郭應琳

（四川省西昌市畜牧局，四川 西昌 615000）

1 轉基因植物疫苗的作用機理

轉基因植物疫苗是指把植物基因工程技術與機體免疫機理相結合，生產出的能使機體獲得特異抗病能力的疫苗。由于口服疫苗到腸內黏膜誘導部位之前要經過胃內的不利環(huán)境，因此有效的口服疫苗經過這些不利環(huán)境時必須要受到保護，否則會失去免疫性。而植物細胞壁作為天然的生物膠囊，可使細胞內的疫苗抵抗消化道的酸性環(huán)境和各種酶類降解，使表達的疫苗在小腸內釋放，引起消化道的黏膜免疫反應，刺激黏膜下B、T淋巴細胞產生的抗菌素到消化道、血液、呼吸道中，發(fā)揮對機體的全面保護作用，疫苗通過胃進入與淋巴組織相關連的腸道，從而刺激免疫球蛋白A1的產生，以達到防治疾病的目的。動物實驗已經證實，轉基因植物表達的抗原蛋白經純化后仍保留了免疫學活性，注入動物體后能產生特異性抗體；用轉基因植物組織飼喂動物，轉基因植物表達的抗原呈遞到動物的腸道淋巴相關組織（GALT），被其表面特異受體特別是M細胞所識別，產生黏膜和體液免疫反應。

2 轉基因植物疫苗的生產方法

在目前的轉基因植物疫苗生產領域里，存在著兩種不同的疫苗表達系統(tǒng)。

2.1 穩(wěn)定整合的表達系統(tǒng) 這一方法是將抗原基因構建在植物表達載體上，利用膿桿菌或基因槍介導的方法，將抗原基因轉化到植物細胞中并與植物基因組整合，獲得穩(wěn)定表達的轉基因植株。本方法具有以下優(yōu)點：一是通過有性或無性繁殖的方法，可以很容易地獲得大量的轉基因植株；二是通過有性雜交的方法，可以獲得生產多價復合疫苗的轉基因植物；三是通過特異性表達啟動子使抗原基因在器官或組織中特異性表達。

2.2 瞬時表達系統(tǒng) 本方法是應用植物病毒作為載體，將目的基因插入病毒基因組中，然后將重組病毒接種到植物葉片上，任其蔓延，外源基因隨病毒的復制而高效表達。這一方法又分為兩種方式：一種是將抗原基因置于病毒基因組啟動子控制之下，另一種是將抗原基因與病毒外殼蛋白基因融合在一起。值得指出的是，抗原基因融合于病毒外殼蛋白的表達方式更具有免疫原性。目前用作載體的植物病毒主要是煙草花葉病毒（TMV）和豇豆花葉病毒（CMPV）。

本方法表達量高，而且一般認為植物病毒不會傳染動物，無交叉感染，但缺點是不能穩(wěn)定遺傳。此外，尚有幾個問題需要解決：一是抗原的純化；二是弱毒株系的選擇，即病毒對植物的浸染不會使植物生長異常，還要保證抗原基因的整合不會使病毒失去浸染和復制的能力；三是現有植物病毒載體浸染的植物宿主范圍有限。

2.3 生產轉基因植物疫苗的一般程序 （1）克隆特異中和抗原的編碼基因；（2）構建植物表達載體，把基因整合到植物表達載體上，或利用重組病毒作為載體；（3）利用各種轉基因方法將抗原基因轉入植物體，使植物帶有編碼抗原的基因；（4）進行愈傷組織的誘導和分化及轉基因植物的再生，使抗原蛋白基因在植物中表達；（5）進行表達水平的檢測和免疫原性的測定；（6）進行安全性評價、檢測。

3 轉基因植物疫苗的發(fā)展歷程

近年來的研究集中在轉基因植物疫苗在人類及動物中的應用。到目前為止，已報道的轉基因植物疫苗大致可分為4類：即細菌疫苗、病毒疫苗、寄生蟲疫苗及避孕疫苗。

3.1 細菌疫苗 用轉基因植物生產的細菌疫苗主要有大腸桿菌不耐熱毒素B亞單位疫苗（LT-B）和霍亂腸毒素B亞單位疫苗（CT-B）。

3.1.1 LT-B疫苗 Mason等把編碼LT-B的基因轉化到馬鈴薯中，使得LT-B在馬鈴薯的葉片和塊莖中得到表達。經分析表明，馬鈴薯來源的重組LT-B具有五聚體結構，能結合神經節(jié)苷脂。

動物實驗表明，轉基因馬鈴薯產生的LT-B能刺激小鼠產生體液和黏膜免疫反應，它誘導產生的抗體能中和LT的活性。之后，他們對此進行了深入研究，結果表明LT-B主要積累在葉片和塊莖中。用含有重組LT-B的馬鈴薯塊莖直接飼喂小鼠，每周1次，每次5g（約含 LT-B 20μg），共免疫 3次，免疫后的小鼠產生了黏膜和血清抗體；同時，用5μg細菌來源的重組LT-B來免疫小鼠（采用管飼法），在第3次免疫結束后隔一周采血檢測抗體水平，結果顯示用馬鈴薯來源的重組LT-B免疫小鼠所產生的抗LT-B血清抗體和黏膜抗體水平比用細菌來源的重組LT-B免疫小鼠所產生的抗體水平高；然后用25μg的LT喂小鼠進行攻擊感染，結果顯示用高劑量轉基因馬鈴薯LT-B疫苗比用源于細菌的重組LT-B疫苗更具保護作用。

3.1.2 CT-B疫苗 霍亂毒素B亞單位（CT-B）與腸道黏膜細胞表面的特異性神經節(jié)苷脂結合會引起腹瀉。Arakawa等將該基因導入馬鈴薯中，用其塊莖直接飼喂小鼠，而后在其血清和腸道內檢測到了特異性抗體，當黏膜抗體水平下降后，用其塊莖強化免疫，抗體水平又迅速提高。毒性中和實驗表明，馬鈴薯口服疫苗誘導小鼠產生的特異性抗體可以中和CT的毒性。用CT接種經轉基因馬鈴薯口服免疫后的小鼠，其腸道腹瀉分泌液量與對照組小鼠相比減少了60%。以上結果說明，口服轉基因植物疫苗有可能成為一種預防細菌內毒素疾病的有效手段。

3.2 病毒疫苗

3.2.1 乙型肝炎（HB）疫苗 Mason等首次報道了轉基因植物HB疫苗的研究結果。乙型肝炎表面抗原（HBsAg）可刺激機體產生針對HBV的保護性抗體，此抗體是現有商業(yè)疫苗的主要成分。他們將編碼HBsAg的結構基因導入煙草并獲得了表達，在葉片提取液中檢測到了HBsAg及其特異性mRNA，并在電鏡下觀察到重組HBsAg形成了直徑為22nm的球形顆粒，與其天然狀態(tài)相似。用相當于商用疫苗3%有效劑量的轉基因植物蛋白粗提液肌肉注射小鼠，發(fā)現能誘導較強抗體。來源于經植物疫苗免疫過的小鼠T細胞，在體外能被植物來源的重組HBsAg、酵母來源的HBsAg及合成的多肽激活，表明植物疫苗免疫的小鼠產生了T細胞免疫。這些結果說明，轉基因植物中表達的HBsAg具有正確的B細胞及T細胞識別表位。

劉玉樂等將人乙型肝炎病毒（adw亞型）表面抗原（HBsAg）基因插入植物雙元載體pROKⅡ-HBsAg的CaMV35S啟動子下游，構建重組質粒pROKⅡ-HBsAg，將此質粒導入膿桿菌LBA4404中，利用膿桿菌感染葉盤的方法轉化煙草，經酶聯(lián)免疫分析，發(fā)現轉化植株及其后代均能產生具有免疫活性的HBsAg；免疫吸附電鏡觀察表明，轉化植株產生的HBsAg呈典型的直徑為22nm的顆粒，顯示了用植物生產HBsAg的可行性。劉德虎等人利用所獲得的轉基因馬鈴薯飼喂小鼠后，在小鼠血液中檢測到了乙肝病毒保護性抗體，其抗體滴度足以對人產生保護力。

3.2.2 兔出血癥病毒（RHDV）疫苗 Vp60是RHDV的主要結構蛋白。Castanon等用編碼RHDV Vp60蛋白的基因轉化馬鈴薯，該轉基因馬鈴薯植株產生了特異的mRNA和正確的Vp60蛋白，用此植株的葉片提取物免疫兔子，在兔子體內產生了高滴度的抗Vp60特異性抗體。攻毒試驗表明，所免疫兔子完全避免了兔出血癥的發(fā)生。

3.2.3 口蹄疫病毒（FMDV）疫苗 Wigdorovitz等用轉基因苜蓿表達了FMDV結構蛋白vp1，用此轉基因苜蓿的新鮮葉片飼喂小鼠后，小鼠體內產生了特異性抗體。攻毒試驗表明，經免疫的小鼠能抵抗毒性FMDV的感染。

3.3 寄生蟲疫苗 瘧疾是世界性的嚴重寄生蟲病。Turpen等將編碼瘧原蟲抗原決定簇的基因片段插入到煙草花葉病毒（TMV）外殼蛋白的編碼區(qū)中，構建了植物病毒載體，然后用它感染煙草，所產生的高水平重組融合蛋白經試驗證明具有抗原活性。

3.4 避孕疫苗 哺乳動物受精過程中精卵細胞的結合具有種屬特異性，這種特異性的結合是由精子表面的特異性蛋白與卵細胞透明帶糖蛋白通過受體配體模式進行的，透明帶是卵細胞膜外的一層非細胞結構，是精子與卵細胞識別和結合的部位，透明帶具有多種糖蛋白，其中ZP3充當精子受體在受精過程中起著重要作用，而從避孕的角度來說它是免疫避孕的一個靶位。Fitchen等將小鼠ZP3蛋白的一個含有13個氨基酸殘基的抗原決定簇轉化到煙草花葉病毒的衣殼蛋白中，利用其作載體感染植物獲得了轉基因植物，用此轉基因植物免疫小鼠，其體內產生了抗ZP3的特異性血清，還發(fā)現透明帶聚集了抗ZP3抗體，證明利用轉基因植物生產避孕疫苗具有可行性。

4 轉基因植物疫苗的優(yōu)點

4.1 利于大規(guī)模工業(yè)化生產 利用哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的優(yōu)點是可與人的內環(huán)境進行相似的復制、翻譯、表達，但是哺乳動物細胞培養(yǎng)需要牛血清，成本花費大，而植物是能夠大規(guī)模也是最經濟的生產蛋白質的生產系統(tǒng)。在轉基因植物中，只要將外源基因成功轉入一個植株中，就可以通過種子遺傳給下一代，從而大面積種植，成本很低。其次，動物細胞培養(yǎng)不利于大型工業(yè)化生產，它受很多因素制約，如溫度、pH值、溶解氧濃度等，這些因素會影響細胞產出蛋白的量。當然，植物中蛋白質的密碼子和哺乳動物的仍有差別，但是和微生物相比，這種差異較小。

4.2 使用安全 對免疫接種動物來說，表達系統(tǒng)中的非目的成分對動物無害，不存在其他動物病原體污染的可能；免疫接種時，不需要注射器和針頭之類的設備，不存在通過注射接種而使動物感染病原微生物的可能，同時大大減少了免疫接種時動物的應激反應。關于轉基因食品安全性的爭論，美國食物安全和應用營養(yǎng)中心已經證明了卡那霉素抗性基因植物作為食物添加劑的安全性。對環(huán)境來說，轉基因植物疫苗也是綠色環(huán)保產品，無論其生產過程還是生產成品都不存在污染環(huán)境的問題。轉基因植物只表達亞單位疫苗，不含致病微生物或潛在的致病微生物，對人畜安全。

4.3 免疫效果好 植物細胞中的疫苗抗原通過胃內的酸性環(huán)境時可受到細胞壁的保護，直接到達腸內黏膜誘導部位，刺激黏膜和全身免疫反應。不僅如此，轉基因植物口服疫苗還可誘導消化道相關淋巴樣組織（GAL T）產生分泌性IgA（sIgA)，并在病原體和宿主之間相互作用的起始部位直接誘發(fā)免疫反應，從而大大提高其免疫有效性。

4.4 植物細胞具有全能性 能夠再生植株且易于成活，生長周期短，易于快速篩選出轉基因陽性植株。不僅比構建動物生物反應器節(jié)省時間，而且構建植物生物反應器的技術更成熟，成功率更高。

4.5 能進行有效的翻譯后加工 植物與動物一樣，屬真核生物，具有與之相似的翻譯后加工過程，適合于動物病毒抗原的表達，病毒產物具有與之相似的免疫原性。

5 展望

轉基因植物作為生物反應器生產轉基因植物疫苗或其他轉基因產品，為人和動物提供了一個最經濟有效的生產系統(tǒng)，具有許多潛在優(yōu)勢，但這只能算是起步階段，離實際應用還有很大一段距離，還面臨著許多未知的和有待解決的難題，仍需做進一步的效力試驗、穩(wěn)定性試驗以及免疫途徑、免疫劑量等多方面的研究，關鍵問題是提高抗原表達水平。隨著轉基因技術和相應檢測手段的逐步建立和優(yōu)化，轉基因植物疫苗在產業(yè)化生產中必將具有廣闊的應用前景。

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