野菊花清除DPPH自由基物質(zhì)的優(yōu)化工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1:27(g/mL)、提取時間51s。提取物質(zhì)量濃度為0.6mg/mL時，DPPH自由基實(shí)際清除率達(dá)到83.23%，與理論預(yù)測值83.10 %的絕對誤差為0.13%。

響應(yīng)面分析法；野菊花；微波提??；DPPH自由基

野菊花為菊科植物野菊(Chrysanthemum indicum L.)的頭狀花序，中藥材常用其花蕾，具有清熱解毒、涼肝明目之功效[1]。野菊花中主要含有黃酮類化合物[2]、綠原酸[3]、多糖[4]以及多種揮發(fā)油成分和脂肪族化合物[5]。近年來的研究表明其具有抗病毒、抗感染、降壓、抗腫瘤、提高機(jī)體免疫及抗氧化等眾多藥理作用。資料顯示，自由基損傷機(jī)體是加速人體老化的重要誘因[6]。我國野菊花分布廣泛，野菊花多糖具有清除活性氧自由基的作用[4]；其水提液對離體大鼠心、腦、肝、腎的脂質(zhì)過氧化物(LPO)以及H2O2引發(fā)的紅細(xì)胞LPO和紅細(xì)胞溶血有不同程度的抑制作用，還可提高體內(nèi)抗氧化酶的活力[7]；野菊花揮發(fā)油具有清除DPPH自由基活性的作用[8]。目前，響應(yīng)面分析法在優(yōu)化微波輔助提取野菊花抗氧化物質(zhì)中的應(yīng)用未見報(bào)道。

微波作為一種新型的技術(shù)近年來廣泛應(yīng)用于植物化學(xué)領(lǐng)域[9]，它具有加熱速度快、控制方便、受熱體系溫度均勻、節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)[10-11]。DPPH自由基是一種人工合成的穩(wěn)定的自由基，在可見光區(qū)有特征吸收，比色測定簡便快速，并具有良好的重現(xiàn)性，可有效評價物質(zhì)的抗氧化性[12]。本實(shí)驗(yàn)利用微波技術(shù)研究野菊花提取物對DPPH自由基的清除率，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析法[13-14]以最經(jīng)濟(jì)的方式對所選實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行全面的分析和研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野菊花[巖香菊(C.lavandulaefolium(Fisch.)Mak.)的頭狀花絮] 廣州市大參林藥房；1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH自由基) 美國Sigma公司；無水乙醇(分析純) 廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1004電子分析天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司；MJ-176NR型多功能粉碎機(jī) 日本松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；G8023CSL-K3型微波爐 格蘭仕微波爐有限公司；UV-1700紫外分光光度計(jì) 日本島津分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 提取物對DPPH自由基清除率的測定

參照Vattem等[15]報(bào)道，配制不同濃度的提取物溶液，精確吸取2.0mL放入試管中，加入2.0×10-4mol/L DPPH自由基溶液2.0mL，搖勻后30℃放置30min，測定其在517nm波長處的吸光度(AS)；以蒸餾水代替樣品為空白對照(A0)；以2.0mL不同濃度的提取物溶液與2.0mL水混合液為樣品對照(AX)，以消除樣品本身顏色的影響。

1.3.2 工藝優(yōu)化設(shè)計(jì)

1.3.2.1 單因素試驗(yàn)

分別考察溶劑、料液比、提取時間等因素對野菊花微波提取物清除DPPH自由基的影響，設(shè)3次重復(fù)。

1.3.2.2 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表1 試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Factors and levels of response surface experiments

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間和料液比為野菊花微波提取物清除DPPH自由基影響的3個因素，采用三因素三水平的(central composite design，CCD)試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)及分析方法進(jìn)行提取條件的優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶劑的選擇

將野菊花粉碎過100目篩，分別用水、無水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等不同極性的溶劑在70℃下回流提取4h，結(jié)果如圖1所示。水提物的DPPH自由基清除率最高，而氯仿提取物的DPPH自由基清除率最低，總的趨勢隨著提取溶劑極性的增強(qiáng)，野菊花提取物的抗氧化活性不斷提高。因此，選擇水和不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇為提取溶劑。

圖1 不同溶劑對DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effects of different solvents on the scavenging rate of extractfrom Chrysanthemum indicum L. to DPPH free radicals

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取物清除DPPH自由基的影響在料液比1:20(g/mL)、提取時間30s、微波功率

320W的條件下，設(shè)定提取溶劑分別為水、30%乙醇、

50%乙醇、70%乙醇(均為體積分?jǐn)?shù))，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the scavenging rate of extract from Chrysanthemum indicum L. to DPPH free radicals

在微波條件下，不同體積分?jǐn)?shù)乙醇提取物對DPPH自由基的清除率大于水提物，50%乙醇提取物對DPPH自由基的清除率最高，其次是70%和30%的乙醇提取物。這首先是因?yàn)槲⒉ㄝo助會對強(qiáng)極性的溶劑提取顯示出優(yōu)勢，其次有一定量的有機(jī)試劑存在會提高提取效率。

2.2.2 提取時間對提取物清除DPPH自由基的影響

在料液比1:20(g/mL)、提取溶劑體積分?jǐn)?shù)50%乙醇、微波功率320W的條件下，設(shè)定提取時間分別為10、20、30、40、50、60、70s。結(jié)果如圖3所示，在50s之前隨著時間的延長，DPPH自由基清除率不斷提高，50s之后就出現(xiàn)下降趨勢。這表明，微波萃取的活性物質(zhì)浸出過程與時間密切相關(guān)，時間過短，產(chǎn)物溶解不充分，但時間過長，活性物質(zhì)有所破壞或被分解。

圖3 提取時間對DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the scavenging rate of extract from Chrysanthemum indicum L. to DPPH free radicals

2.2.3 料液比對提取物清除DPPH自由基的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、微波功率320W、提取時間50s的條件下。設(shè)定料液比分別為1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35(g/mL)，結(jié)果見圖4。

圖4 料液比對DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effect of material-liquid ratio on the scavenging rate of extract from Chrysanthemum indicum L. to DPPH free radicals

由圖4可知，隨著溶劑量提高，DPPH自由基的清除率先提高后降低，在料液比為1:25(g/mL)時清除率達(dá)到最高。前期溶劑量越大，有效成分浸出越完全，DPPH自由基的清除率也就越高；但溶劑量過多，一方面造成溶劑的浪費(fèi)和能耗的增加，另一方面對微波效率也會有影響，因此確定料液比1:25(g/mL)比較合理。

2.3CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

2.3.1 模型的建立及其顯著性檢驗(yàn)

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波時間、液料比這3個因素，采用三因素三水平的CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表2)及分析方法進(jìn)行提取條件的優(yōu)化。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of response surface experiments

利用Design expert V 7.0.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到野菊花提取物的抗氧化活性對以上3個因素的二次多項(xiàng)回歸模型為：

Y/%=-1.90＋1.78x1＋3.37x2-0.19x3-0.022x1x2＋9.81×10-3x1x3＋0.015x2x3-0.017x12-0.057x22-7.03× 10-3x32

表3 回歸方程可信度分析Table 3 Reliability analysis for the regression equation

回歸方程可信度分析見表3，其中R2=0.9823，表明98.23%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可用該模型進(jìn)行解釋；信噪比為26.506，遠(yuǎn)大于4；CV值為0.54%，很低，顯示實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性好，操作可信。該回歸方程為優(yōu)化提取野菊花中清除DPPH自由基的物質(zhì)提供了一個良好的工藝條件模型。

表4 二次回歸方程模型方差分析Table 4 Variance analysis of the quadratic regression model

由表4可見，模型具有高度顯著性(P＜0.0001)，失擬項(xiàng)不顯著，又由各因素的P值可知除提取時間無顯著影響(P=0.1432)，乙醇體積分?jǐn)?shù)(P=0.0484)具顯著影響外，其他各因素如二次項(xiàng)、方程交互項(xiàng)對野菊花提取物清除DPPH自由基的能力都有極顯著影響。響應(yīng)值的變化相當(dāng)復(fù)雜，各個具體試驗(yàn)因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。由表4中F值的大小可以判斷各因素對DPPH自由基清除率影響的強(qiáng)弱。F值越大，影響作用越強(qiáng)。各個因素對DPPH自由基清除率的影響程度大小的次序?yàn)榱弦罕龋疽掖俭w積分?jǐn)?shù)＞提取時間，其中料液比對DPPH自由基清除率的影響達(dá)到極顯著水平(P＜0.0001)。

2.3.2 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化

比較圖5可知：料液比對DPPH自由基清除率的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡；乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波提取時間次之，表現(xiàn)為曲線較為平滑，且隨其數(shù)值的增加或減少，響應(yīng)值變化較小。從圖5A可以看出，響應(yīng)面曲線較陡，說明料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對DPPH自由基清除率的影響較為明顯，這與方差分析的結(jié)果相一致。圖5中等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。由圖5A等高線可以看出，料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)之間的交互作用較顯著，表現(xiàn)為等高線呈橢圓形。相比較而言，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時間之間的交互作用較小?；貧w模型預(yù)測的野菊花提取物清除DPPH自由基的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)49.68%、料液比1:26.98(g/mL)、提取時間50.59s，此時野菊花提取物對DPPH自由基的理論值達(dá)到了83.10%。為檢驗(yàn)響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化提取條件進(jìn)行野菊花微波提取，考慮到實(shí)際操作的便利，將提取工藝參數(shù)修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1:27(g/mL)、提取時間51s，結(jié)果得出DPPH自由基清除率實(shí)際值為83.23%。與理論預(yù)測值83.10%非常接近。因此，基于響應(yīng)面法分析所得的優(yōu)化提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價值。

圖5 各因素交互作用對野菊花提取物清除DPPH自由基影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction of any two factors on the scavenging rate of extract from Chrysanthemum indicum L. to DPPH free radicals

3 結(jié) 論

響應(yīng)面優(yōu)化微波提取野菊花抗氧化物質(zhì)工藝試驗(yàn)結(jié)果表明，料液比顯著影響野菊花提取物對DPPH自由基的清除率(P＜0.0001)。綜合分析回歸模型確定最佳的工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1:27(g/mL)、提取時間51s，結(jié)果得出DPPH自由基清除率實(shí)際值為83.23%，與理論預(yù)測值的擬合度較好。

[1]江蘇新醫(yī)學(xué)院. 中藥大辭典: 下冊[M]. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1986: 2128; 2144.

[2]高美華, 李華, 張莉, 等. 野菊花化學(xué)成分的研究[J]. 中藥材, 2008, 31(5): 682-684.

[3]劉艷清, 汪洪武. 野菊花中綠原酸提取工藝的研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2008, 19(7): 1612-1613.

[4]李貴榮. 野菊花多糖的提取及其對活性氧自由基的清除作用[J]. 中國公共衛(wèi)生, 2002, 18(3): 269-270.

[5]周欣, 莫彬彬, 趙超, 等. 野菊花二氧化碳超臨界萃取物的化學(xué)成分研究[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2002, 37(3): 170-172.

[6]方允中. 自由基與營養(yǎng)素: 自由基生物學(xué)的理論與應(yīng)用[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2002.

[7]嚴(yán)亦慈, 婁小娥, 蔣惠娣. 野菊花水提液抗氧化作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志, 1999, 16(6): 16-18.

[8]鐘才寧, 何敏, 楊再波, 等. 均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化野菊花揮發(fā)油提取工藝及抗氧化研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2009, 20(4): 888-889.

[9]張巧玲, 陳學(xué)武, 李琳. 微波強(qiáng)化浸提天然色素的研究[J]. 食品科學(xué), 2002, 23(2): 49-52.

[10]張代佳, 劉傳斌, 修志龍, 等. 微波技術(shù)在植物胞內(nèi)有效成分提取中的應(yīng)用[J]. 中草藥, 2000, 31(9): 86-87.

[11]李鳳英, 崔蕊靜, 李春華. 采用微波輔助法提取葡萄籽中的原花青素[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2005, 31(1): 39-42.

[12]陸占國, 郭紅轉(zhuǎn), 封丹. 芫荽莖葉精油成分及清除DPPH自由基能力研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2006, 32(8): 24-26.

[13]沈慧慧, 鄧輝, 易麗娟, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化懸浮培養(yǎng)肉蓯蓉細(xì)胞中苯乙醇苷超聲提取工藝的研究[J]. 食品科技, 2009, 34(9): 179-183.

[14]李景恩, 聶少平, 楊超, 等. 響應(yīng)曲面法優(yōu)化香薷多糖的提取工藝[J].食品科學(xué), 2009, 30(18): 131-134.

[15]VATTEM D A, LIN Y T, LABBE R G, et al. Phenolic antioxidant mobilization in cranberry pomace by solid-state bioprocessing using food grade fungus Lentinus edodes and effect on antimicrobial activity against select food borne pathogens[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2004, 5(1): 81-91.

Optimization of Microwave Extraction Conditions for Antioxidant Materials from Chrysanthemum indicum L. by Response Surface Methodology

CHU Fu-hong1,2，LU Ning1，YU Xin2,*，JIANG Yu3
(1. College of Tea & Food Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China；2. College of Light Industry and Food Science, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China；3. Food Science College, Sichuan Agricultural University, Ya， an 625014, China)

Chrysanthemum indicum L. was used as the raw material to extract antioxidant materials by microwave technology. On the basis of single-factor experimental results and central composite design principle, the optimal extraction processing parameters were explored by response surface experiments through evaluating the effects of ethanol concentration, extraction time, material-liquid ratio and their cross-interactions on antioxidant activity of the extract. Results indicated that the optimal extraction processing parameters were ethanol concentration of 50% (V/V), microwave treatment time of 51 s and material-liquid ratio of 1:27 (g/mL). Under these optimal extraction conditions, the scavenging rate of the extract from Chrysanthemum indicum L. at the concentration of 0.6 mg/mL on DPPH free radicals was up to 83.10%, which was close to the predicted value of 83.23% with an absolute error of 0.13%.

response surface method (RSM)；Chrysanthemum indicum L.；microwave extraction；DPPH free radicals

TS201；Q946

A

1002-6630(2010)24-0090-05

2010-02-02

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2005B20401002)

褚福紅(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：fish_fish777@126.com

*通信作者：于新(1959—)，男，教授，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：yuxin1959@yahoo.com.cn