王 政,李為民,周宏艷,郭虹鳳,孫文學(xué)

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,哈爾濱 150001)

RNA干擾(RNAi)是一種進(jìn)化上保守的抵御轉(zhuǎn)基因或外來(lái)病毒侵犯的防御機(jī)制,是指內(nèi)源性或外源性與靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 mRNA存在同源互補(bǔ)序列的雙鏈 RNA(dsRNA),在細(xì)胞內(nèi)特異地降解該mRNA,是一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)[1]。 RNAi具有快速、有效、容易操作和序列特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[2]。肺間質(zhì)纖維化是一種進(jìn)行性加重的彌漫性肺疾病,可造成肺結(jié)構(gòu)與功能不可逆損傷[3]。近年發(fā)現(xiàn),基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[4]。2009年 9～11月,我們?cè)O(shè)計(jì)了能轉(zhuǎn)錄小發(fā)卡結(jié)構(gòu) RNA(shRNA)的DNA序列,并與 psiSTRIKETM質(zhì)粒載體連接,構(gòu)建受控于人 RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子 U6的真核表達(dá)載體,以脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi),觀察該質(zhì)粒對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞 MMP-2表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 psiSTRIKETMU6載體,小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7,限制性內(nèi)切酶 Pst I,質(zhì)粒小量提取試劑盒,凝膠回收試劑盒,LipofectamneTM2000轉(zhuǎn)染試劑,總 RNA提取試劑盒,cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒,RPMI-1640培養(yǎng)基,山羊抗鼠 MMP-2抗體,FITC-兔抗山羊IgG。

1.2 方法

1.2.1 MMP-2特異性 siRNA的設(shè)計(jì) 從 GenBank中選取小鼠MMP-2基因序列,采用 siRNA Target Designer-Version 1.51設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì) 2對(duì) MMP-2基因發(fā)卡寡核苷酸,序列符合 siRNA表達(dá)載體 psiSTRIKETMU6的要求。DNA序列片斷由上海生工公司合成。

1.2.2 MMP-2 siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建 1μg/μl人工合成單鏈核苷酸在退火緩沖液中,90℃ 3 min后緩慢降到室溫。與 5μl快速連接緩沖液、1μl psiSTRIKETM載體(50 ng/μl)、2 μl Nuclease-Free水和 1μl T4 DNA連接酶(3 U/μl)配制成連接反應(yīng)液,室溫培養(yǎng) 1 h。加入 100μl E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞中,冰浴。加入 400μl室溫的 LB培養(yǎng)液,37℃振蕩培養(yǎng)(50 r/min)45 min。200μl轉(zhuǎn)化液涂在LB/氨芐西林平板上鋪板,37℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取菌落,小量提取質(zhì)粒,經(jīng) pst I酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為 psiSTRIKETM-MMP-2,-20℃保存。

1.2.3 psiSTRIKETM-MMP-2基因轉(zhuǎn)染 將RAW264.7細(xì)胞接種于 6孔板,置于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中,待細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá) 90%時(shí),采用 LipofectamneTM2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組每孔分別加入 4 μl脂質(zhì)體和 psiSTRIKETM/MMP-2重組質(zhì)粒 2μg,陰性對(duì)照組加 LipofectamneTM2000轉(zhuǎn)染試劑和 siSTRIKETMU6質(zhì)粒 2μg,空白對(duì)照組則不加任何干擾因素。分別于轉(zhuǎn)染前、轉(zhuǎn)染后 24、48、72 h收獲細(xì)胞檢測(cè) MMP-2的表達(dá)水平。

1.2.4 RAW264.7細(xì)胞 MMP-2 mRNA檢測(cè)方法采用 RT-PCR法。應(yīng)用 Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。以β-actin為內(nèi)對(duì)照,RT-PCR擴(kuò)增 MMP-2目的基因。產(chǎn)物經(jīng)含 0.5 mg/L溴化乙啶的 1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果,重復(fù) 3次。凝膠掃描系統(tǒng)分析處理,以 MMP-2 mRNA與 β-actin mRNA的灰度比值作為MMP-2 mRNA的表達(dá)量。

1.2.5 RAW264.7細(xì)胞 MMP-2蛋白檢測(cè)方法 采用 Western blot法,按試劑盒說(shuō)明書操作,重復(fù) 3次,以凝膠掃描系統(tǒng) Labworks軟件計(jì)算灰度值。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS13.0軟件分析。組內(nèi)比較和組間比較用方差分析及 t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 psiSTRIKETM-MMP-2重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果psiSTRIKETM載體包含一個(gè) PstⅠ位點(diǎn),重組質(zhì)粒將會(huì)形成第 2個(gè) PstⅠ位點(diǎn)。經(jīng)限制性 PstⅠ內(nèi)切酶消化后,成功的重組質(zhì)粒將產(chǎn)生 2個(gè) DNA片斷。重組質(zhì)粒 psiSTRIKETM-MMP-2用限制性 PstⅠ內(nèi)切酶酶切后,瓊脂糖凝膠電泳中可清楚地看到重組載體被切為 2個(gè)片斷,證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 各組細(xì)胞 MMP-2 mRNA表達(dá)比較 陰性對(duì)照組 MMP-2 mRNA表達(dá)量為 1.326±0.052,空白對(duì)照組為 1.257±0.067,實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染 24、48、72 h時(shí)分別為 0.713±0.075、0.334±0.059、0.192±0.041,與陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組比較,P均 ＜0.01。

2.3 各組細(xì)胞 MMP-2蛋白表達(dá)比較 陰性對(duì)照組MMP-2蛋白表達(dá)量為 185.90±22.72,空白對(duì)照組為 182.90±22.72,實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染 24、48、72 h時(shí)分別為 142.66±18.24、53.04±9.86、39.41±5.63,與陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組比較,P均 ＜0.01。

3 討論

肺纖維化是多種原因引起的以成纖維細(xì)胞增殖及大量細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)聚集為特征的疾病。其病理特點(diǎn)是長(zhǎng)期慢性肺部炎癥及肺泡持續(xù)性損傷,反復(fù)破壞、修復(fù)、重構(gòu)和膠原過(guò)度沉積,肺實(shí)質(zhì)廣泛重塑。肺纖維化的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,過(guò)去認(rèn)為肺纖維化都是肺部炎癥損傷的結(jié)局?，F(xiàn)研究發(fā)現(xiàn),其發(fā)病機(jī)制涉及多種生長(zhǎng)因子,包括 MMPs、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、胰島素樣生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、成纖維生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等。其中,MMPs尤其是 MMP-2起關(guān)鍵作用[5]。MMPs是一類對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)具有降解活性的蛋白酶超家族。其在中性 pH條件下,依賴 Ca2+和 Zn2+為輔助因子而激活,可以降解所有 ECM成分。近年發(fā)現(xiàn),肺泡上皮細(xì)胞破壞與基底膜損傷是肺間質(zhì)性纖維化病變?cè)缙诘奶攸c(diǎn)。MMPs與細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子之間以一個(gè)十分復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系,參與肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展。肺泡巨噬細(xì)胞分泌 MMPs,主要包括 MMP-2、MMP-9等。它們都以酶原的形式被分泌,通過(guò)一系列的酶切作用被激活,都可以降解Ⅳ型膠原。其中,MMP-2與細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子之間的相互激活,通過(guò)對(duì) ECM的降解,鏈接了炎癥細(xì)胞與肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞之間的信息交流,介導(dǎo)了肺泡炎癥與進(jìn)行性肺間質(zhì)纖維化的進(jìn)程[6,7]。RNAi是用由 dsRNA前體剪切產(chǎn)生的短的反義 RNA靶定對(duì)應(yīng)的 mRNA,然后進(jìn)行剪切,促使 mRNA降解。RNAi可以高效、特異的阻斷體內(nèi)特定基因的表達(dá),誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型,是基因沉默的理想工具,可直接抑制疾病相關(guān)基因,從而達(dá)到治療或預(yù)防疾病的目的[3,4]。

本研究成功克隆了靶向小鼠巨噬細(xì)胞 MMP-2的重組質(zhì)粒。體外實(shí)驗(yàn)表明,psiSTRIKETM-MMP-2重組質(zhì)粒能明顯下調(diào)小鼠巨噬細(xì)胞 MMP-2 mRNA和蛋白的表達(dá),且 MMP-2 mRNA和蛋白表達(dá)的抑制率相對(duì)一致,說(shuō)明 MMP-2表達(dá)的抑制位點(diǎn)在蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程之前,這也符合 RNAi轉(zhuǎn)錄后基因沉默的作用機(jī)制。本研究結(jié)果說(shuō)明,psiSTRIKETM-MMP-2 RNA干擾質(zhì)粒能夠特異、高效地抑制巨噬細(xì)胞 MMP-2的表達(dá),提示通過(guò) RNAi降低巨噬細(xì)胞中MMP-2表達(dá),可能減少肺臟細(xì)胞外基質(zhì)的降解,從而防止肺纖維化的進(jìn)展。但肺纖維化是一個(gè)長(zhǎng)期而又復(fù)雜的過(guò)程,其中有很多機(jī)制我們尚未完全了解,還需要進(jìn)一步研究。

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