王紀(jì)霞，王瑞華，王海波，孫明勝，楊國鋒，肖 賀，蔡克周，周存六*，陳從貴

(合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

血源性腌肉色素研究進(jìn)展

王紀(jì)霞，王瑞華，王海波，孫明勝，楊國鋒，肖 賀，蔡克周，周存六*，陳從貴

(合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009)

硝酸鹽、亞硝酸鹽替代物的研究一直是肉類加工行業(yè)亟待解決的技術(shù)問題。本文對(duì)血源性腌肉色素的制備原理和方法及其性質(zhì)和應(yīng)用等研究現(xiàn)狀進(jìn)行詳細(xì)綜述，指出目前腌肉色素研究存在的問題和今后努力的方向，為腌肉色素等相關(guān)研究提供借鑒。

配體；血紅蛋白；腌肉色素

Abstract：It has been an urgent issue to find an alternative to nitrate and nitrite in the field of meat industry. In this paper, the preparation principle and methods, properties and applications of cured cooked-meat pigments (CCMP) are reviewed. Meanwhile,the current problems as well as further research direction are also discussed. All of these investigations will be helpful fools for the further development of CCMP.

Key words：ligand；hemoglobin；cured cooked-meat pigments (CCMP)

色澤是腌制肉品的重要品質(zhì)特性，是影響消費(fèi)者作出購買決定的關(guān)鍵因素之一。硝酸鹽、亞硝酸鹽是傳統(tǒng)的腌制劑，具有呈色、呈味和抑制肉毒芽孢桿菌繁殖作用，也是目前最普遍使用的腌制劑之一。然而，亞硝酸離子能夠與氨基酸分解產(chǎn)物胺類化合物反應(yīng)形成致癌物質(zhì)，其安全性受到廣泛關(guān)注，硝酸鹽、亞硝酸鹽替代物的研究一直是肉類加工行業(yè)亟待解決的技術(shù)問題。

1 以血液為原料制備腌肉色素的理論依據(jù)

血紅蛋白由中心血紅素和外圍珠蛋白組成，血紅素由中心鐵離子和卟啉環(huán)組成。肌紅蛋白具有類似于血紅蛋白的結(jié)構(gòu)[1]。通常，鐵離子呈二價(jià)，含有d層空軌道，具有接受配體提供的孤電子對(duì)、形成配位化合物的能力[2-3]。根據(jù)晶體場(chǎng)理論，當(dāng)血紅蛋白、肌紅蛋白與配體配位，晶體場(chǎng)能降低、變得穩(wěn)定[4]。這是以血液為原料制備肉制品色素的理論依據(jù)。

2 腌肉色素制備

目前，亞硝基血紅蛋白(HbNO)是研究最為深入的血源性肉制品色素。Henry等[5]認(rèn)為不論鐵的狀態(tài)是二價(jià)還是三價(jià)，NO均能夠與血紅素蛋白質(zhì)螯合。20世紀(jì)70年代，前蘇聯(lián)莫斯科肉乳工藝學(xué)院的Pal'min等[6]最早提出使用腌肉色素概念，此時(shí)已有向裝有肌紅蛋白的試管內(nèi)通入一氧化氮、直接反應(yīng)制備亞硝基肌紅蛋白(MbNO)的實(shí)驗(yàn)報(bào)道。Rubin[7]比較詳細(xì)地研究了腌肉色素，他們采用牛血中的血紅素與NO或NaNO2合成亞硝基亞鐵血紅素。Pegg等[8]利用血紅素與NO合成了腌肉色素，將NO的飽和溶液逐滴加入到血紅素溶液中，測(cè)定吸光度的變化曲線得知血紅素與NO是1:1結(jié)合的。在我國，曹穩(wěn)根等[9]依次以氫氧化鈉溶液加入至血紅細(xì)胞中提取血紅素，向該溶液加亞硝酸鈉反應(yīng)、再加入胰蛋白酶分解，得到亞硝基血紅色素溶液?？妆ＨA等[10]利用豬血中的血紅素與一定量的亞硝酸鹽反應(yīng)，經(jīng)真空冷凍干燥合成制得腌肉色素。通過血紅素與N O或NaNO2制備的腌肉色素遇光、尤其遇空氣易褪色，在避光和無空氣的條件下，色素可保持30d左右，而暴露在空氣中僅能保持1d。很顯然，這樣的腌肉色素商業(yè)應(yīng)用價(jià)值很小。為提高其保存期，采用包埋措施處理。經(jīng)這種技術(shù)處理的腌肉色素，穩(wěn)定性有了一定提高，但仍未解決其穩(wěn)定性這一根本問題。

血紅蛋白具有血紅素結(jié)構(gòu)單元，具備與NO配體配位的條件；其外圍有珠蛋白，因此，血紅蛋白比血紅素更穩(wěn)定。據(jù)此，張坤生[11]提出直接利用血紅蛋白與NO反應(yīng)制備腌肉色素，其利用雞血制備血紅蛋白、再分別與NO或NaNO2制備腌肉色素。馬美湖等[12]利用NaNO2、異抗壞血鈉、尼克酰胺制備HbNO。與亞硝基血紅素相比，HbNO具有較高的穩(wěn)定性。但這種制備方法設(shè)備投入大、操作難、需要大量有機(jī)溶劑，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。NO屬小分子配體，能夠穿透血細(xì)胞膜。利用這個(gè)性質(zhì)，解萬翠等[13]以豬血細(xì)胞為原料，直接與亞硝酸鈉反應(yīng)制備腌肉色素。坂田亮一等[14]以商業(yè)血紅蛋白粉配成溶液和亞硝酸鈉、抗壞血酸鈉制備腌肉色素。嚴(yán)聃[15]對(duì)HbNO合成進(jìn)行改進(jìn)，在酶的催化下有控制地酶法水解、再亞硝基化。與用純血紅蛋白合成的腌肉色素相比，該方法將蛋白質(zhì)分子中的肽鍵有限水解切開，使血紅素暴露、NO更容易且牢固地結(jié)合其上生成亞硝基血紅素多肽。這種條件下的血紅素仍有較長(zhǎng)的多肽鏈保護(hù)，因而穩(wěn)定性有了很大提高。

與亞硝基血紅素相比，H bN O具有較高的穩(wěn)定性，但這種腌肉色素見光易分解，需要穩(wěn)定化處理。O’Boyle等[16]對(duì)HbNO微膠囊化干燥工藝進(jìn)行了研究，結(jié)果表明最適的微膠囊壁材是β-環(huán)糊精、變性淀粉和麥芽糊精，其中β-環(huán)糊精是必不可少的，經(jīng)微膠囊化噴霧干燥的HbNO著色劑化學(xué)性質(zhì)并沒有改變。邢紹平等[17]用蔗糖對(duì)HbNO進(jìn)行糖基化處理、提高HbNO的穩(wěn)定性。經(jīng)過微膠囊化或糖基化處理的HbNO穩(wěn)定性有一定程度的提高，但其穩(wěn)定性仍需進(jìn)一步提高。

配體與血紅蛋白配位、導(dǎo)致晶體場(chǎng)能量降低，是血紅蛋白穩(wěn)定性提高的根本原因[4]。含有N、O、S等元素的分子具有提供孤對(duì)電子和與血紅蛋白中心鐵絡(luò)合的能力[3]。只要這些分子穿越其外圍珠蛋白并與血紅蛋白接觸，就有與血紅蛋白絡(luò)合的能力。近年來，利用其他配體與血紅蛋白絡(luò)合、制備腌肉色素的研究相繼展開?？娫狼俚萚18]以半胱氨酸為配體、與血紅蛋白絡(luò)合制備腌肉色素；王遠(yuǎn)明[19]選用了煙酸、煙酰胺和TEA為配體、與血紅蛋白絡(luò)合制備腌肉色素；楊錫洪等[20-21]利用組氨酸為配體 與血紅蛋白絡(luò)合、再進(jìn)行糖基化處理制備新型無硝腌肉色素。錢瑞生等[22]通過CO與血紅蛋白絡(luò)合、制備新型腌肉色素碳氧血紅蛋白。Silkstone等[23]描述了CO與肌紅蛋白結(jié)合過程中的動(dòng)力學(xué)和光學(xué)轉(zhuǎn)化，認(rèn)為血紅素中鐵離子結(jié)合的CO容易光解失去。Mark等[24]研究了低溫下CO和O2分別與肌紅蛋白和血紅蛋白結(jié)合的本質(zhì)。在－265℃下，光化產(chǎn)物形成需要4×10-11s，光催化分解要用幾分鐘；O2的光化產(chǎn)物產(chǎn)率是0.4±0.1，而CO與肌紅蛋白和血紅蛋白的光化結(jié)合產(chǎn)率均為1.0±0.1。

3 腌肉色素性質(zhì)

3.1 腌肉色素穩(wěn)定性

Shahidi[25]實(shí)驗(yàn)表明pH值為5.5～5.7時(shí)，HbNO在充一氧化氮?dú)怏w的密封試管中能貯存幾個(gè)月。陶菲[26]研究不同條件下HbNO色素的穩(wěn)定性，結(jié)果表明：光照、氧化劑對(duì)腌肉色素有不良的影響，腌肉色素應(yīng)盡量避光、真空保藏；Fe3+和Ca2+對(duì)色素的穩(wěn)定性影響較大，其他離子的影響較小；溫度、pH值對(duì)腌肉色素的影響不大。鄭立紅等[27]研究了光照、不同pH值、金屬離子、氧化劑H2O2、還原劑L-抗壞血酸和蔗糖對(duì)HbNO的影響。在紫外光、日光燈和陽光照射下，HbNO溶液的吸光度都沒有顯著的變化；感官評(píng)價(jià)表明色素的顏色沒有明顯變化；HbNO在pH值4～8的范圍內(nèi)很穩(wěn)定，在pH值低于4或高于8的條件下不穩(wěn)定；在低濃度Na+、Mg2+、Ca2+、Al3+、Fe3+、Sn2+等金屬離子存在時(shí)，HbNO在41h內(nèi)無明顯變化，到113h時(shí)吸光度增加，并產(chǎn)生微渾濁的現(xiàn)象；在H2O2存在下，HbNO溶液的顏色由紅色變成黃色，說明HbNO已經(jīng)變性；在有還原劑L-抗壞血酸存在時(shí)，HbNO比較穩(wěn)定；蔗糖不會(huì)影響HbNO的色調(diào)和色度。上述研究是通過測(cè)定色素在80%丙酮溶液中的吸光度的變化實(shí)現(xiàn)的，但也可以根據(jù)Gamasa等[28]利用多譜線成像測(cè)定肉中色素濃度的方法，測(cè)定色素中不同形態(tài)的含量，說明色素的穩(wěn)定性。肉中色素主要含有還原性肌紅蛋白、氧合肌紅蛋白、氧化高鐵肌紅蛋白3種形態(tài)，可以使用3種肌紅蛋白形態(tài)色素的等吸收點(diǎn)(474、525、572、610nm)的比例來計(jì)算每種形態(tài)色素的濃度。與肌紅蛋白的存在形式類似，血紅蛋白也存在還原性血紅蛋白、氧合血紅蛋白和高鐵血紅蛋白3種形態(tài)，因此采用這種方法計(jì)算是可行的。Osawa[29]發(fā)現(xiàn)了一種便捷快速自動(dòng)測(cè)定肉中色素的方法，該法為散射分光光度法，可以用該方法測(cè)定還原性肌紅蛋白含量來評(píng)價(jià)肉的新鮮度，也可以測(cè)定肌紅蛋白、血紅蛋白的濃度反映色素的穩(wěn)定性。王遠(yuǎn)明[19]研究了豬血與煙酸、煙酰胺和TEA為配體制備著色劑的穩(wěn)定性，質(zhì)量分?jǐn)?shù)l%的該色素溶液置于陽光下照射3d(6月份的晴天)，著色劑含量下降了12.4%。楊錫洪等[30]利用組氨酸與血紅蛋白制備無硝色素(NHP)，將它與腌肉色素(CCMP)比較，發(fā)現(xiàn)5d日光照射后NHP的特異性吸收峰降低了41.9%，NHP渾濁，顏色最終為淺紅色；而CCMP很快變性、沉淀，說明N HP的光照穩(wěn)定性明顯優(yōu)于CCMP。兩種色素常溫下避光保存，CCMP保藏12個(gè)月時(shí)，吸光度降低了22%；而通過糖基化作用的NHP，穩(wěn)定性有所提高，吸光度僅降低了6%。Gomide等[31]測(cè)定了用CO處理過的豬血的顏色穩(wěn)定性。研究考察了不同pH值對(duì)豬血和CO處理過的豬血顏色的影響，以豬血的色度值L*(亮度)、a*(紅度)、b*(黃度)為指標(biāo)評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)的每個(gè)pH值(7.40、 6.70、6.00)條件下，用CO處理過的豬血穩(wěn)定性更高，顏色也會(huì)變成有吸引力的紅色；a*值和b*值增加，L*沒有顯著變化。

3.2 腌肉色素的毒性

Stevanovic等[32]研究了牛血紅細(xì)胞或氯化血紅素中間體制備的腌肉色素(CCMP)、以及按照SOS/um實(shí)驗(yàn)(即環(huán)境誘變物的短期篩選實(shí)驗(yàn))和Ames測(cè)試法(污染物致突變性實(shí)驗(yàn))測(cè)定分別由CCMP和亞硝酸鹽著色的火腿的毒性。結(jié)果表明，SOS/umu法檢測(cè)中，CCMP、使用CCMP或亞硝酸鹽分別著色的火腿均沒有毒性。在Ames檢測(cè)中，使用鼠傷寒沙門氏菌菌株TA98和TA100分別檢測(cè)CCMP和亞硝酸鹽著色的火腿。在亞硝酸鹽著色的火腿中，只有當(dāng)菌株沒有新陳代謝的時(shí)候TA100菌株會(huì)顯示出微弱的突變，而CCMP著色的火腿中的菌株沒有突變。與亞硝酸鹽著色的火腿相比，使用CCMP著色的火腿、殘余量顯著降低，因而安全性提高了。

3.3 腌肉色素的其他性質(zhì)

張坤生等[33]用0.04mol/L的碳酸鈉溶液和純蒸餾水作溶劑，選擇超聲波、均質(zhì)、磁力攪拌等方式，通過測(cè)定重力沉降后殘?jiān)稍锖蟮馁|(zhì)量比較色素的溶解性，結(jié)果表明：0.04mol/L的碳酸鈉溶液中用磁力攪拌色素的溶解性最好，溶解度達(dá)96.6%。施春權(quán)等[34]研究了pH值、NaCl濃度以及溫度對(duì)HbNO起泡性和持水性的影響，結(jié)果表明，HbNO溶液的起泡性與其溶解度有關(guān)。在pH5時(shí)，即HbNO的等電點(diǎn)處，HbNO溶液具有最低的起泡性；偏離等電點(diǎn)時(shí)，起泡性由于溶解度的增加而增大，泡沫穩(wěn)定性也相應(yīng)提高。由于有鹽溶作用，低濃度的NaCl溶液使HbNO的起泡性增大，高濃度的NaCl溶液會(huì)使HbNO鹽析出來而造成其溶解度下降，起泡性降低；溫度對(duì)起泡性也有促進(jìn)作用，但隨著溫度的升高，泡沫穩(wěn)定性降低；pH值、NaCl濃度以及溫度對(duì)HbNO持水性的影響與起泡性一致。施春權(quán)等[35]研究了pH值、NaCl濃度以及溫度對(duì)溶解性和乳化性的影響。結(jié)果表明，HbNO溶液在pH5處具有最低的溶解性，pH值越大溶解性越強(qiáng)；當(dāng)溫度低于60℃時(shí)，溶解度隨溫度的升高而增大，當(dāng)溫度高于60℃低于80℃時(shí)，溶解度輕微下降但不顯著。當(dāng)NaCl濃度低于0.4mol/L時(shí)，即離子強(qiáng)度低于1.0時(shí)，溶解度隨NaCl濃度的升高而增大。當(dāng)NaCl濃度高于0.4mol/L時(shí)，溶解度隨NaCl濃度的升高而降低。當(dāng)溫度與濃度分別為60℃、0.4mol/L時(shí)蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性最高，溫度和NaCl濃度的升高和降低都可以降低HbNO的乳化性與乳化穩(wěn)定性。

4 腌肉色素應(yīng)用

Oliver等[36]將豬血血紅素加入到PSE(蒼白、柔軟、多汁)的肉中、再制成火腿，研究了色素對(duì)火腿顏色、顏色穩(wěn)定性和質(zhì)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，色素使火腿的L*值降低，a*值增加，從視覺上發(fā)現(xiàn)火腿變紅了，色素對(duì)顏色穩(wěn)定性和火腿質(zhì)構(gòu)沒有影響。

Sheridan等[37]采用兩種方法測(cè)定了火腿切塊后的顏色變化，一種是CIE法，用L*、a*、b*等參數(shù)表達(dá)肉的色澤，其重現(xiàn)性較差；另一種是分析變化中肉的顏色的反射光譜，能夠清楚的表明火腿褪色的不同階段。由血液制備的色素本身顏色比較深，加入到火腿中顏色變化程度不容易區(qū)分，適合使用反射光譜方法來測(cè)定。

Hornsey等[38]將制備的亞硝基血紅素色素加入到火腿中著色，然后用80%的丙酮溶液將火腿中的色素提取出來，測(cè)定紫外吸收光譜。將火腿光照24h后，再用相同的方法提取色素、并測(cè)定紫外吸收光譜。比較兩次提取色素的紫外光譜的變化，說明亞硝基血紅素色素改變并穩(wěn)定火腿中的色素成分，從而達(dá)到火腿的著色和色澤穩(wěn)定的效果。

馬美湖等[39]將HbNO作為發(fā)色劑加入到火腿中，其顏色為玫瑰紅色。HbNO色素中的殘留量低至7.05mg/kg。文中提到在加工火腿過程中，必須注意HbNO粉的添加程序，否則會(huì)影響HbNO在產(chǎn)品中的溶解性，使產(chǎn)品表面出現(xiàn)不溶性的黑色粒狀斑點(diǎn)。鄭立紅等[40]將HbNO分別應(yīng)用于豬肉灌腸和雞肉灌腸中，以色度值和感官評(píng)價(jià)作為應(yīng)用效果的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明，以HbNO作為著色劑制成的火腿腸，感官狀態(tài)接近于亞硝酸鈉的發(fā)色效果，并且比紅曲色素的著色效果要好。HbNO有很強(qiáng)的耐熱性，可以使用到高溫香腸中。HbNO在豬肉腸和雞肉腸中的著色效果均良好。黃群等[41]將HbNO加入灌腸中著色，以發(fā)色率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得出了HbNO、抗壞血酸、煙酰胺用量的較佳組合。結(jié)果表明，加HbNO著色的產(chǎn)品與亞硝酸鈉發(fā)色的產(chǎn)品感官上無明顯差別。蔣云升等[42]將豬血制備的HbNO加入到香腸中，同時(shí)添加了產(chǎn)香發(fā)酵菌和天然抗氧化劑。結(jié)果表明，發(fā)酵菌能降解，從而降低的殘留量。但是這并不能說明肉毒梭狀桿菌也受到抑制而減少肉毒毒素的產(chǎn)生，不能消除肉毒毒素中毒隱患。施春權(quán)等[43]將豬血制備的HbNO與防腐劑復(fù)合加入到哈爾濱紅腸中，研究了HbNO對(duì)產(chǎn)品顏色、pH值、硫代巴比妥酸反應(yīng)物值(TBARS)、菌落總數(shù)等方面的影響。結(jié)果表明：HbNO能夠增加紅腸的紅度值a*，降低TBARS值和菌落總數(shù)。未加防腐劑，只加HbNO的紅腸的菌落總數(shù)也有所降低，說明HbNO除了著色功能外也有抑菌作用。邢紹平等[17]研究了食鹽、葡萄糖和蔗糖等加工灌腸時(shí)常用輔料對(duì)HbNO穩(wěn)定性的影響，結(jié)果表明食鹽和蔗糖對(duì)HbNO的穩(wěn)定性沒有不良影響，葡萄糖對(duì)其穩(wěn)定性有增強(qiáng)的作用。這可能是由于葡萄糖有較強(qiáng)的還原性，對(duì)HbNO有保護(hù)作用。另外，L-抗壞血酸和L-抗壞血酸鈉具有很強(qiáng)的還原性，是肉制品中常用的發(fā)色劑及發(fā)色助劑。尼克酰胺(又稱煙酰胺)可以與肌紅蛋白結(jié)合形成穩(wěn)定的煙酰胺肌紅蛋白，難于被氧化，可防止肌紅蛋白在與HbNO接觸過程中被氧化變色，有利于增強(qiáng)HbNO的發(fā)色效果。因此建議在HbNO發(fā)色的同時(shí)加入L-抗壞血酸或L-抗壞血酸鈉與尼克酰胺的復(fù)合物以增強(qiáng)發(fā)色效果。

5 結(jié) 論

HbNO作為著色劑可使肉制品呈現(xiàn)良好色澤，與添加亞硝酸鈉的香腸相比、其他感官品質(zhì)無明顯差別；但是，至今為止，沒有明顯研究證據(jù)表明HbNO能夠顯著抑制肉毒梭狀桿菌的繁殖，HbNO對(duì)光敏感、不夠穩(wěn)定。因此，以HbNO為色素添加到香腸中發(fā)色是可行的，色素的穩(wěn)定、及其如何抑制肉毒芽孢桿菌等問題仍然需要進(jìn)一步解決。另外，利用其他小分子配體與血紅蛋白絡(luò)合制備肉制品色素，提高色素本身穩(wěn)定性、安全性也將是今后肉制品色素的一個(gè)研究方向。

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Research Progress in Cured Cooked-meat Pigments Derived from Blood

WANG Ji-xia，WANG Rui-hua，WANG Hai-bo，SUN Ming-sheng，YANG Guo-feng，XIAO He，CAI Ke-zhou，ZHOU Cun-liu*，CHEN Cong-gui
(School of Biology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

TS251.5

A

1002-6630(2010)19-0449-04

2010-06-24

國家大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(091035951)；合肥工業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(2009cxsy207)；科技部科技人員服務(wù)企業(yè)行動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目(2009GJC30045)；安徽省科技攻關(guān)項(xiàng)目(08010301080)

王紀(jì)霞(1984—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿庵破芳庸づc品質(zhì)控制。E-mail：chunfengfeiyang22@163.com*通信作者：周存六(1970—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。E-mail：zhouc14@hfut.edu.cn