DNA甲基化及檢測(cè)方法研究進(jìn)展

李媛媛，龔 曉，包云飛，洪亞輝

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

DNA甲基化是一種重要的遺傳修飾，是表觀遺傳學(xué)（epigenetics）研究的重要內(nèi)容[1]。其主要形式包括5-甲基胞嘧啶（5-mC）、N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）及7-甲基鳥嘌呤（7-mG）。在哺乳動(dòng)物中，DNA甲基化是必不可少的，它廣泛存在于轉(zhuǎn)座子元件、功能基因編碼群和重復(fù)的DNA中，且?guī)缀跛械募谆嬖谟贑pG二核苷酸對(duì)中。在植物中，5-甲基胞嘧啶主要出現(xiàn)在CpG二核苷酸對(duì)及CNG三核苷酸對(duì)中，大約有20%～30%的核基因組DNA胞嘧啶處于甲基化狀態(tài)。

1 DNA甲基化的機(jī)制及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶

DNA甲基化作用機(jī)制是在甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，MTase）的催化作用下從甲基供體S-腺苷酰甲硫氨酸（SAM）分子中的甲基化基團(tuán)添加到DNA分子中的堿基上，最常見的是加在胞嘧啶上，形成 5-甲基胞嘧啶（5-mC）[2]。

DNA甲基化狀態(tài)通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶來維持。細(xì)胞中存在幾種甲基化酶：一種是維持型甲基轉(zhuǎn)移酶，需以半甲基化的雙鏈DNA為模板，指導(dǎo)新合成的鏈甲基化；一種是全新甲基化酶，不依賴半甲基化DNA分子中的甲基化模板而從新開始合成5 mC[3]。在植物中，大部分非CG位點(diǎn)的甲基化由從頭合成甲基化酶催化。全新甲基化酶可以使以前沒有被修飾過的DNA產(chǎn)生甲基化，即重新甲基化，其作用位點(diǎn)為CG、CNG和CNN序列。植物細(xì)胞中存在染色質(zhì)甲基化酶，是植物所特有的一類甲基化酶，該酶催化位于異染色質(zhì)區(qū)和甲基化位點(diǎn)沉默區(qū)的CNG序列的甲基化[4]。

2 檢測(cè)甲基化的方法

目前，甲基化檢測(cè)的方法大致有以下幾類：（1）利用甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳（MSAP）進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)；（2）利用亞硫酸氫鹽修飾法；（3）芯片技術(shù)。

2.1 MSAP檢測(cè)方法

目前研究植物基因組甲基化多采用該種檢測(cè)方法，MSAP是在擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）基礎(chǔ)上，把該法中的內(nèi)切酶替換為對(duì)甲基化敏感程度不同的一對(duì)同裂酶HpaII和MspI。這對(duì)酶可識(shí)別CCGG位點(diǎn)，但對(duì)甲基化的敏感程度不同：前者對(duì)內(nèi)、外側(cè)胞嘧啶甲基化敏感，后者只對(duì)外側(cè)胞嘧啶甲基化敏感，而絕大多數(shù)基因組甲基化發(fā)生在胞嘧啶內(nèi)側(cè)，因此可以用MspI來識(shí)別CCGG，用HpaII來鑒別這些序列是否甲基化。這是一種簡(jiǎn)便的成本較低的檢測(cè)DNA甲基化的方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果位點(diǎn)明確且容易解釋，但也存在一定的缺點(diǎn)：由于甲基化位點(diǎn)不僅僅存在于CCGG，也可能存在于CG中，故CG中的甲基化會(huì)被忽略，造成結(jié)果的誤差。

2.2 亞硫酸氫鹽法

亞硫酸氫鹽可將未甲基化的胞嘧啶C轉(zhuǎn)化為尿嘧啶U，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，U將與A配對(duì)產(chǎn)生T，而甲基化的C則不會(huì)被亞硫酸鹽修飾，這樣DNA包含的甲基化信息就轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂胁町惖腄NA序列[5]。如今在Sodium bisuIfite法基礎(chǔ)上又產(chǎn)生了許多甲基化檢測(cè)的方法，包括如DNA甲基化熒光PCR檢測(cè)、結(jié)合亞硫酸氫鈉處理和酶解分析法、甲基化敏感性高分辨率熔解、甲基化敏感的單核苷酸的擴(kuò)增、酶的區(qū)域性甲基化特異性分析、芯片雜交技術(shù)等等。

2.2.1 甲基化特異性PCR法（MSP） 甲基化特異性PCR也是檢測(cè)基因甲基化的經(jīng)典方法。MSP法的原理是用亞硫酸氫鹽處理目的DNA，然后設(shè)計(jì)針對(duì)甲基化和非甲基化序列的引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后通過瓊脂糖凝膠電泳，確定與引物互補(bǔ)的DNA序列的甲基化狀態(tài)[6]。MSP法中引物設(shè)計(jì)的要求：（1）設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，其末端均設(shè)計(jì)至檢測(cè)位點(diǎn)結(jié)束；（2）兩對(duì)引物中一對(duì)結(jié)合處理后的甲基化DNA鏈，另一對(duì)結(jié)合處理后的非甲基化DNA鏈。檢測(cè)MSP擴(kuò)增產(chǎn)物，如果用針對(duì)處理后甲基化DNA鏈的引物能擴(kuò)增出片段，則說明該被檢測(cè)的位點(diǎn)存在甲基化；若用針對(duì)處理后的非甲基化DNA鏈的引物擴(kuò)增出片段，則說明被檢測(cè)的位點(diǎn)不存在甲基化。MSP法具有靈敏度較高、應(yīng)用范圍廣的優(yōu)點(diǎn)。

2.2.2 DNA甲基化熒光PCR檢測(cè) DNA甲基化熒光PCR檢測(cè)是利用重亞硫酸鹽處理目的DNA片段后，設(shè)計(jì)一個(gè)能與待測(cè)位點(diǎn)區(qū)互補(bǔ)的探針，在其5’末端標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)，3’末端標(biāo)記一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)，隨后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。如果探針能夠與DNA雜交，則在PCR引物延伸時(shí)，Taq酶發(fā)揮其5’至3’外切酶活性，將能與模板雜交的探針切碎，報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，熒光信號(hào)釋放，可被檢測(cè)，測(cè)定每個(gè)循環(huán)報(bào)告熒光的強(qiáng)度即可得到該位點(diǎn)的甲基化水平情況[7]。該方法具備靈敏度高、所需樣本量少、不需要電泳分離、可重復(fù)等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是費(fèi)用高，測(cè)定每個(gè)位點(diǎn)都要用兩端標(biāo)有熒光素的探針和一對(duì)引物，且受較多因素影響。

2.2.3 結(jié)合亞硫酸氫鈉處理和酶解分析法（COBRA） 亞硫酸氫鈉處理的DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后會(huì)產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)。目的片段擴(kuò)增后用識(shí)別序列需包含CG的內(nèi)切酶消化，如BstUI（識(shí)別CGCG）。若其識(shí)別序列中的C發(fā)生完全甲基化，則PCR擴(kuò)增后保留為CGCG，此時(shí)BstUI能夠識(shí)別并進(jìn)行切割；若待測(cè)序列中，C未發(fā)生甲基化，則PCR擴(kuò)增后轉(zhuǎn)變?yōu)門GTG，BstUI不可識(shí)別此位點(diǎn)，不能進(jìn)行切割[7]。這樣酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳分離、探針雜交、掃描定量后即可得出原樣本中甲基化的比例。該法的優(yōu)點(diǎn)是：方法相對(duì)簡(jiǎn)單，不需預(yù)先知道CpG位點(diǎn)及樣本序列；可進(jìn)行甲基化水平的定量研究；需要樣本量少。缺點(diǎn)是：只能獲得特殊酶切位點(diǎn)甲基化情況，因此檢測(cè)結(jié)果呈陰性也不能排除樣品DNA中甲基化存在的可能。

2.2.4 甲基化敏感的單核苷酸的擴(kuò)增（Ms—SnuPE） 甲基化特異的單核苷酸擴(kuò)增能對(duì)不同甲基化特異位點(diǎn)進(jìn)行快速定量，是一種快速估計(jì)特異性CpG位點(diǎn)甲基化情況的定量方法。其原理是先用重亞硫酸鹽處理基因組DNA后PCR，然后取等量擴(kuò)增產(chǎn)物置于兩管中，分別作為Ms—SnuPE單核苷酸引物延伸的模板。設(shè)計(jì)用于Ms—SnuPE延伸的引物，其3’末端緊靠待測(cè)目的堿基。同時(shí)在兩個(gè)反應(yīng)體系中加入等量的引物、同位素標(biāo)記的dCTP或dTTP、Taq酶等。如待測(cè)位點(diǎn)被甲基化，則被同位素標(biāo)記的dCTP會(huì)在延伸反應(yīng)中連至引物末端；如果未被甲基化，則標(biāo)記的dTTP可參與反應(yīng)。末端延伸產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離和放射活性測(cè)定后可得出C／T值，此值為甲基化與非甲基化的比值，由此分析得到目的片段中CpG位點(diǎn)的甲基化情況[8]。

2.2.5 甲基化敏感性高分辨率熔解（MS-HRM）高分辨率熔解是一種最新的遺傳學(xué)分析方法，是一種不需要PCR產(chǎn)物后續(xù)操作的簡(jiǎn)單且靈敏的檢測(cè)基因甲基化水平的方法。采用重亞硫酸鹽處理DNA模板后在PCR反應(yīng)前，在非CpG島位置設(shè)計(jì)一對(duì)針對(duì)經(jīng)亞硫酸氫鈉處理后DNA鏈的引物，這對(duì)引物中間包含有意義的甲基化CpG島，一旦這些CpG島發(fā)生甲基化，胞嘧啶不發(fā)生變化，而未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶，樣品中的GC含量發(fā)生了變化，最終被轉(zhuǎn)化成了熔解曲線Tm值之間的差異。CpG位點(diǎn)在小的擴(kuò)增片段內(nèi)的相對(duì)位置也會(huì)對(duì)熔解峰的形狀產(chǎn)生影響，因此，根據(jù)Tm值和熔解峰的形狀可以檢測(cè)出樣本的甲基化位點(diǎn)和甲基化程度[9]。

2.3 甲基化檢測(cè)芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)的出現(xiàn)為檢測(cè)DNA甲基化的高通量提供了技術(shù)平臺(tái)，然而檢測(cè)芯片的研究近幾年剛剛起步。目前國際上僅幾個(gè)研究小組在開展DNA甲基化芯片的研究工作。各種芯片技術(shù)以不同的DNA預(yù)處理方法為基礎(chǔ)，包括限制性內(nèi)切酶和免疫沉淀等。結(jié)合限制性酶的芯片方法具有較高的靈敏度，免疫沉淀方法則特異性高。

2.3.1 限制性酶結(jié)合芯片技術(shù)的方法 有以下三種限制性內(nèi)切酶可用于與芯片技術(shù)結(jié)合檢測(cè)DNA甲基化：第一種是甲基化依賴型限制性內(nèi)切酶；第二種是對(duì)甲基化敏感性不同的同裂酶；第三種是甲基化敏感性內(nèi)切酶[10]。

2.3.2 免疫沉淀與芯片方法的結(jié)合應(yīng)用 免疫沉淀與芯片方法的結(jié)合應(yīng)用包括以下幾種：第一種是依賴5-甲基胞嘧啶抗體免疫沉淀富集甲基化片段的方法；第二種是利用甲基化結(jié)合蛋白（MBD）免疫沉淀甲基化DNA片段的方法[11]。

3 展望

隨著對(duì)表觀遺傳學(xué)研究的深入，DNA甲基化檢測(cè)方法也得到了快速的發(fā)展。目前英國科學(xué)家提出，單分子納米孔測(cè)序儀能直接分辨出甲基化胞嘧啶和未修飾的胞嘧啶。當(dāng)核酸外切酶消化單鏈DNA后，單個(gè)堿基落入孔中，它們瞬間與環(huán)式糊精相互作用，并阻礙了穿過孔中的電流。每個(gè)堿基ATGC以及甲基胞嘧啶都有自己特有的電流振幅，因此很容易轉(zhuǎn)化成DNA序列。納米孔技術(shù)就能直接讀出這5-甲基胞嘧啶。

在表觀遺傳學(xué)的研究中，DNA的甲基化直接制約著基因的活化狀態(tài)，在生命過程中具有十分重要的功能。DNA的甲基化與高等生物的生長發(fā)育密切相關(guān)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展也有重要的關(guān)系，此外還與X染色體失活、基因印記[3]等有重要聯(lián)系。研究DNA甲基化具有重要的意義。在亞硫酸氫鹽法的基礎(chǔ)上，結(jié)合甲基化敏感性高分辨率熔解技術(shù)等新科技，以及可進(jìn)行高通量檢測(cè)的芯片技術(shù)的興起和發(fā)展，都為更好地檢測(cè)和研究甲基化提供了寬廣的平臺(tái)。

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