黃金昌 郭榮富

（云南農(nóng)業(yè)大學云南省動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室,昆明 650201）

氧化應激使動物體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡,其實質(zhì)是自由基在機體內(nèi)產(chǎn)生的一種負面作用[1]。目前,在研究抗氧化酶的過程中,許多學者已逐漸認識到非酶系統(tǒng)在抗氧化反應中的重要作用[2]。谷氧還蛋白（glutaredoxin,Grx）和硫氧還蛋白（thioredoxin,Trx）分別是抗氧化酶系統(tǒng)和抗氧化非酶系統(tǒng)的重要成員[3],具有強大的抗氧化作用,發(fā)揮著維持細胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)、抗衰老以及腸道保護生物學效應等作用。在此基礎上,若對抗氧化酶系統(tǒng)和抗氧化非酶系統(tǒng)同時進行研究,則有可能為動物抗氧化應激和腸道保護生物學效應提供新的研究途徑和技術支撐。本文就Grx和Trx的結構和功能以及對動物的抗氧化機制方面的研究進行綜述,旨在為動物抗氧化應激和腸道保護的研究與技術應用提供重要參考。

1 Grx和Trx的結構與功能

1.1 Grx的結構與功能

Grx,又稱巰基轉(zhuǎn)移酶,普遍存在于細菌、病毒和哺乳動物體內(nèi),分子量約為12 ku,由106或107個氨基酸組成,是巰基-二硫鍵氧化還原酶家族的重要組分,通過催化谷胱甘肽（GSH）,與蛋白質(zhì)二硫鍵之間進行氧化還原反應,修復蛋白質(zhì)活性[4]。Grx是一種多效性細胞因子,具有多種生物學功能,參與氧化應激和抗細胞凋亡等[5]。在細胞質(zhì)正常的生理狀態(tài)下,Grx、GSH、谷胱甘肽還原酶（GR）和還原型煙酰腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）構成一套Grx酶體系,用于催化二硫鍵與巰基之間的氧化還原反應[6]。Grx活性中心的氨基酸序列為-Cys-Pro-Ty r-Cys-,其中半胱氨酸（Cys）為催化基團。在空間結構上,Grx有3個活性區(qū)域（圖1）,即巰基-二硫鍵活性中心、GSH結合位點和疏水性表面區(qū)域[7]。Lundberg等[8]報道,Grx家族（Grxs）逐漸擴大,新的Grxs成員不斷被發(fā)現(xiàn),諸如:谷氧還蛋白1 （G rx1）存在于細胞液中,分子量為12 ku,由106或107個氨基酸殘基組成;谷氧還蛋白2（Grx2）分布在線粒體和核膜上,分子量為18 ku,結構上與谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）超家族蛋白質(zhì)相似,但是卻顯示典型的Grx活力,Grx1的抗氧化作用明顯強于Grx2,但其具體生理作用目前尚不明確。

圖1 人谷氧還蛋白的結構Fig.1 Struc ture of hum an glutaredoxin

1.2 Trx的結構與功能

Trx最初是在植物葉綠體中發(fā)現(xiàn)的,廣泛存在于原核和真核生物中,是一種由104個氨基酸組成的低分子量（12 ku）和熱穩(wěn)定的酸性蛋白質(zhì)[9]。其三維結構是一個緊密的球狀蛋白質(zhì),含有5個β-折疊和4個α-螺旋,β-折疊被α-螺旋包圍形成一個緊密的球狀結構的蛋白質(zhì)（圖2）,含有高度保守的-Cys-Gly-Pro-Cys-氧化還原調(diào)節(jié)活性位點序列,具有抗氧化、促進細胞生長、調(diào)節(jié)細胞凋亡和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)以及趨化等作用。氧化型的Trx含有二硫鍵,還原型的Trx含有巰基（圖3）,Trx的氧化反應過程是通過可逆的二硫鍵和二巰基可逆轉(zhuǎn)換完成酶活力調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的作用[10]。目前在硫氧還蛋白家族（Trxs）中,主要有硫氧還蛋白1（Trx1）和硫氧還蛋白2（Trx2）2個類型,它們在細胞抗氧化方面發(fā)揮著重要作用[11]。Trx1是一個氧化還原蛋白,其作用是調(diào)節(jié)細胞的氧化還原。除了催化位點上的2個Cys殘基,還有另外3個Cys殘基（Cys-62、Cys-69和Cys-73）。這些結構性殘基不屬于活性位點,但是與主要的蛋白質(zhì)構型有關,它們的氧化會導致酶活性的喪失[12]。Trx2僅位于線粒體中,有1個保守的Trx催化位點和由60個氨基酸組成的N-末端延伸,其可能是線粒體引導序列,應用Western Blotting技術已證實了Trx2的線粒體定位[13]。

圖2 人硫氧還蛋白結構Fig.2 Structure of human thioredoxin

圖3 人硫氧還蛋白立體結構模擬圖Fig.3 Simulation figure o f stereoscopic struc ture of hum an thioredoxin

1.3 Grx與Trx之間的聯(lián)系

Grx和Trx是機體內(nèi)2個重要的抗氧化蛋白,它們有著許多相似之處:1）都是小分子蛋白質(zhì);2）都擁有-Cys-X 1-X 2-Cys-活性中心（X 1、X 2可以是除Cys外的任何一種氨基酸）;3）都存在于細胞中氧化還原反應密集的部位且都有緩解細胞氧化脅迫的能力;4）在脫氧核糖核苷酸的合成中,均為氫攜帶蛋白,通過傳遞氫共同參與脫氧核糖核苷酸的合成[3]; 5）NADPH/Grx/Trx氧化還原調(diào)節(jié)介導了一條由營養(yǎng)誘導胰島素分泌的新的信號通路[14]。另外, Grx和Trx系統(tǒng)被視為并行的氧化還原系統(tǒng),可以獨立運行,但G rx能夠還原蛋白質(zhì)二硫化物和蛋白質(zhì)谷胱甘肽二硫化物,能夠補償Trx系統(tǒng)并拓寬了功能范圍,同時還具有其獨特的功能。

2 Grx和Trx對動物抗氧化應激的生物學效應

2.1 Grx和Trx的抗氧化機制

Grx的抗氧化機制主要依賴于GSH的巰基-二硫化物轉(zhuǎn)換的反應,對與GSH相連的二硫化物具有高度特異性,維持細胞內(nèi)蛋白質(zhì)巰基的穩(wěn)態(tài),保持細胞內(nèi)酶或蛋白質(zhì)的生物學活性,以修復蛋白質(zhì)活性。Grx在氧化過程中,其活性部位的氨基酸序列是-Cys-Pro-Tyr-Cys-,催化基團為其中的1或2個Cys,因此Grx的抗氧化作用可分為單巰基和雙巰基的反應機制（圖4）。單巰基機制中,Grx特異性的催化還原與GSH相連的二硫鍵,反應只需要活性部位N端的巰基。這個反應首先是活性部位N端的巰基親核進攻GSH上的二硫鍵,并釋放出被還原的去GSH化的分子。反應過程中形成了Grx-GSH反應中間體,接下來被第2個分子的GSH還原,產(chǎn)生氧化型谷胱甘肽（GSSG）[11]。雙巰基機制中,G rx催化還原蛋白質(zhì)中的二硫鍵。首先, Grx活性部位N端的巰基親核攻擊底物蛋白質(zhì)的二硫鍵,形成了Grx與底物蛋白質(zhì)以二硫鍵連接的反應中間體,接下來Grx中活性部位C端的巰基攻擊中間體的二硫鍵,反應釋放出了被還原的底物。Fernandes等[15]研究發(fā)現(xiàn),在各種氧化應激損傷過程中,谷胱甘肽化蛋白質(zhì)（Pr-S-S-G）結構最先形成,而Grx的作用主要是對巰基-蛋白質(zhì)（SH-protein）早期氧化損傷形成的Pr-S-S-G進行修復。因此,在體內(nèi)的抗氧化防御體系中,Grx發(fā)揮著關鍵作用。

圖4 谷氧還蛋白的2種催化反應機制Fig.4 Tw o catalytic mechanisms o f g lutaredoxin

在各種氧化還原環(huán)境中,Trx具有多種功能,包括:對核糖核苷酸還原酶和3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸（PAPS）-還原酶的還原;對哺乳動物轉(zhuǎn)錄因子和激素調(diào)控的調(diào)節(jié);對生長因子自分泌的調(diào)節(jié)等。目前普遍認為,Trx的抗氧化效應主要表現(xiàn)在2個方面:第一,Trx能直接作為某些過氧化物酶的電子供體清除活性氧,從而降低脂質(zhì)過氧化、DNA損傷以及蛋白質(zhì)的失活[16];第二,作為細胞內(nèi)蛋白質(zhì)二硫鍵還原酶,Trx能還原多種蛋白質(zhì)（如激酶、磷酸酶和轉(zhuǎn)錄因子）的二硫鍵,從而使其恢復生理功能。Trx與硫氧還蛋白還原酶（thioredoxin reductase, TrxR）和NADPH組成Trx系統(tǒng),具有清除活性氧及還原二硫鍵的功能,維持細胞氧化還原穩(wěn)態(tài),其抗氧化過程見圖5。Trx具有保守催化部位（-Cys-Gly-Pro-Cys-）,經(jīng)過可逆的氧化作用形成半胱氨酸二硫化物（Trx-S2）,通過還原物轉(zhuǎn)變成含二硫化物的底物（X-S2）,氧化型Trx通過TrxR被還原成半胱氨酸巰基化合物﹝Trx-（SH）2﹞形式,還原型Trx可以催化許多含有二硫鍵的蛋白質(zhì)的還原反應[17]。

圖5 硫氧還蛋白系統(tǒng)抗氧化過程圖解Fig.5 The scheme o f antioxidant process o f thioredoxin system

2.2 Grx和Trx與細胞凋亡

Lee等[18]研究證明,Grx能與細胞凋亡信號調(diào)控激酶1（apoptosis signal-egulating kinase 1, ASK 1）相連,抑制ASK 1的活性,并且這種相互作用依賴于Grx的氧化還原活性。當ASK 1與還原型的Grx1結合時,ASK 1無活性,而氧化型的Grx1會導致ASK 1的釋放而啟動細胞凋亡。此外,G rx也可以通過核因子-κB（NF-κB）途徑,抑制神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺（DA）對細胞氧化應激損傷所介導的凋亡。ASK 1是通過線粒體通路誘導凋亡,而Trx是ASK 1的直接抑制劑,Trx能直接結合到ASK 1的N端,形成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復合物,從而抑制了ASK 1的活性以及ASK 1依賴的凋亡[19],其調(diào)控過程如圖6所示。

圖6 硫氧還蛋白抑制細胞凋亡機制Fig.6 M echanism of inhibition apop tosis o f thioredoxin

2.3 Grx和Trx與消化道疾病

消化道既是動物體內(nèi)物質(zhì)代謝和能量代謝非常旺盛的系統(tǒng),又是動物體內(nèi)最大的內(nèi)分泌和免疫器官。胃腸道的結構整體性、氧化還原狀態(tài)、微生物菌群和酶系的平衡狀態(tài)是保證其正常生理功能的重要因素[20]。由于活性氧族（ROS）引起機體氧化應激,動物消化道器官與腸道黏膜極易遭受損傷,腸內(nèi)容物滲透壓升高,腸道脫水,引起腹瀉,嚴重時導致炎癥性腸道疾病。正常情況下,機體細胞內(nèi)的酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)的抗氧化作用可清除ROS,使機體ROS的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)[21]。Grx和Trx分別是抗氧化酶系統(tǒng)和抗氧化非酶系統(tǒng)的成員,在酶促與非酶促2個體系中發(fā)揮著重要的生物學作用,有效地維持消化道健康,預防疾病的發(fā)生。

2.4 Grx和Trx與機體免疫

在氧化應激狀態(tài)下,為了清除多余的自由基,細胞內(nèi)形成了大量的防御機制[22]。免疫系統(tǒng)在體內(nèi)起著應答、防御和監(jiān)視的功能,由于這一特殊地位,使其能對機體的抗氧化應激發(fā)揮著關鍵性的作用。氧化應激時,動物機體首先將無暇抵御各種細菌、真菌、病毒、寄生蟲和腫瘤細胞的侵襲,易發(fā)生各種流行性疾病[23]。其次,在氧化應激狀態(tài)下,免疫細胞受到破壞,然后凋亡而失去功能。Grx和Trx在酶促與非酶促2個體系中通過清除ROS,能夠有效地發(fā)揮抗氧化應激作用,控制細胞凋亡,提高機體的整體免疫力,在機體內(nèi)有效地保護免疫器官和組織,在防止免疫細胞的凋亡中發(fā)揮著重要生物學作用。

3 展 望

目前對動物抗氧化應激的研究大多數(shù)都是以飼料添加劑為切入點。在飼料中添加適量的抗氧化物質(zhì)（如GSH、維生素C、銅蛋白、硒、硒蛋白和丙氨酰谷氨酰胺等）均可提高機體的抗氧化能力,緩解氧化應激。但這些抗氧化物質(zhì)均屬于添加劑,量多或量少都有產(chǎn)生副作用的可能。Grx和Trx是在人類醫(yī)學上關于抗氧化研究比較熱門的2個功能蛋白,具有清除機體內(nèi)ROS和控制細胞凋亡的生物學作用,但對其抗氧化作用的研究都是分別進行的。在有關動物的抗氧化應激研究文獻中,尚未見到有關Grx和Trx共同發(fā)揮抗氧化生物作用的研究報道。因此,Grx和Trx對動物抗氧化應激的研究的重點將有以下幾個方面:1）在動物抗氧化應激系統(tǒng)中,抗氧化酶系統(tǒng)和抗氧化非酶系統(tǒng)的協(xié)調(diào)關系的研究;2） Grx和Trx在抗氧化酶系統(tǒng)和抗氧化非酶系統(tǒng)中的作用以及分子表達調(diào)控的相互關系;3）環(huán)境因素（如紫外線、高壓低氧和溫度等）和微量養(yǎng)分（如硒、鐵和維生素等）與Grx和Trx表達的分子調(diào)控的關系。以上這幾個方面將是動物抗氧化應激研究的熱點,也必將會為Grx和Trx在動物生產(chǎn)中的應用提供理論依據(jù)。

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*Correspond ing au thor,p rofessor,E-m ail:rongfug@163.com

（編輯 菅景穎）