岑劍偉，李來(lái)好*，楊賢慶，郝淑賢，辛少平，吳燕燕，陳勝軍，黃 卉

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 510300)

充氮蒸餾-鹽酸副玫瑰苯胺比色法測(cè)定水產(chǎn)品中亞硫酸鹽

岑劍偉，李來(lái)好*，楊賢慶，郝淑賢，辛少平，吳燕燕，陳勝軍，黃 卉

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 510300)

對(duì)水產(chǎn)品中亞硫酸鹽含量的測(cè)定進(jìn)行研究，通過(guò)比較不同提取和測(cè)定方法，改良鹽酸副玫瑰苯胺比色法，建立以充氮蒸餾法提取、甲醛溶液吸收、鹽酸副玫瑰苯胺比色測(cè)定水產(chǎn)品中亞硫酸鹽的方法。該方法SO2含量在0.1～2.0μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系(R2=0.9993)，方法的檢出限為0.30mg/kg。測(cè)定樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，平均回收率在80%～100%之間。該方法重現(xiàn)性良好、使用無(wú)毒試劑、回收率能達(dá)到檢測(cè)要求，適用于水產(chǎn)品中亞硫酸鹽的測(cè)定。

充氮蒸餾；鹽酸副玫瑰苯胺；水產(chǎn)品；甲醛吸收；亞硫酸鹽

亞硫酸鹽在水產(chǎn)品的貯藏和加工過(guò)程中應(yīng)用十分廣泛，常應(yīng)用于水產(chǎn)食品如烤魚(yú)片、冷凍蝦、魚(yú)干、魷魚(yú)絲加工中，起到漂白、增色、防止凍蝦褐變的作用[1]。但是人體長(zhǎng)期攝入亞硫酸鹽會(huì)破壞VB1，影響生長(zhǎng)發(fā)育，易患多發(fā)性神經(jīng)炎，出現(xiàn)骨髓萎縮等癥狀，產(chǎn)生慢性毒性[2]；長(zhǎng)期食用硫磺熏蒸過(guò)的食品，會(huì)造成腸道功能紊亂[3]，損害肝臟，還會(huì)引發(fā)支氣管痙攣、哮喘等疾病[4]。亞硫酸鹽還是致病力很強(qiáng)的致癌物質(zhì)，WHO規(guī)定每人每日允許攝入量0～0.7mg。因此世界各國(guó)對(duì)食品中亞硫酸(以總SO2計(jì))規(guī)定了最大限量。國(guó)際食品法典委員會(huì)(CAC)規(guī)定冷凍蝦中亞硫酸鹽殘留量生品可食性部分≤100mg/kg，熟品的可食性部分≤30mg/kg，日本對(duì)鹽漬蔬菜、淀粉等食品中SO2限量為30mg/kg，韓國(guó)規(guī)定水產(chǎn)品生熟制品中亞硫酸鹽限量均為30mg/kg，美國(guó)FDA和歐盟則將10mg/kg設(shè)定為界限值，超過(guò)此數(shù)值時(shí)必須在標(biāo)簽上加以標(biāo)注[5]。食品中亞硫酸鹽的檢測(cè)通常是將它轉(zhuǎn)化為SO2后用碘量法或堿滴定法或比色法測(cè)定，由于食品種類(lèi)不同，不同檢測(cè)方法也只適用于部分食品種類(lèi)的測(cè)定，尚無(wú)完全通用的方法。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法有滴定法、比色法和重量法，隨著分析科學(xué)新方法和新技術(shù)的不斷發(fā)展，新的檢測(cè)方法如熒光法、化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)法和酶法，以及一些新的分離檢測(cè)技術(shù)如氣體擴(kuò)散膜分離、流動(dòng)注射、離子色譜、毛細(xì)管電泳和各類(lèi)傳感器被應(yīng)用到亞硫酸鹽的檢測(cè)中[6]。由于使用新方法檢測(cè)亞硫酸鹽的成本普遍較高，且在靈敏度方面提升不大[7-8]，目前較多采用傳統(tǒng)方法。美國(guó)FDA采用Monier-Williams法即蒸餾-堿滴定法，日本采用通氮蒸餾-碘量法、鹽酸副玫瑰苯胺比色法；國(guó)內(nèi)則較多采用標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.34—2003《食品中亞硫酸鹽的測(cè)定》中規(guī)定的方法，即鹽酸副玫瑰苯胺比色法和蒸餾-碘量法[9]。傳統(tǒng)的滴定法檢測(cè)靈敏度并不高，比色法如鹽酸副玫瑰苯胺法，雖然靈敏度高穩(wěn)定性也好，但是操作過(guò)程使用了劇毒的四氯汞鈉溶液，危害實(shí)驗(yàn)人員的健康，對(duì)環(huán)境造成汞污染，有研究使用無(wú)汞鹽作為吸收劑[10-13]，但這些改進(jìn)的方法不適用于色澤較深的樣品。為消除這些不足，本研究比較樣品提取方法的優(yōu)缺點(diǎn)、深入研究影響鹽酸副玫瑰苯胺比色的要素，探索使用充氮蒸餾提取-無(wú)毒試劑吸收-鹽酸副玫瑰苯胺比色的方法測(cè)定水產(chǎn)品中的亞硫酸鹽。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮對(duì)蝦、干蝦仁、魷魚(yú)絲。

濃鹽酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)36%～38%)；甲醛(質(zhì)量分?jǐn)?shù)35%～40%)；磷酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)85%)；氨基磺酸銨、氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、乙二胺四乙酸二鈉、鹽酸副玫瑰苯胺、亞硫酸鈉均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GENESYSTM5紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)Spectronic公司；充氮蒸餾裝置，參考文獻(xiàn)[14]，并改進(jìn)；玻璃轉(zhuǎn)子流量計(jì)(0.15～1.5L/min) 浙江余姚工業(yè)自動(dòng)化儀表廠；DK-98-Ⅱ型1000W萬(wàn)用電爐 天津市泰斯特儀器有限公司；MJ-400BP01C攪拌機(jī) 廣東美的精品電器制造有限公司；高純氮?dú)?純度≥99.9%)。

1.3 方法

1.3.1 試劑配制

鹽酸溶液(1+1)：等體積的濃鹽酸與等體積的蒸餾水混合；2.00g/L氨基磺酸銨溶液；2.00mol/L氫氧化鈉溶液；甲醛緩沖吸收液儲(chǔ)備液：2.04g鄰苯二甲酸氫鉀(KHC8H4O4)、0.37g乙二胺四乙酸二鈉(C10H14N2O8Na2· 2H2O)，加入5.5mL甲醛，加水溶解定容至1L，在5℃條件下避光貯存，保存期不超過(guò)1年；甲醛緩沖吸收液：將甲醛緩沖吸收液儲(chǔ)備液用水稀釋10倍，現(xiàn)配現(xiàn)用；0.5g/100mL鹽酸副玫瑰苯胺儲(chǔ)備液：稱(chēng)取0.50g鹽酸副玫瑰苯胺(C19H18ClN3，PRA)，加水溶解定容到100mL；鹽酸副玫瑰苯胺使用液：取10mL 0.5g/100mL鹽酸副玫瑰苯胺儲(chǔ)備液，加入30mL 磷酸和15mL濃鹽酸，加水稀釋到100mL(避光密封保存)；乙二胺四乙酸二鈉溶液：稱(chēng)取0.37g乙二胺四乙酸二鈉，用新煮沸冷卻水溶解稀釋至1L，現(xiàn)配現(xiàn)用；亞硫酸鹽標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱(chēng)取1.26g亞硫酸鈉(Na2SO3)，溶于200mL乙二胺四乙酸二鈉溶液中，放置2～3h后標(biāo)定，根據(jù)標(biāo)定的亞硫酸鹽含量，立即用甲醛緩沖吸收液稀釋為100.00mg/L(以SO2計(jì))，在5℃條件下避光保存；亞硫酸鹽標(biāo)準(zhǔn)使用液(2.00mg/L)：臨用時(shí)將亞硫酸鹽標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醛緩沖吸收液準(zhǔn)確稀釋50倍。

以上配試劑用水應(yīng)符合 GB/T 6682—2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》二級(jí)水的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2 樣品處理

濕樣用攪拌機(jī)搗碎，干樣用剪刀剪碎，稱(chēng)取10.00g，移入蒸餾瓶中，立即加入100mL新煮沸冷卻的蒸餾水，將蒸餾瓶與通氣蒸餾裝置連接(圖1)，以0.4～0.6L/min流速通入氮?dú)?min后，接入吸收瓶(內(nèi)裝約20mL甲醛緩沖吸收液)。由分液漏斗加入約30mL鹽酸溶液，煮沸蒸餾20min。停止加熱，再通氣2min。取下吸收瓶，用少量甲醛吸收液沖洗導(dǎo)管下端，并入吸收瓶中。將吸收瓶?jī)?nèi)液體轉(zhuǎn)入25mL容量瓶，定容，待測(cè)。

圖1 充氮蒸餾裝置Fig.1 Nitrogen distillation apparatus

1.3.3 測(cè)定

取6個(gè)10mL具塞刻度試管，分別準(zhǔn)確加入0、0.5、1、2、5、8、10mL亞硫酸鹽標(biāo)準(zhǔn)使用液(相當(dāng)于0、1、2、4、10、16、20μg SO2)，用甲醛緩沖吸收液補(bǔ)充總體積至10mL。同時(shí)，據(jù)試樣亞硫酸鹽含量高低，吸取上述蒸餾液0.5～10mL(不足10mL時(shí)，用甲醛緩沖吸收溶液定容至10mL)，于10mL具塞刻度試管中。各管分別加入1mL氨基磺酸銨溶液、1mL氫氧化鈉溶液，混勻后再加入1mL鹽酸副玫瑰苯胺使用液。立即混勻顯色。根據(jù)不同室溫選擇顯色時(shí)間。顯色后于570nm處比色。以含量為橫坐標(biāo)、A570nm為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品中亞硫酸鹽含量(以SO2計(jì))按計(jì)算下式計(jì)算：

式中：X為樣品中亞硫酸鹽的含量/(mg/kg)；m1為由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的測(cè)定用試液中亞硫酸鹽的含量/(μg/mL)；m2為樣品的質(zhì)量/g；V1為樣品液定容體積/mL；V2為測(cè)定用樣品液體積/mL；V3為反應(yīng)體系定容體積/mL，本實(shí)驗(yàn)為10mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法的確定

GB/T 5009.34—2003《食品中亞硫酸鹽的測(cè)定》中分別使用浸泡法和蒸餾法對(duì)樣品進(jìn)行處理。浸泡法處理過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)(4h以上)，使用超聲波輔助浸提可以較大程度上縮短處理時(shí)間。對(duì)兩法進(jìn)行比較(表1)，超聲波輔助浸提，處理過(guò)程簡(jiǎn)單，但是樣品液中存在較多干擾測(cè)定的因素，且不適合于用來(lái)處理色素含量高的樣品；通氣蒸餾法獲得的提取液則較為干凈，適用范圍廣，但一套裝置只可實(shí)時(shí)處理一個(gè)樣品，樣品處理過(guò)程耗時(shí)(每個(gè)約為0.5h)。從準(zhǔn)確性和適用性方面考慮，本方法擬采用通氣蒸餾法。

2.2 蒸餾提取參數(shù)的確定

2.2.1 酸化劑的選擇

加入酸化劑可以促使亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化為SO2的形式蒸餾出來(lái)。通過(guò)加入等體積(30mL)的鹽酸(1+1)、乙酸(1+1)、磷酸(1+1)3種不同酸化劑的效果可以知道，選取鹽酸作為酸化劑能達(dá)到最好效果(圖2)。使用不同濃度鹽酸進(jìn)行酸化，回收率隨著鹽酸濃度的增加而增加，當(dāng)濃鹽酸:水的比值大于1后，回收率不再提高(圖3)。使用高濃度鹽酸存在一定的危險(xiǎn)性，因此選取鹽酸(1+1)為酸化劑最理想。

圖3 濃鹽酸與水的體積比對(duì)提取效果的影響Fig.3 Effect of HCl-water ratio on extraction efficiency

2.2.2 蒸餾時(shí)間的確定

圖4 蒸餾時(shí)間對(duì)提取效果的影響Fig.4 Effect of distillation time on recovery rate

表1 提取方法的比較Table 1 Comparison of extraction methods

在蒸餾燒瓶中加入20μg亞硫酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液(以SO2計(jì))和100mL新煮沸冷卻水，以鹽酸(1+1)為酸化劑，25mL甲醛吸收液作為吸收劑，煮沸蒸餾不同時(shí)間，測(cè)定吸收液中SO2含量，做3個(gè)平行，比較回收率。當(dāng)煮提時(shí)間大于15min時(shí)，回收率趨于穩(wěn)定(圖4)。選擇煮提20min為宜。

2.2.3 吸收劑的選擇

0.1mol/L NaOH溶液、甲醛吸收液、冷水(5℃)均可作為蒸餾吸收液，研究3種溶液作為吸收劑其用量對(duì)回收率的影響。在蒸餾燒瓶中加入相當(dāng)于500μg亞硫酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液(以SO2計(jì))和100mL煮沸冷卻水，以鹽酸(1+1)為酸化劑，使用不同體積溶液作為吸收劑，煮沸蒸餾20min，測(cè)定吸收液中SO2含量，做3個(gè)平行，比較回收率。結(jié)果如表2所示，3種吸收劑作為吸收劑均可得到較高回收率，但是由于SO2以亞硫酸根和亞硫酸的形式存在時(shí)容易被氧化，溶解在NaOH溶液、冷水中不穩(wěn)定，放置一段時(shí)間含量便會(huì)下降。而溶解在甲醛吸收液中則較穩(wěn)定，SO2與甲醛在弱酸性條件下發(fā)生加成反應(yīng)生成穩(wěn)定的羥基甲磺酸，同時(shí)EDTA消除了可能存在的金屬離子的影響，很好地保護(hù)了SO2不被氧化。因此選擇以甲醛吸收液作為吸收劑。甲醛吸收液用量為25mL時(shí)回收率為95%，增加用量回收率沒(méi)有再提高。吸收劑用量太少時(shí)，對(duì)SO2的吸收不完全，從而導(dǎo)致回收率偏低。

巖樣采用薄壁金剛石鉆頭沿垂直于巖層方向鉆取巖芯，經(jīng)過(guò)鋸、磨加工成直徑為50 mm，高為100 mm，試樣兩端面不平行度不大于0.05 mm，滿(mǎn)足《規(guī)程》要求，60組共計(jì)180個(gè)試樣，制備部分試樣，如圖2所示，其中頂板巖石用A編號(hào)，底板巖石用B編號(hào)。試驗(yàn)在RMT-150B型電液伺服巖石力學(xué)試驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行單軸壓縮試驗(yàn)，如圖3所示。軸向荷載采用1 000 kN力傳感器測(cè)量，軸向壓縮變形采用5.0 mm位移傳感器測(cè)量，變形精度為1.0×10-3 mm，采用位移控制方式，加載速率為0.002 mm/s，每組巖性重復(fù)進(jìn)行3次試驗(yàn)。煤層頂?shù)装鍘r石單軸壓縮試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表2 吸收液用量與回收率之間的關(guān)系Table 2 Relationship between absorbent amount and recovery rate %

表3 測(cè)定方法的比較Table 3 Comparison of determination methods for sulfite content

2.2.4 氮?dú)饬魉俚拇_定

氮?dú)饬魉賹?duì)回收率有一定的影響，氮?dú)饬魉龠^(guò)快時(shí)會(huì)導(dǎo)致吸收不完全造成回收率偏低，流速太慢則容易造成倒吸而使提取失敗。由于流速是一個(gè)比較難以精確控制的因素，本實(shí)驗(yàn)以確保不會(huì)發(fā)生倒吸的流速為控制標(biāo)準(zhǔn)，加大吸收液用量的方式確保高回收率。流速維持在0.4～0.6L/min之間時(shí)，可保證提取過(guò)程中不會(huì)發(fā)生倒吸現(xiàn)象。

2.3 測(cè)定方法的確定

2.3.1 測(cè)定方法的選擇

本研究在確定使用蒸餾法提取樣品的前提下，選取中和滴定法等5個(gè)方法進(jìn)行比較(表3)。中和滴定法原理是蒸餾出來(lái)的樣液加過(guò)氧化氫氧化成硫酸后使用NaOH溶液滴定至中性，以消耗的NaOH的量來(lái)計(jì)算SO2，以最低消耗0.1mL 0.01mol/L NaOH計(jì)算，靈敏度為3.0μg/mL (以SO2計(jì))，此法受揮發(fā)性酸物質(zhì)影響較大，往往出現(xiàn)測(cè)定值偏高；間接碘量法測(cè)定靈敏度為3.0μg/mL，此法滴定終點(diǎn)顏色變化雖較直接碘量法容易判斷，但同樣會(huì)造成一定程度的系統(tǒng)誤差，適合于測(cè)定亞硫酸鹽含量較高的樣品；碘還原萃取比色法用氯仿作為萃取，操作時(shí)分離水相和氯仿層較困難，氯仿易揮發(fā)，使得測(cè)得的值容易產(chǎn)生誤差，氯仿有一定毒性，此法靈敏度相對(duì)較低；DTNB比色法靈敏度為1.0μg/mL，但穩(wěn)定性不好；鹽酸副玫瑰苯胺比色法測(cè)定靈敏度及穩(wěn)定性均較高，能夠滿(mǎn)足檢測(cè)需要，因此本實(shí)驗(yàn)采用鹽酸副玫瑰苯胺比色法作為檢測(cè)方法。

2.3.2 鹽酸副玫瑰苯胺法比色體系的改良

鹽酸副玫瑰苯胺比色法原理是亞硫酸鹽在堿性條件下，與甲醛及鹽酸副玫瑰苯胺發(fā)生反應(yīng)，生成紫紅色絡(luò)合物，此反應(yīng)主要受到氮氧化合物的干擾，加入一定量的氨基磺酸銨可消除氮氧化合物對(duì)準(zhǔn)確定量的影響[19]。本實(shí)驗(yàn)研究氫氧化鈉、氨基磺酸銨的用量對(duì)反應(yīng)體系的影響以及比色溫度與時(shí)間的關(guān)系。

方法的靈敏度與反應(yīng)體系pH值相關(guān)，如圖5所示，隨著NaOH用量的增加吸光度先升后降，2mol/L NaOH溶液用量為0.75mL吸光度達(dá)到最大，并于0.75～1.5mL區(qū)間穩(wěn)定。同時(shí)隨著NaOH用量的增加，最大吸收波長(zhǎng)藍(lán)移，用量為1mL時(shí)λmax=560nm。

圖5 NaOH用量對(duì)于吸光度及最大吸收波長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of NaOH amount on absorbance and maximum absorption wavelength

氨基磺酸銨的作用是消除氮氧化合物(如NO3-)的干擾，使定量趨于準(zhǔn)確，與此同時(shí)過(guò)量的氨基磺酸銨會(huì)降低體系的吸光度，不利于提高方法的靈敏度。本研究以空白樣品液中加亞硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的形式探索氨基磺酸銨的合適用量，同時(shí)以等量的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行對(duì)照。研究結(jié)果如圖6所示，在標(biāo)準(zhǔn)溶液體系中隨著2g/L氨基磺酸銨用量的增加吸光度下降，在0.5～1mL區(qū)間下降趨勢(shì)變緩；樣品液體系中，吸光度下降趨勢(shì)呈“陡-平-緩降”的趨勢(shì)，也在0.5～1mL區(qū)間變化較小，在0.75～1.25mL區(qū)間，兩個(gè)體系的吸光度幾乎相等。因此確定2g/L氨基磺酸銨的用量選擇為1mL為宜。

圖6 氨基磺酸銨用量對(duì)反應(yīng)體系的影響Fig.6 Effect of ammonium sulfamate on reaction system

反應(yīng)體系為10mL樣品液+1mL 2g/L氨基磺酸銨+1mL 2mol/L NaOH＋1mL鹽酸副玫瑰苯胺，顯色后在400～700nm處掃描吸收光譜(圖7)，最大吸收光譜出現(xiàn)在560nm處，在550～580nm區(qū)間吸光度變化很小。經(jīng)過(guò)比較，雖然λmax=560nm，但570nm處測(cè)量穩(wěn)定性更好，定量更準(zhǔn)確。

另外，關(guān)于鹽酸副玫瑰苯胺溶液的配制，GB/T 5009.34—2003《食品中亞硫酸鹽的測(cè)定》方法是在鹽酸副玫瑰苯胺水溶液加入鹽酸使其變黃色再加水定容即可，在使用時(shí)反應(yīng)體系中加入堿后再往體系中加入鹽酸副玫瑰苯胺溶液容易造成鹽酸副玫瑰苯胺變回紅色，使顯色失效，使用穩(wěn)定性較差。參照NY/T 1373—2007《食用菌中亞硫酸鹽的測(cè)定充氮蒸餾：分光光度計(jì)法》中方法配制[19]，發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入12mL濃鹽酸時(shí)，鹽酸副玫瑰苯胺由紅色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，需要放置一段時(shí)間才能夠穩(wěn)定；若濃鹽酸量增加為15mL則立即轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的黃色，實(shí)驗(yàn)表明按這種方法配制的溶液剛配好就達(dá)到穩(wěn)定，顯色效果與放置24h后的效果完全一致，空白對(duì)照管不顯色[21-22]。

圖7 吸收光譜掃描圖Fig.7 Absorption spectrum of the reaction product

2.3.2.2 比色溫度與時(shí)間的關(guān)系

在不同溫度條件下，體系顯色反應(yīng)時(shí)間和顯色后穩(wěn)定時(shí)間不同。不同溫度下反應(yīng)體系吸光度的變化情況如圖8所示，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，吸光度先增大，然后在一段時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定不變，最后逐漸下降。反應(yīng)在各溫度下進(jìn)行所需時(shí)間及吸光度穩(wěn)定時(shí)間不同，見(jiàn)圖8。

圖8 溫度與顯色反應(yīng)和顯色穩(wěn)定性的關(guān)系Fig.8 Relationship between reaction temperature and color reaction and color stability

2.4 方法評(píng)價(jià)

2.4.1 線性關(guān)系和線性范圍

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取6個(gè)10mL具塞試管，分別準(zhǔn)確加入0、0.5、1、2、5、8、10mL SO2標(biāo)準(zhǔn)使用液，用甲醛緩沖吸收液補(bǔ)充總體積為10mL，配制成質(zhì)量濃度為0、0.1、0.2、0.4、1.0、1.6、2.0μg/mL梯度系列。各管分別加入1mL氨基磺酸銨溶液、1mL氫氧化鈉溶液，混勻后加入1mL鹽酸副玫瑰苯胺使用液，立即混勻。室溫顯色15min，以0管作為空白調(diào)零，在570nm處測(cè)定吸光度。以SO2質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.3161x-0.0019，R2= 0.9993。在0.1～2.0μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.4.2 方法回收率

取濕樣(新鮮對(duì)蝦)用組織搗碎機(jī)攪碎，干樣(干蝦仁、魷魚(yú)絲)用剪刀剪碎，準(zhǔn)確稱(chēng)取10.00g，移入蒸餾瓶中，加入100mL的新煮沸冷卻的蒸餾水，再分別加入當(dāng)量為3、10、20、40μg SO2標(biāo)準(zhǔn)溶液(加標(biāo)量分別相當(dāng)于0.3、1.0、2.0、4.0mg/kg，充分混勻，立即蒸餾，每個(gè)加標(biāo)水平做6個(gè)平行，測(cè)定回收率，同時(shí)做空白。結(jié)果見(jiàn)表4，平均回收率在80%～100%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。

表4 方法回收率測(cè)定結(jié)果Table 4 Recovery rate of standard sulfite in samples

2.4.3 本方法的檢測(cè)限

根據(jù)一般性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)限的計(jì)算方法[24]，當(dāng)空白測(cè)定數(shù)n＜20，置信水平為95%時(shí)，計(jì)算公式為

式中：Sb為空白平行測(cè)定正標(biāo)準(zhǔn)偏差；f為批內(nèi)自由度；tf為顯著性水平為0.05(單側(cè))自由度為f時(shí)的t值。

根據(jù)此式計(jì)算得本方法的檢測(cè)限為0.11mg/kg，由于在加標(biāo)實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)添加量小于0.30mg/kg時(shí)回收率下降明顯且精密度不好，因此規(guī)定本方法的檢測(cè)限為0.30mg/kg。

3 討 論

3.1 由于亞硫酸鹽暴露在空氣中時(shí)極其不穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)中將固體樣品搗碎后，立即測(cè)定與放置30min后再加入100mL水浸沒(méi)蒸餾測(cè)定，結(jié)果相差很大。因此，為保證測(cè)定的準(zhǔn)確性，處理后的樣品應(yīng)立即進(jìn)行蒸餾提取。對(duì)于未能立即測(cè)定的樣品，可在4℃以下密封短暫保存。與浸泡提取法相比，充氮蒸餾法具有提取時(shí)間較短、樣品干凈背景影響小測(cè)定更準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，但是由于加入強(qiáng)酸并加熱，在如此劇烈條件下如何保護(hù)SO2使之不被氧化成為關(guān)鍵，因此本方法要求配制鹽酸和加入蒸餾瓶中水均為新煮沸冷卻水以排除試劑中溶解氧的影響，另外要求在裝置連接后先通氮?dú)?min后才加入酸再加熱蒸餾，以排出系統(tǒng)中存在的氧氣。

3.2 鹽酸副玫瑰苯胺顯色反應(yīng)是在酸性條件下進(jìn)行。與經(jīng)典的鹽酸副玫瑰苯胺法不同，本法使用甲醛作為吸收液，SO2在甲醛吸收液中與甲醛反應(yīng)以羥甲基磺酸的形式存在，因此在反應(yīng)中需要加入一定量的NaOH堿化。以往的研究中對(duì)堿的用量做了探索[10-11,13,20,23]，但未對(duì)堿在反應(yīng)中的作用進(jìn)行深入的闡述。本實(shí)驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)若不加入堿則顯色反應(yīng)難以進(jìn)行，將甲醛、亞硫酸根依次單獨(dú)加入到鹽酸副玫瑰苯胺反應(yīng)體系當(dāng)中則顯色能順利進(jìn)行，說(shuō)明堿的作用是將羥甲基磺酸分解為甲醛和亞硫酸根。另外，實(shí)驗(yàn)中將亞硫酸鹽、甲醛分別單獨(dú)與鹽酸副玫瑰苯胺溶液混合，不發(fā)生顏色變化。這些現(xiàn)象表明顯色反應(yīng)只有在3種物質(zhì)同時(shí)存在時(shí)才能發(fā)生的，而并非是先生成羥甲基磺酸后再與鹽酸副玫瑰苯胺反應(yīng)，這一結(jié)果與經(jīng)典的鹽酸副玫瑰苯胺法反應(yīng)機(jī)理的表述不同。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以充氮蒸餾提取、甲醛溶液吸收、鹽酸副玫瑰苯胺比色測(cè)定水產(chǎn)品中亞硫酸鹽的含量，濕樣回收率在80%～100%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，檢出限為0.30mg/kg。方法穩(wěn)定性好、使用無(wú)毒試劑、回收率能達(dá)到檢測(cè)的要求，解決了水產(chǎn)品中亞硫酸鹽的測(cè)定。

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Determination of Sulfite in Aquatic Products by Nitrogen Distillation-Pararosaniline Hydrochloride Spectrophotometric Method

CEN Jian-wei，LI Lai-hao*，YANG Xian-qing，HAO Shu-xian，XIN Shao-ping，
WU Yan-yan，CHEN Sheng-jun，HUANG Hui
(South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China)

In this study, the determination of sulfite content in aquatic products was investigated. A nitrogen distillationformaldehyde solution absorption-pararosaniline hydrochloride spectrophotometric method was established through comparing different extraction and determination methods to determine sulfite content in aquatic products. The established method exhibited an excellent linear relationship with correlation coefficient of 0.9993 for sulfur dioxide at the concentration range of 0.1-2.0μg/mL. The recovery rate of this established method was 80%-100% with relative standard deviation of less than 10%. The detection limit of this method was 0.30 mg/kg. Therefore, this developed method is characteristics of good repeatability, less pollution and high recovery rate, which is suitable for the determination of sulfite in aquatic products.

nitrogen distillation；pararosaniline hydrochloride；aquatic products；formaldehyde solution absorption；sulfite

TS207.3

A

1002-6630(2010)24-0395-07

2010-09-01

農(nóng)業(yè)部2008年“水產(chǎn)品中亞硫酸鹽的檢測(cè)”行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃項(xiàng)目(10178)；“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2008BAD94B02)；廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專(zhuān)項(xiàng)(A2009001-011(b)；A200901B02；A200901I03)；農(nóng)業(yè)部中央級(jí)公益性科研院所基本科研項(xiàng)目(2010YD08；2010TS09)

岑劍偉(1976—)，男，助理研究員，碩士，主要從事水產(chǎn)品質(zhì)量安全研究。E-mail：genvex@163.com

*通信作者：李來(lái)好(1963—)，男，研究員，博士，主要從事水產(chǎn)品質(zhì)量安全研究。E-mail：laihaoli@163.com