王書軍 付 煒 張文杰

·論著·

胚胎干細(xì)胞標(biāo)志CD31、SSEA-1在小鼠胚胎發(fā)育和成體組織中表達(dá)的初步研究

王書軍 付 煒 張文杰

目的觀察胚胎干細(xì)胞表面標(biāo)志CD31、SSEA-1在小鼠胚胎發(fā)育過程中不同階段的表達(dá)及在新生鼠、成體骨髓、睪丸中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步利用它們作為分子標(biāo)志從胚胎及成體組織中分離多潛能性干細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。方法本實驗選用129/SV系小鼠。孕10.5天、14.5天、18.5天的胚胎各取3例，新生鼠、6周齡成年鼠骨髓、成體睪丸各取3例，0.3%膠原酶消化獲得單細(xì)胞懸液，經(jīng)抗體染色標(biāo)記后，通過流式細(xì)胞儀分析CD31、SSEA-1的表達(dá)情況。結(jié)果胚胎第10.5天、14.5天、18.5天和新生鼠中均有CD31、SSEA-1的表達(dá)，陽性細(xì)胞量隨胚胎發(fā)育呈下降趨勢。成年鼠骨髓和睪丸組織中也有CD31、SSEA-1陽性細(xì)胞存在，含量低于胚胎中的數(shù)量。結(jié)論CD31、SSEA-1在小鼠個體發(fā)育過程以及成體組織中都有不同程度的表達(dá)，陽性細(xì)胞比率隨個體發(fā)育而降低。

血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1時相專一性胚胎抗原-1胚胎骨髓睪丸

具有分化全能性的干細(xì)胞（Pluripotent stem cell）可以從胚胎發(fā)育早期甚至成體組織中分離獲得，如從囊胚中可以獲得胚胎干細(xì)胞（Embryonic stem cell），從成體睪丸中可以獲得精原干細(xì)胞（Spermatogonial stem cell）等[1]。如何找到合適的細(xì)胞表面標(biāo)志物，以利于從組織中高效地分離全能干細(xì)胞是研究的熱點。以往研究表明，血管內(nèi)皮粘附分子(Plaletetendothelial cell adhesion molecule，PECAM-1/CD31)和時相專一性胚胎抗原-1（Stage specificembryonicant-1，SSEA-1）在小鼠的胚胎干細(xì)胞中有很高的表達(dá)[2-3]。研究證實，CD31和SSEA-1可以作為分子標(biāo)志從長期分化的擬胚體（Embryonic bodies，EBs）和畸胎瘤組織中分離培養(yǎng)得到全能干細(xì)胞[4]，提示它們可能是合適的全能干細(xì)胞標(biāo)記。

本研究擬觀察CD31、SSEA-1在小鼠胚胎發(fā)育不同時間點、新生鼠、成體鼠骨髓和睪丸中的表達(dá)及變化過程，以期揭示它們作為分子標(biāo)志分選全能干細(xì)胞的可能性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

本實驗所用動物取自我院SPF飼養(yǎng)的129/SV小鼠。雌雄鼠合籠第二天檢查陰栓，記為0.5天，分別取懷孕10.5 d、14.5 d、18.5 d孕鼠各3例，新生鼠、成體骨髓、成體睪丸各取3只用于實驗。

1.2 試劑及儀器

主要試劑：一抗兔抗鼠CD31（BD公司，美國）；SSEA-1小鼠單克隆抗體IgM（Santa Cruz公司，美國）；二抗PE-Cy5（BD公司，美國）；FITC（eBioscience公司，美國)；0.3%膠原酶(SERVA，德國)、胎牛血清（GIBCO公司，美國）、紅細(xì)胞裂解液（BD公司，美國）、PBS緩沖液。主要儀器與設(shè)備：超凈工作臺（上海博訊實業(yè)有限公司）、EpicsAltra流式細(xì)胞分析儀(Beckman Coulter，美國)、恒溫?fù)u床（上海一恒科技有限公司）、普通臺式離心機(jī)（(Beckman Coulter，美國）、50 mL離心管（BD公司，美國）。

1.3 細(xì)胞獲得

頸椎脫臼法處死小鼠，75%乙醇溶液浸泡3 min；于超凈工作臺內(nèi)用眼科剪、眼科鑷取胚胎、新生鼠及成體鼠骨髓、睪丸并剪碎；加入0.3%膠原酶，37℃恒溫?fù)u床5～10 min，加入適量血清終止消化，通過單細(xì)胞濾網(wǎng)獲取所需細(xì)胞；37℃、1 500 r/min離心5 min，吸去上清液，紅細(xì)胞裂解液重懸離心管內(nèi)細(xì)胞（9份裂解液∶1份細(xì)胞），將離心管放置冰盒內(nèi)10 min；4℃、2 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞準(zhǔn)備染色。

1.4 流式細(xì)胞分析

吸去上清液，加入適量PBS緩沖液重懸細(xì)胞，吹打均勻，平均移至EP管中；加入一抗（1∶200），4℃孵育30 min，含2%羊血清的PBS漂洗3遍，加入二抗（PE-Cy5，1∶1 000；FITC，1∶200）4℃孵育30 min，含有2%胎牛血清的PBS漂洗3遍，上流式細(xì)胞儀分析。

2 結(jié)果

細(xì)胞經(jīng)抗原抗體染色標(biāo)記后，可經(jīng)流式細(xì)胞儀觀察到4個亞群，包括CD31+SSEA-1-、CD31+SSEA-1+、CD31-SSEA-1+和CD31-SSEA-1-細(xì)胞群，在發(fā)育的胚胎或成體骨髓、睪丸組織中均存在（圖1）。

各時間點的胚胎、新生鼠以及成年鼠骨髓、睪丸樣本均重復(fù)3例。分析結(jié)果顯示，CD31在10.5 d、14.5 d、18.5 d胚胎中的表達(dá)率分別為37.0%、20.7%和15.7%；SSEA-1在10.5 d、14.5 d、18.5 d胚胎中的表達(dá)率分別為4.1%、1.5%和1.2%（圖2）。CD31的表達(dá)隨著胚胎發(fā)育過程有下降的趨勢；SSEA-1表達(dá)量在胚胎發(fā)育過程中均維持在較低水平。CD31在新生鼠中的表達(dá)率為8.4%，低于在胚胎中的表達(dá)；SSEA-1在新生鼠中的表達(dá)率為1.3%，略高于在晚期胚胎中的表達(dá)。CD31在成體小鼠骨髓中表達(dá)率為10.3%，低于在胚胎中的表達(dá)，但高于在新生鼠中的表達(dá)；SSEA-1表達(dá)率2.2%。成體小鼠睪丸中CD31及SSEA-1的表達(dá)率均較低，分別為3.2%和1.4%。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測CD31、SSEA-1在胚胎發(fā)育過程和新生鼠以及成體鼠骨髓、睪丸中的表達(dá)

圖2 CD31、SSEA-1在不同時間胚胎和新生鼠及成體鼠、睪丸中的表達(dá)

在胚胎和成體組織中均發(fā)現(xiàn)CD31+SSEA-1+細(xì)胞，除早期胚胎（E10.5）含量較高外（2.8%），其他組織均維持在較低水平（0.2%～0.7%）。

3 討論

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，除了從囊胚中分離獲得的胚胎干細(xì)胞具有分化全能性以外，成體組織中也發(fā)現(xiàn)了具有3個胚層分化能力的干細(xì)胞[5-6]。因此，Ratajczak等[7]提出多潛能性干細(xì)胞分化殘留的設(shè)想。他們認(rèn)為，在個體發(fā)育過程中，可能有極少量的多潛能性干細(xì)胞始終保持原始的未分化狀態(tài)，且在發(fā)育過程中遷移至不同的組織中并保留至成體。但迄今尚無證據(jù)證實該假說。我們的前期研究證實，小鼠胚胎干細(xì)胞在體內(nèi)外分化過程中殘留有未分化的全能性細(xì)胞，為發(fā)育過程中干細(xì)胞殘留提供了間接的證據(jù)。為了找到直接證據(jù)，尋找合適的干細(xì)胞標(biāo)志是關(guān)鍵。我們推測，殘留細(xì)胞可能表達(dá)胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志。通過胚胎干細(xì)胞分化殘留實驗，我們發(fā)現(xiàn)殘留細(xì)胞表達(dá)CD31和SSEA-1，進(jìn)一步推測這兩個細(xì)胞表面分子可能是發(fā)育過程中殘留干細(xì)胞的標(biāo)志，因此我們對胚胎及成體中這兩個分子的表達(dá)進(jìn)行了分析。

CD31最早表達(dá)于囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，形成外胚層（Epiblast）后表達(dá)降低，在E6.5 d左右血管和血液系統(tǒng)形成時再次出現(xiàn)，之后表達(dá)廣泛存在于內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、巨噬細(xì)胞、肝Kupffer細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等類型的細(xì)胞中，通常被當(dāng)作是內(nèi)皮細(xì)胞和成血管細(xì)胞的表面分子標(biāo)志[8]。SSEA-1最早表達(dá)于8細(xì)胞后期，在桑椹胚的表達(dá)最為顯著，隨后在囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)內(nèi)有少量表達(dá)，胚胎著床后SSEA-1從滋養(yǎng)外胚層消失，以后又出現(xiàn)于原始生殖細(xì)胞表面。成年小鼠中，生殖系統(tǒng)中的子宮內(nèi)膜、輸卵管、腎小管、精子均能檢測到少量的SSEA-1表達(dá)。另外，小腦和神經(jīng)干細(xì)胞中也能檢測到它的少量表達(dá)[9]。SSEA-1一直被認(rèn)為是小鼠胚胎干細(xì)胞的分子標(biāo)記，其在小鼠的胚胎干細(xì)胞中高度表達(dá)，并且在胚胎植入到子宮之前的細(xì)胞遷移和細(xì)胞黏附中起著重要作用。小鼠胚胎干細(xì)胞表達(dá)CD31和SSEA-1，在體外類胚體分化過程中CD31表達(dá)迅速下降而SSEA-1下降緩慢，分化第二天時可見CD31-SSEA-1+細(xì)胞，這群細(xì)胞與從胚胎植入后外胚層分離的外胚層干細(xì)胞（Post-implantation epiblast-derived stem cells）相似。進(jìn)一步分化后，SSEA-1的表達(dá)也降低，而CD31的表達(dá)重新上升，這與血液和血管細(xì)胞分化有關(guān)[10]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)CD31的表達(dá)隨胚胎發(fā)育陽性細(xì)胞比率逐漸減少，而在成體骨髓中仍有高表達(dá)，推測與骨髓中血液細(xì)胞有關(guān)。SSEA-1的表達(dá)隨胚胎發(fā)育陽性細(xì)胞比率逐漸減少這與預(yù)期的結(jié)果一致。

本研究證實，在胚胎和成體組織中均有CD31+SSEA-1+細(xì)胞存在，除早期胚胎（E10.5）含量較高（2.8%）外，其他組織均維持在較低水平（0.2%～0.7%）。如果CD31+SSEA-1+細(xì)胞代表或富含分化殘留的全能干細(xì)胞，那么這一比率是比較符合的，有待細(xì)胞分選實驗進(jìn)一步證實。前期我們對胚胎不同階段的細(xì)胞作了分選和培養(yǎng)，沒有獲得胚胎干細(xì)胞樣的細(xì)胞，可能與培養(yǎng)方法和條件有關(guān)。Guan等[11]發(fā)現(xiàn)，睪丸細(xì)胞如果直接在胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，并不能獲得胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞，只有首先在精原干細(xì)胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)獲得克隆，才能進(jìn)一步在胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)條件下擴(kuò)增。因此，培養(yǎng)成體組織中的干細(xì)胞方法有待于繼續(xù)探索。

CD31+SSEA-1+細(xì)胞在胚胎和成體組織中的存在，提示它們有可能作為分子標(biāo)志，來證實Ratajczak等提出的多潛能性干細(xì)胞分化殘留的假說。

[1]Ogawa T,Ohmura M,Tamura Y,et al.Derivation and morphological characterization of mouse spermatogonial stem cell lines[J].Arch Histol Cytol,2004,67(4):297-306.

[2]Bao S,Tang F,Li X,et al.Epigenetic reversion of post-implantation epiblast to pluripotent embryonic stem cells[J].Nature,2009,461 (7268):1292-1295.

[3]Abaskharoun M,Bellemare M,Lau E,et al.Expression of hyaluronan and the hyaluronan-binding proteoglycans neurocan,aggrecan,and versican by neural stem cells and neural cells derived from embryonic stem cells[J].Brain Res,2010,1327:6-15.

[4]付煒,皮慶猛,石倫剛,等.類胚體中殘留未分化胚胎干細(xì)胞的初步研究[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2009,29(7):808－812.

[5]Jiang Y,Vaessen B,Lenvik T,et al.Multipotent progenitor cells can be isolated from postnatal murine bone marrow,muscle,and brain[J].Exp Hematol,2002,30(8):896-904.

[6]Seandel M,James D,Shmelkov SV,et al.Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR125+germline progenitors [J].Nature,2007,449(7160):346-350.

[7]Ratajczak MZ,Machalinski B,Wojakowski W,et al.A hypothesis for an embryonic origin of pluripotent Oct-4(+)stem cells in adult bone marrow and other tissues[J].Leukemia,2007,21(5):860-867.

[8]Watt SM,Gschmeissner SE,Bates PA.PECAM-1:its expression and function as a cell adhesion molecule on hemopoietic and endothelial cells[J].Leuk Lymphoma,1995,17(3-4):229-44.

[9]Fox N,Damjanov I,Martinez-Hernandez A,et al.Immunohistochemical localization of the early embryonic antigen(SSEA-1)in postimplantation mouse embryos and fetal and adult tissues[J]. Dev Biol,1981,83(2):391-398.

[10]Yue W,Pi QM,Zhang WJ,et al.PECAM-1,SSEA-1 and Flk-1 mark distinct populations of mouse embryonic stem cells during differentiation towards hematopoietic/endothelial cells[J].Stem Cells Dev,2010,[Epub ahead of print]

[11]Guan K,Nayernia K,Maier LS,et al.Pluripotency of spermatogonial stem cells from adult mouse testis[J].Nature,2006,440(7088): 1199-1203.

Primary Study of the Expression of Embryonic Stem Cell Markers CD31 and SSEA-1 in Developing Embryos and Adult Tissues

WANG Shujun,FU Wei,ZHANG Wenjie.
Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,National Tissue Engineering Center,Shanghai 200011,China.Corresponding author:ZHANG Wenjie.

ObjectiveTo detect the expression of CD31 and SSEA-1 at different stages of developing embryos,as well as their expressions in neonates,adult bone marrow and testis.Methods129/SV mice were mated.Embryos at 10.5 postcoitus(E10.5),14.5 and 18.5 days were collected.In addition,neonatal mice,bone marrow and testis from 6-week-old mice were also collected.Single cell suspension was achieved by digestion with collagenase.After anti-CD31 and anti-SSEA-1 antibody labeling,cells were analyzed by flow cytometry.ResultsCD31 and SSEA-1 were expressed in E10.5, E14.5 and E18.5.The expression levels were decreased with the development of embryos.Meanwhile,both markers were observed in neonates,adult bone marrow and testis,but the level was lower than in embryos.ConclusionA certain amount of CD31 and SSEA-1 expressing cells are existing in developing embryos as well as in adult tissues.

CD31;SSEA-1;Embryo;Bone marrow;Testis

Q813.1+1

A

1673－0364（2010）05－0241－03

2010年8月3日，

2010年9月25日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.05.001

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（2005CB522705）；國家自然科學(xué)基金（30571925，30671051）；上海市曙光人才計劃（06SG22）；上海交通大學(xué)博士點創(chuàng)新基金（BXJ0920）。

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科；組織工程國家工程中心。

張文杰。