電化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞中的胸腺嘧啶和胞嘧啶

張樹萌， 李錦蓮， 郭曉玲， 孟令仁， 周 實(shí)

(佳木斯大學(xué) 藥學(xué)院， 黑龍江 佳木斯 154007)

胸腺嘧啶和胞嘧啶是兩種重要的嘧啶分子， 存在于脫氧核糖核酸(DNA)中并參與細(xì)胞嘧啶核苷酸的代謝， 可調(diào)控血流、 預(yù)防心律失常、 抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放并調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶活性[1-2]. 胸腺嘧啶和胞嘧啶的含量是診斷癌癥、 艾滋病、 心肌細(xì)胞能量狀態(tài)、 疾病治療進(jìn)展評(píng)價(jià)的重要參數(shù)[3-4]. 由于核苷酸、 核苷及其堿基的定量檢測(cè)在生物醫(yī)學(xué)、 生理學(xué)和臨床研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛， 因此測(cè)定胸腺嘧啶和胞嘧啶的含量或它們?cè)贒NA中的比例已引起人們廣泛關(guān)注[5]. 生物樣品中胸腺嘧啶和胞嘧啶定量分析的常用方法有高效液相色譜法(HPLC)[6]、 質(zhì)譜法(MS)[7]、 凝膠電泳法[8]等. 但在實(shí)際應(yīng)用中存在樣品前處理復(fù)雜、 儀器昂貴、 不便攜帶、 需要衍生或需結(jié)合其他檢測(cè)方法等問題. 電化學(xué)分析法[9-13]具有較高的靈敏度、 重現(xiàn)性、 簡(jiǎn)便性、 樣品前處理簡(jiǎn)單、 成本低、 可實(shí)時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn). 其中， 基于嘌呤核苷酸代謝的細(xì)胞電化學(xué)法已用于評(píng)價(jià)環(huán)境雌激素效應(yīng)、 檢測(cè)典型環(huán)境污染物(重金屬、 氯酚類)的細(xì)胞毒性等[14-15].

文獻(xiàn)[16]制備了氧化石墨烯量子點(diǎn)/多壁碳納米管修飾的絲網(wǎng)印刷電極(GOQDs/MWCNTs/SPCE*)， 構(gòu)建微型反應(yīng)裝置， 在較寬的電位窗下實(shí)現(xiàn)了尿酸與嘌呤的同時(shí)檢測(cè). 本文利用基于GOQDs/MWCNTs/SPCE*的電化學(xué)檢測(cè)方法對(duì)胸腺嘧啶和胞嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)， 考察最佳檢測(cè)條件， 研究電極對(duì)兩種嘧啶分子的選擇性和靈敏度， 實(shí)現(xiàn)電化學(xué)法同時(shí)測(cè)定小鼠胚胎成纖維(BALB/c 3T3)細(xì)胞中的胸腺嘧啶和胞嘧啶， 為嘧啶分子的靈敏快速檢測(cè)提供新技術(shù)方法.

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(BALB/c 3T3， 中科院上海細(xì)胞庫); DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified eagle medium， 美國Gibco公司); 氧化石墨烯量子點(diǎn)(GOQDs， 南京先豐納米材料科技有限公司); 高純多壁碳納米管(MWCNTs， 深圳納米港有限公司); 尿酸(UA)， 黃嘌呤(X)， 鳥嘌呤(G)， 腺嘌呤(A)， 次黃嘌呤(HX)， 胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)均購自美國Sigma公司; 其他試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?

恒電位儀(CHI 660型， 上海辰華儀器有限公司); 絲網(wǎng)印刷電極(SPCE， SE100型， 臺(tái)灣地區(qū)Zensor R&D公司); 高效液相色譜儀系統(tǒng)(G1311Agilent 1100型， 德國安捷倫科技有限公司); 二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(311型， 美國Thermo公司); 倒置熒光顯微鏡(CKX41型， 日本Olympus公司); 培養(yǎng)皿(D8054型， 美國Sigma公司); 培養(yǎng)板(3603型， 美國Corning公司); 超潔凈工作臺(tái)(VS-1300U型， 蘇州華宇凈化設(shè)備有限公司).

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與收集

細(xì)胞在含10%胎牛血清、 1% 100 μg/mL青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中于37 ℃、 φ(CO2)=5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng). 除去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基， 加入一定量的磷酸鹽緩沖液(PBS)于水浴鍋中, 50 ℃裂解后進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)[8].

1.3 電化學(xué)檢測(cè)方法

GOQDs/MWCNTs/SPCE*的制備過程參照文獻(xiàn)[16]， 在電化學(xué)分析儀上， 用微分脈沖伏安(DPV)法于25 ℃進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)， 三電極體系包括GOQDs/MWCNTs/SPCE*工作電極， Ag/AgCl/KClsat參比電極和鉑絲對(duì)電極.

1.4 高效液相色譜檢測(cè)

檢測(cè)條件： Ascenis RP-Amide型色譜柱(4.0 mm × 250 mm × 5.0 μm); 檢測(cè)波長： 254 nm; 柱溫： 25 ℃; 流動(dòng)相： 0.02 mmol/L pH=4.9的KH2PO4溶液; 流動(dòng)相流速： 1.0 mL/min; 進(jìn)樣量： 20 μL. 樣品用0.22 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)樣檢測(cè).

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

用Origin 2018軟件繪圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 胸腺嘧啶和胞嘧啶的電化學(xué)行為

用已構(gòu)建的電化學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)[16]對(duì)胸腺嘧啶(50 μmol/L)和胞嘧啶(100 μmol/L)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)， 兩種混合物在不同電極上的DPV曲線如圖1所示. 對(duì)比5個(gè)電極， GOQDs/MWCNTs/SPCE*電極在1.15，1.30 V處有2個(gè)明顯的電化學(xué)信號(hào)， 分別歸屬于胸腺嘧啶和胞嘧啶的氧化峰. 由圖1可見， GOQDs/MWCNTs/SPCE*電極對(duì)胸腺嘧啶和胞嘧啶的電化學(xué)響應(yīng)較強(qiáng).

2.2 富集電位對(duì)胸腺嘧啶和胞嘧啶電化學(xué)信號(hào)的影響

富集電位、 富集時(shí)間和pH值等因素均影響電極對(duì)樣品的檢測(cè)效率. 為研究富集電位對(duì)胸腺嘧啶和胞嘧啶在GOQDs/MWCNTs/SPCE*電極上電化學(xué)行為的影響， 在不同富集電位(-0.3，-0.2，0，0.2，0.3 V)下測(cè)定胸腺嘧啶和胞嘧啶標(biāo)準(zhǔn)樣品的電化學(xué)信號(hào)， 富集時(shí)間為360 s， 結(jié)果如圖2所示. 由圖2可見， 富集電位對(duì)胸腺嘧啶和胞嘧啶的氧化峰電流影響較小. 因此， 選取0為最佳富集電位.

圖1 胸腺嘧啶和胞嘧啶混合物在不同電極上的DPV曲線

圖2 富集電位對(duì)胸腺嘧啶和胞嘧啶氧化峰電流的影響

2.3 富集時(shí)間對(duì)胸腺嘧啶和胞嘧啶電化學(xué)信號(hào)的影響

圖3 富集時(shí)間對(duì)胸腺嘧啶和胞嘧啶氧化峰電流的影響

圖3為不同富集時(shí)間下胸腺嘧啶(150 μmol/L)和胞嘧啶(150 μmol/L)標(biāo)準(zhǔn)樣品的電化學(xué)曲線， 富集時(shí)間分別為0,90,150,240,300 s. 由圖3可見， 隨著富集時(shí)間的增加， 氧化峰電流小幅度增加， 150 s后峰電流隨富集時(shí)間的增加基本無變化. 這可能是富集150 s時(shí)， 樣品在電極表面上的吸附達(dá)到了飽和狀態(tài)， 因此選取150 s為最佳富集時(shí)間.

2.4 pH值對(duì)胸腺嘧啶和胞嘧啶電化學(xué)信號(hào)的影響

圖4為不同pH值(5.90，6.58，7.40，8.66，9.50，10.55)下胸腺嘧啶(150 μmol/L)和胞嘧啶(150 μmol/L)的氧化峰電位和氧化峰電流的變化. 由圖4(A)可見， 胸腺嘧啶和胞嘧啶的氧化峰電位隨pH值的增加而負(fù)移， 表明質(zhì)子參與了電化學(xué)反應(yīng)[14]. pH值與峰電位呈一定的線性關(guān)系， 線性方程分別為

ET= 1.509 9-0.049 0pH (R2= 0.990 8)，

EC= 1.534 7-0.034 6pH (R2=0.990 6).

兩個(gè)方程的斜率值分別為0.049 0，0.034 6， 與理論值0.059，0.029接近， 表明胸腺嘧啶和胞嘧啶在電極表面分別發(fā)生了兩電子和單電子的氧化反應(yīng)[15]. 由圖4(B)可見， 胸腺嘧啶和胞嘧啶的峰電流隨pH值的減小而增加， 當(dāng)pH=7.4時(shí)， 電極對(duì)胸腺嘧啶和胞嘧啶的電化學(xué)響應(yīng)較強(qiáng)， 且細(xì)胞的生理pH=7.4， 因此選取pH=7.4為檢測(cè)條件.

2.5 GOQDs/MWCNTs/SPCE*的選擇性和靈敏度

為考察基于GOQDs/MWCNTs/SPCE*的檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)胸腺嘧啶和胞嘧啶混合溶液的選擇性， 在最佳檢測(cè)條件下， 通過改變一種物質(zhì)濃度而另一種物質(zhì)濃度保持不變繪制電化學(xué)曲線， 結(jié)果如圖5所示. 由圖5可見， 隨著待測(cè)物質(zhì)濃度的增加， 其氧化峰電流增加， 而濃度保持不變的另一種物質(zhì)的電化學(xué)信號(hào)沒有變化. 基于GOQDs/MWCNTs/SPCE*的微檢測(cè)系統(tǒng)可靈敏檢測(cè)到胸腺嘧啶和胞嘧啶電化學(xué)信號(hào)的變化， 分別在5～340 μmol/L和5～430 μmol/L內(nèi)， 兩種物質(zhì)的濃度與氧化峰電流呈良好的線性關(guān)系. 對(duì)應(yīng)的線性方程分別為

IT=17.138 0+0.157 9c(R2=0.996 8)，

IC=34.749 2+0.135 18c(R2=0.998 6)，

且最低檢測(cè)限分別為0.69，0.95 μmol/L.

圖4 pH值對(duì)胸腺嘧啶和胞嘧啶氧化峰電位(A)及氧化峰電流(B)的影響

(A) a～l: c(T)=5,25,50,85,110,140,185,220,240,270,310,340 μmol/L; (C) a～m: c(C)=5，25，50，75，100，120，180，230，280，320，360，390，430 μmol/L.

2.6 細(xì)胞中胸腺嘧啶和胞嘧啶的檢測(cè)

高效液相色譜(HPLC)法常用于定量檢測(cè)生物小分子[7]. 將BALB/c 3T3細(xì)胞懸浮液及加入尿酸、 黃嘌呤、 鳥嘌呤、 腺嘌呤、 次黃嘌呤、 胸腺嘧啶和胞嘧啶的細(xì)胞懸浮液用HPLC法進(jìn)行對(duì)比， 結(jié)果如圖6所示， 其中測(cè)試細(xì)胞的濃度為每毫升106個(gè)細(xì)胞. 由圖6可見， 胞嘧啶和胸腺嘧啶的保留時(shí)間分別為4.20，13.32 min. 利用內(nèi)標(biāo)法檢測(cè)加入的7種標(biāo)準(zhǔn)品， 只有6個(gè)信號(hào)發(fā)生變化. 原因是細(xì)胞中還存在大量嘌呤， 胸腺嘧啶與黃嘌呤的出峰位置接近且無法分離(圖6(B))， 因此用HPLC法無法同時(shí)檢測(cè)到BALB/c 3T3細(xì)胞中胞嘧啶和胸腺嘧啶的出峰位置， 僅能檢測(cè)到胞嘧啶.

紅線： BALB/c 3T3細(xì)胞懸浮液; 黑線： 細(xì)胞懸浮液和尿酸、 黃嘌呤、 鳥嘌呤、 腺嘌呤、 次黃嘌呤、 胸腺嘧啶、 胞嘧啶混合物.

用基于GOQDs/MWCNTs/SPCE*的細(xì)胞電化學(xué)法對(duì)BALB/c 3T3細(xì)胞樣品進(jìn)行檢測(cè)， 結(jié)果如圖7所示. 由圖7可見， 在細(xì)胞裂解液中檢測(cè)到位于0.28，0.65，0.92，0.97 V處存在4個(gè)電化學(xué)信號(hào)[17-18]. 與尿酸和嘌呤標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)比， 4個(gè)電化學(xué)信號(hào)分別歸屬于細(xì)胞中尿酸、 黃嘌呤/鳥嘌呤、 腺嘌呤和次黃嘌呤的氧化. 細(xì)胞裂解液中檢測(cè)到位于1.15，1.30 V處的2個(gè)電化學(xué)信號(hào)歸屬于細(xì)胞中胸腺嘧啶和胞嘧啶的氧化. 可見， 基于GOQDs/MWCNTs/SPCE*的細(xì)胞電化學(xué)法可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞中胸腺嘧啶和胞嘧啶的同時(shí)檢測(cè).

紅線： BALB/c 3T3細(xì)胞； 黑線： 尿酸、 黃嘌呤/鳥嘌呤、 腺嘌呤、 次黃嘌呤、 胸腺嘧啶和胞嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品混合物.

綜上所述， 本文用基于GOQDs/MWCNTs/SPCE*的電化學(xué)檢測(cè)方法考察了富集電位、 富集時(shí)間、 pH值等因素對(duì)胸腺嘧啶和胞嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品電化學(xué)行為的影響， 獲得最佳檢測(cè)條件為富集電位0， 富集時(shí)間150 s， pH=7.4; 電極對(duì)胸腺嘧啶和胞嘧啶的最低檢測(cè)限分別為0.69，0.95 μmol/L. 該方法實(shí)現(xiàn)了BALB/c 3T3細(xì)胞中胸腺嘧啶和胞嘧啶的同時(shí)靈敏檢測(cè)， 為生物樣品中嘧啶分子的靈敏快速檢測(cè)提供了一種新技術(shù)方法.