金環(huán)蛇毒細胞毒素抗腫瘤研究現(xiàn)狀的分析

肖月 羅小玲

惡性腫瘤是嚴重危害人類健康的疾病。在我國每年至少有160萬新增癌癥患者，而且每年約有130萬人死于癌癥，隨著人口數(shù)量的增加和人口老齡化的加快，腫瘤發(fā)病率和死亡率也呈上升趨勢。因此腫瘤的防治工作一直是我國醫(yī)藥衛(wèi)生領域的重點，尋找安全有效的藥物是腫瘤治療中的重要課題[1]。我國在蛇毒抗腫瘤方面的研究已達國際先進水平[2]。本文將目前國內外有關金環(huán)蛇毒細胞毒素抗腫瘤的報道作簡要綜述。

1 蛇毒抗腫瘤組分分類

按作用機制可將蛇毒抗腫瘤組分分為4類：(1)抑制腫瘤組織內的血管增生以及腫瘤細胞間的粘附，稱為解離素；(2)直接作用于腫瘤細胞膜，有溶胞作用，稱為細胞毒素；(3)誘導細胞凋亡組分；(4)酶及蛇毒因子等。

細胞毒素是蛇毒中一類強堿性、高毒性的多肽。迄今已從眼鏡蛇科的粗毒中分離出20多種細胞毒素，對這些毒素的分析研究表明，細胞毒素具有以下的理化特性：(1)由60～63個氨基酸殘基組成的含大量疏水性殘基，帶有較多正電荷的強堿性多肽；(2)由4個二硫鍵交叉連接的單鏈組成；(3)相對分子量6000～7000；(4)具有三指結構，二級結構分析顯示缺乏螺旋，主要由折疊組成；(5)耐高溫，耐強酸、強堿，能對抗水解酶，提示其作用與酶活性無關[3]。

盡管金環(huán)蛇毒的心臟毒素與眼鏡蛇毒心臟毒素在生理功能上有相同的作用，但兩者的氨基酸組成有較大的差異，因此我們也同樣稱之為類心臟毒素(cardiotoxin-Like)。金環(huán)蛇毒中心臟毒含量較高，占全毒的40%以上(46%)且分子量較小，對熱(60℃)2h不失活，對酸(10%醋酸)穩(wěn)定，比較易于純化，同時又是一個生物活性較高的毒蛋白，對正常細胞有一定作用，也可采用局部給藥法將金環(huán)蛇毒心臟毒注射于人腫瘤生長處，殺死癌細胞，或者將它與單克隆抗體結合在一起，制備免疫毒素，直接作用于靶細胞。因而，它是一種有潛力值得探討的抗癌細胞藥物。

2 金環(huán)蛇毒研究進展

由于金環(huán)蛇毒造價昂貴，所以較對于眼鏡蛇毒的研究而言國內外對于金環(huán)蛇毒的研究較為局限。迄今為止，國內外的研究主要集中在神經毒、細胞毒和磷脂酶A2等組分上，對L-氨基酸氧化酶[4]的神經毒毒理作用的研究、神經毒素及類心臟毒素的結構與功能，以及金環(huán)蛇毒對腫瘤細胞產生細胞毒性作用的文獻均尚未見系統(tǒng)報道[5]。

國內廣西醫(yī)科大學等曾對金環(huán)蛇粗毒做過一些酶活性測定及抗凝血、鎮(zhèn)痛作用的測定，但還未見有分離純化的報道[6]，金環(huán)蛇毒成分復雜，既含有多種酶又含有大量具有不同生物學活性的蛋白質與肽類，具有多方面的藥理作用，如抗炎、抗血小板聚集、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等。隨著蛇毒毒理學、藥物學、生物化學和分子生物學的發(fā)展，近年來國內外學者越來越重視蛇毒抗腫瘤作用的研究,報道金環(huán)蛇毒在體內體外都具有抗腫瘤作用[7]。

2.1 金環(huán)蛇毒心臟毒素作用機制的研究

1972年Lin Shiau等[8]從臺灣金環(huán)蛇毒中分離出2種心臟組分，它們的功能屬于膜活性多肽，但其氨基酸組成、分子量、等電點等與一般研究較多的細胞毒素有較大差別而被稱為類心臟毒素。1978年Lu和Lo[9]報道了其中1種類心臟毒素的氨基酸序列。作為毒性成分之一的細胞毒存在于眼鏡蛇科和南非唾蛇屬等蛇毒中。60年代，人們從多種眼鏡蛇科毒蛇中分離純化到多個細胞毒，它們有多種不同的生物效應，如溶血作用、殺細胞作用、去極化作用、抗菌作用和心臟毒作用。1967年Braganca[10]等從眼鏡蛇毒中分離到對吉田肉瘤生長有抑制作用的眼鏡蛇毒細胞毒素，1968年Brisbois[11]從眼鏡蛇毒中分離到對艾氏腹水癌細胞具有抑制作用的組分。1975年Lin Shiau等用CM-纖維素分離金環(huán)蛇毒得到兩個心臟毒組份A和B，并進行了有關化學及藥理學性質的研究，證明其藥理作用與眼鏡蛇毒細胞毒相同，對Hela、KB細胞和吉田肉瘤有細胞毒活性[12]。近10年來，有關眼鏡蛇毒細胞毒、響尾蛇毒細胞毒、響尾蛇毒蛋白(CT)與細胞毒蛋白(CD)結合物作為抗癌試劑對多種動物實驗性腫瘤細胞及多種人癌細胞在體內及體外產生細胞毒性作用曾相繼為人們重視和報道。

2.2 金環(huán)蛇細胞毒素的氨基酸組成研究

在蛇毒細胞毒素中，絕大部分已知細胞毒素含有58～61個氨基酸，它們都是單鏈的蛋白質，在分子內含有4對二硫鍵?？捉?、吳秀榮等[13]從廣東金環(huán)蛇蛇毒中分離、純化了1個組分第XII峰，并稱它為細胞毒素XIII。它由116個氨基酸殘基組成，且含有6對二硫鍵。它的氨基酸組成與最近Lu Hsieng-sen和Lo Tung-bin發(fā)表的Miami金環(huán)蛇類心臟毒素VIB的組成極為相似，也屬于長鏈細胞毒素。廣東產金環(huán)蛇細胞毒素XIII的氨基酸組成表明它是由116個氨基酸殘基組成，其中含有6個胱氨酸、14個芳香族氨基酸、22個酸性氨基酸、15個堿性氨基酸。由于整個毒素分子呈堿性，所以有相當數(shù)量的酸性氨基酸是以酰胺的形式存在于分子中。該細胞毒素與昆明動物研究所、北京生物物理研究所發(fā)表的金環(huán)蛇類心臟毒B的氨基酸組成有相當程度的差異。與Lu Hsieng-sen和Lo Tung-bin[14]發(fā)表的Miami金環(huán)蛇類心臟毒素VIB的氨基酸組成極為相似，僅差2個氨基酸殘基。

廣西產金環(huán)蛇蛇毒中類心臟毒素分為A、B兩部分，2種毒素氨基酸組成十分相似，通過凝膠過濾，測得它們的分子量分別為15900和12100。它們N端的2個氨基酸順序完全相同，為Gly.Leu…。經羧肽酶A降解測得它們的C端順序為……Ala.Cys.Tyr。等電聚焦測得它們的等電點分別為8.8和9.2。紫外吸收光譜顯示它們279nm分別是11.7和12.7[15]。

2.3 金環(huán)蛇細胞毒素抑癌作用研究

關于眼鏡蛇毒細胞毒素對癌細胞的抑制作用的確切機理尚不清楚,有學者認為細胞毒素破壞細胞的作用機理主要是依賴毒素分子有較多的堿性基團與細胞膜表面磷脂的酸性基團結合,進而由毒素分子內高含量的疏水側鏈與脂層作用,從而擾亂雙層膜達到破壞細胞膜的作用[16]。雷丹青[17]等通過采用MTT法檢測CTX對人鼻咽癌細胞株、淋巴瘤細胞株、S180癌細胞株、人宮頸癌細胞株和卵巢癌細胞株體外細胞毒作用得出結論，細胞毒素對體內外癌細胞殺傷作用差異大的原因在于進入體內, 其作用即被Ca2+所拮抗,作用減弱,加入EDTA后Ca2+被絡合,療效就提高,因此S180載瘤小鼠生命延率從23%提高到40%，但不可能把體內生理所需的Ca2+都絡合,這提示改良給藥方式,維持CTX長期低濃度發(fā)揮作用或利用CTX進行腫瘤的免疫導向治療,從而減輕CTX的不良反應,是取得良好療效的關鍵。

3 結束語

腫瘤藥物治療是一個經久不衰的話題，目前為止還沒有找到更好的藥物根治它。傳統(tǒng)的治療惡性腫瘤的手段以化療、放療、手術切除為主，但這些傳統(tǒng)方法對病人愈后效果均不是很好，對病人傷害很大，很難恢復。尋找副作用小又可以更好遏制惡性腫瘤的藥物是國內外學者潛心研究的著眼點，為此生物治療藥物納入了學者們的視線。新型的抗腫瘤藥物為分子靶向性治療藥物，分子靶向性治療藥物能夠對癌細胞的增殖、浸潤、轉移的重要靶分子發(fā)揮作用,最大限度地阻礙腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉移。因分子靶向性治療藥物的副作用常常很少,且可間接抑制腫瘤的增殖、進展,長期維持與宿主的共存狀態(tài),在生存期的延長和改善生活質量方面,對于高齡腫瘤患者來說臨床意義深遠[18]。

蛇毒抗腫瘤這一嶄新的話題開啟了生物治療惡性腫瘤的新篇章，這一領域的研究還在不斷完善、不斷更新中。用蛇毒及其有效組分抗癌的研究國內外早已展開[19-20],但由于眼鏡蛇毒中成分復雜,大多數(shù)組分直接進入體內都可能對機體產生嚴重毒性反應,直接用全蛇毒或其某一天然成分(如對細胞有直接溶解作用的組分C)的體外抗癌雖確有一定效果,但臨床實際應用風險很大,因此,這些研究成果很難在臨床應用和推廣。國內有學者報道眼鏡蛇毒通過口服途徑給藥,眼鏡蛇毒、蟑螂毒可抑制小鼠移植性肝癌的生長,而且無明顯的毒副作用[21]。但對于有消化道破損的病人,用蛇毒直接口服就有使蛇毒直接進入血液循環(huán)的危險,不利于在臨床推廣應用[22]。

4 展望

雖然金環(huán)蛇毒細胞毒素抗腫瘤研究尚處于摸索階段，但其潛在的開發(fā)價值與應用價值值得學者們投入更大的精力潛心研究。相信在不久的將來，國內外學者對金環(huán)蛇毒細胞毒素抗腫瘤的研究會有更多、更廣、更深的發(fā)現(xiàn)。充分利用我國豐富的蛇資源，并將其應用于生物治療領域是每一位醫(yī)學科研者神圣的使命。

[1]孫晉民.蛇毒抗腫瘤成分的篩選及對人腫瘤細胞抑制作用的研究[J].中國優(yōu)秀博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫,2003.

[2]孫德軍,王偉,楊同書.蛇毒解整合蛋白抗腫瘤研究進展[J].中國老年學雜志,2006,26(7):1006-1009.

[3]張正明,芮景.蛇毒抗腫瘤作用研究進展[J].國際腫瘤學雜志,2006,33(5):354-357.

[4]魏繼福,楊海偉,喬麗雅,等.金環(huán)蛇L-氨基酸氧化酶誘導人臍靜脈內皮細胞凋亡的研究[J].中國現(xiàn)代應用醫(yī)藥,2006,22(2):251-256.

[5]董躍偉,徐天瑞,王婉瑜,等.金環(huán)蛇毒心臟毒對S180_EAC腹水癌細胞的細胞毒性作用[J].中國現(xiàn)代應用藥學,2001,18(4):271-273.

[6]肖昌華,張洪基,雷克健.金環(huán)蛇蛇毒類心臟毒素的純化及生化分析[J].動物學研究,1981,2(1):49-54.

[7]李牡艷,韋世秀,劉成軍,等.金環(huán)蛇毒體外對人類小涎腺腺樣囊性癌細胞的抑制作用[J].廣西醫(yī)科大學學報,2007,24(4):567-569.

[8]Lin S Y,Huang M C,Lee C Y,et al.Isolation of cardiotoxic and neurotoxic principles from the venom of Bungarus fasciatus[J].Taiwan Yi Xue Za Zhi.1972 Jun,71(6):350-357.

[9]Lu H S,Lo T B.Complete amino acid sequence of a new type of cardiotoxin of Bungarus fasciatus venom[J].Int J Pept Protein Res,1978 sep,12(3):181-183.

[10]Braganca B M,Patel N T,Badrinath P G,et al.Isolation and Properties of a cobra venom factor selectively cytotoxic to Yoshida sarcoma cells.Biochim Biaphys Acta[J].1967 Apr 25,136(3):508-520.

[11]Brisbois L,Rabinovitch-Mahler N,Gillo L,et al.Isolation from cobra venom of a factor inhibiting glycolysis in Ehrlich ascites carcinoma cells[J].Experientia,1968 Jul 15,24(7):673-674.

[12]Lin Shiau Y,Huang M C,Lee C Y,et al.A study of caidiotoxic principles from the venom of Bungarus fasciatus(Schneider)[J].Toxicon,1975 Jun,13(3):189-196.

[13]孔健強,吳秀榮.金環(huán)蛇蛇毒的分離及其毒性組分的藥理研究[J].藥學學報,1983,18(2):97-103.

[14]張耀時,吳興陸,陳遠聰,等.廣東金環(huán)蛇細胞毒素的化學組成和部分一級結構[J].動物學研究,1981,2(4):27-32.

[15]雷克健,劉兢,趙文.廣西產金環(huán)蛇(Bungarus fasciatus)蛇毒中類心臟毒素物理化學性質的研究[J].生物化學與生物物理學報,1982,14(3):279-285.

[16]Codrea E.Membrane-active Polypeptides from snake venom[J].Cardiotoxins and Haemocytotoxins Experientia,1974,30 (1) :121.

[17]雷丹青,劉綿林,藍利,等.廣西眼鏡蛇蛇毒細胞毒素的抗腫瘤作用[J].實用癌癥雜志,2004,19(2):127-129,138.

[18]程明榮,芮景.蛇毒抗腫瘤機制研究進展[J].皖南醫(yī)學院學報,2003,22(3):235-239.

[19]Chaim-Matyas A,Boorkow G,Ovadia M.Isolation and characterization of a cytotoxin P4 from the venom of Naja nigricollis nigricollis preferentially active on tumor cells[J].Bichem Int,1991,24 (3) :415-418.

[20]林振桃,趙路寧,植飛.眼鏡蛇毒組分C 對小鼠實驗性肝癌細胞生長影響的探討[J].蛇志,1997,9(1):3-6.

[21]楊冠群,李欽章.并用蛇毒膠囊治療惡性腫瘤的療效觀察[J].實用中西醫(yī)結合腫瘤雜志,1995,3(1):6-8.

[22]任先達,張海偉,葉春玲,等.眼鏡蛇毒灌胃后的兔血清對人鼻咽癌CNE-2細胞株的影響[J].暨南大學學報(自然科學與醫(yī)學版),2004,25(4):436-440.