小米中VB2提取方法研究及其含量測定

董永剛，王 玲*，劉立丹，李 慶

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，河北 保定 071001)

小米中VB2提取方法研究及其含量測定

董永剛1，王 玲2,*，劉立丹2，李 慶1

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，河北 保定 071001)

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)分析研究不同提取液、提取方法和提取條件對小米中VB2提取效果的影響。采用熒光分析法，在激發(fā)波長λex=471.0nm和發(fā)射波長λem=528.0nm時，測定小米中VB2的含量。結(jié)果表明：選取H3PO4溶液為提取液，用水浴回流法，提取液濃度0.1mol/L、提取時間45min、提取液pH5.0時，提取效果最佳，且回收率可達(dá)到89.20%～100.32%，變異系數(shù)可控制在1.21%內(nèi)。實(shí)驗(yàn)精密度和準(zhǔn)確度良好，可快速、準(zhǔn)確的測定小米中VB2含量。

小米；VB2；正交試驗(yàn)；熒光分光光度法

VB2是體內(nèi)一些氧化還原酶的輔基，廣泛參與體內(nèi)各種氧化還原反應(yīng)，能促進(jìn)糖、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝，對維持皮膚、黏膜和視覺的機(jī)能有一定的作用。VB2體內(nèi)不能合成，小米是膳食中VB2的主要來源，因此測定小米中VB2具有重要的意義[1]。

常見的測定VB2的方法有高效液相色譜法[2-3]、熒光光度法[3-4]、毛細(xì)管電泳電化學(xué)法[5]、分光光度法等[6]。樣品的前處理是關(guān)鍵，它直接影響著VB2的提取效果，測量的精密度和準(zhǔn)確度。VB2對熱和酸穩(wěn)定，易溶于酸，在堿性溶液中受光線照射很快轉(zhuǎn)化為光黃素，常用的VB2提取液為鹽酸、H2SO4和乙酸溶液。本實(shí)驗(yàn)擬篩選最適宜提取液，在熒光法分析的基礎(chǔ)上對樣品前處理?xiàng)l件進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化，簡化了提取過程，降低了成本，并且提高VB2的提取效果，旨在為VB2的提取測定方法技術(shù)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米 市售。

VB2標(biāo)準(zhǔn)品 北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；淀粉酶 山東安克生物工程有限公司；3g/100mL KMnO4溶液；體積分?jǐn)?shù)3% H2O2溶液；水為蒸餾水，試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

WFY-28型熒光分光光度計(jì) 天津拓普公司；pHS-23C數(shù)字型精密酸度計(jì) 上海雷磁儀器廠；感量1/萬電子天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)液的制備[7]

VB2于P2O5干燥器中干燥24h，準(zhǔn)確稱取0.0250g。溶解于0.02mol/L乙酸溶液中，在蒸汽浴上恒速攪動至溶解，冷卻后定容至1L，標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度為25mg/L，盛入棕色瓶加甲苯覆蓋，低溫(4℃)保存。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取4.0mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于100mL容量瓶中，定容。分別吸取2.5、5.0、7.5、10.0、12.5mL此溶液于50mL容量瓶中，搖勻后用0.1mol/L磷酸調(diào)至pH5.0，加蒸餾水定容至刻度。此系列標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度為50、100、150、200、250μg/L，依次測定其熒光強(qiáng)度，用所測結(jié)果繪制相對熒光強(qiáng)度與VB2溶液質(zhì)量濃度(c)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 提取方法的選擇

水浴回流法：樣品經(jīng)干燥后研磨，準(zhǔn)確稱取5.00g，于蒸餾瓶中，加入50mL 0.1mol/L磷酸，水浴回流45min，冷卻至室溫后，轉(zhuǎn)至100mL錐形瓶中，加入含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%淀粉酶的2.5mol/L乙酸鈉溶液5.0mL，搖勻，于培養(yǎng)箱中，37.5℃培養(yǎng)18h，調(diào)節(jié)pH5.0，使蛋白質(zhì)充分沉淀，慢速濾紙抽濾，定容至100mL。用此方法測定VB2含量，重復(fù)3次，取平均值。

沸水浴法參考文獻(xiàn)[8]方法；超聲波法參考文獻(xiàn)[9]方法；高壓法參考文獻(xiàn)[10]方法。

1.3.4 提取液的選擇

分別以0.1mol/L三氯乙酸溶液、H2SO4溶液[7]、鹽酸溶液[10]、H3PO4溶液、甲酸和乙酸溶液[11]為提取液，用水浴回流法提取小米中的VB2，每種方法重復(fù)3次，提取液經(jīng)處理后測定VB2含量，比較6種提取液的提取效果，以選擇提取效果較好的提取液。

1.3.5 提取條件對提取效果的影響

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對提取時間、提取液濃度、提取液pH值3個因素各取3個水平，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)[12]，以測定VB2含量作為指標(biāo)進(jìn)行考察，因素水平見表1。

表1 小米中VB2提取正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for extraction of VB2from millet

1.3.6 樣品測定

樣品經(jīng)干燥后研磨，準(zhǔn)確稱取5.00g，于蒸餾瓶中，加入50mL 0.1mol/L H3PO4溶液，水浴回流45min，冷卻至室溫后，轉(zhuǎn)至100mL錐形瓶中，加入含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%淀粉酶的2.5mol/L乙酸鈉溶液5.0mL，搖勻，于培養(yǎng)箱中，37.5℃培養(yǎng)18h，調(diào)節(jié)pH5.0，使蛋白質(zhì)充分沉淀，慢速濾紙抽濾，定容至100mL。移取10mL于錐形瓶中，加1.0mL乙酸和1.0mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)3g/100mL的KMnO4溶液，靜置2min，向試樣中滴加0.5mL體積分?jǐn)?shù)3%的H2O2溶液，搖勻，至溶液中無氣泡產(chǎn)生[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 波長掃描

用移液管移取2mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于100mL容量瓶中，定容后取10mL溶液于三角瓶中，調(diào)節(jié)pH5.0，用熒光分光光度計(jì)在400～600nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描見圖1。由圖1可知，VB2的最佳激發(fā)波長λex=471.0nm，最佳發(fā)射波長為λem=528.0nm。

圖1 VB2的激發(fā)(A)和發(fā)射(B)波長掃描Fig.1 Excitation(A) and emission(B) spectrum of VB2

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

圖2 VB2標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Calibration curve of VB2

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)得到回歸方程為y=0.3186x+ 1.09，r=0.9993。VB2溶液在50～250μg/L范圍內(nèi)呈較好的線性關(guān)系。

2.3 提取液的選擇

圖3 不同提取液提取小米中VB2結(jié)果比較Fig.3 Comparison of VB2 in the millet with extracts

從圖3可以看出，無機(jī)酸的提取效果優(yōu)于有機(jī)酸提取，用H3PO4和H2SO4溶液提取效果較好，甲酸溶液提取效果最差，由此實(shí)驗(yàn)選取0.1mol/L 的H3PO4溶液為提取液。

2.4 提取方法的選擇

圖4 不同提取方法提取小米中VB2結(jié)果比較Fig.4 Yield of VB2 in the millet using different extraction methods

從圖4可以看出，4種提取方法相比，超聲波法提取效果最差，高壓法和回流法標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，提取效果較好，但是高壓法需要把VB2還原成無熒光物質(zhì)[10]，步驟較多，且多次重復(fù)測定結(jié)果表明回流法的精密度較高，且成本較低，所以實(shí)驗(yàn)選擇回流法提取。

2.5 提取條件的選擇優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)選取H3PO4溶液作為提取液，則小米中VB2的提取效果主要受到提取液濃度、提取時間和提取液pH值3個因素的影響，經(jīng)過正交試驗(yàn)(表2、3)可確定這3個影響因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響大小，以優(yōu)化提取條件，達(dá)到理想的測定結(jié)果。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance

由表2可見，各因素指標(biāo)的極差均大于空列的極差，表明各因素效應(yīng)對試驗(yàn)均產(chǎn)生影響，提取后溶液的pH值是影響VB2提取量的主要因素，H3PO4溶液濃度次之，提取時間最小。根據(jù)各指標(biāo)的均值確定各因素的最佳水平組合為A1B3C2，即H3PO4溶液濃度為0.1mol/L，水浴回流45min，提取液pH5.0時，提取效果最佳。方差分析結(jié)果(表3)表明，提取液pH值對VB2的浸出量影響極顯著，提取液濃度影響顯著。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn)

平行移取5份樣品液做精密度測定，測得5份樣品的平均值為3.14μg/g，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.038，變異系數(shù)較小為1.21%，用此法測定VB2含量，測定結(jié)果重復(fù)性好。

2.7 VB2含量及加標(biāo)回收率測定

表4 兩種測定方法結(jié)果比較Table 4 Comparison of two measurement methods of VB2

標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定小米中VB2的含量，并與國標(biāo)[7]測定結(jié)果比較，見表4，結(jié)果表明本方法與國標(biāo)測定結(jié)果基本一致，但相對國標(biāo)需要把VB2還原成無熒光物質(zhì)[7]，本實(shí)驗(yàn)用水浴回流法提取小米中VB2實(shí)驗(yàn)操作簡單、快速、成本較低。

2.8 回收率實(shí)驗(yàn)

表5 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of recovery experiment

平行稱取3份每份5.00g試樣，分別加入0.20、0.25、0.30mL VB2標(biāo)準(zhǔn)溶液測定回收率， 3個樣品的回收率測定結(jié)果，每個樣品平行測定3次。由表5可見，本實(shí)驗(yàn)測定VB2的平均回收率為94.28%。

3 結(jié) 論

3.1VB2在酸性介質(zhì)中較穩(wěn)定，在酸解處理法中，酸濃度和時間對測定結(jié)果有一定影響，本實(shí)驗(yàn)以0.1mol/L H3PO4溶液為提取液，通過正交試驗(yàn)對酸解條件進(jìn)行優(yōu)化，與常用的鹽酸溶液、乙酸溶液等提取液比較，提高了實(shí)驗(yàn)精密度和準(zhǔn)確性。相對高壓法需要把VB2還原成無熒光物質(zhì)[10]，本實(shí)驗(yàn)用水浴回流法提取小米中VB2實(shí)驗(yàn)成本低，精密度和準(zhǔn)確度良好，可快速、準(zhǔn)確的測定小米中VB2含量。

3.2 樣品經(jīng)提取后，加入淀粉酶，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h，使結(jié)合型VB2轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x型VB2，以達(dá)到理想的提取效果。提取液過濾后加入KMnO4溶液氧化其中雜質(zhì)，排除干擾，提高測量的準(zhǔn)確性。

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Extraction and Determination of Vitamin B2in Millet

DONG Yong-gang1，WANG Ling2,*，LIU Li-dan2，LI Qing1
(1. College of Food Science, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China；2. College of Science, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China)

Effect of the extraction method, solvent, solvent concentration, pH and time on the yield of vitamin B2in the millet was studied through single factor test and orthogonal design test. Vitamin B2content was determined by fluorophotometric method with excitation and emission wavelength at 471.0 nm and 528.0 nm, respectively. In the optimum extraction conditions, millet was extracted with 0.1 mol/L of aqueous H3PO4 at pH 5.0 for 45 min in a water bath backflow. Under such conditions, the recovery of VB2was from 89.20% to 100.32%, with the coefficient of variation 1.21%.

millet；vitamin B2(VB2)；orthogonal experiment；fluorophotometry

Q563.2

A

1002-6630(2010)24-0341-04

2010-03-03

董永剛(1981—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。E-mail：dygysq@sina.com

*通信作者：王玲(1963—)，女，教授，研究方向?yàn)榉治龌瘜W(xué)。E-mail：wanglinghbnd@163.com